Methodenartikel

Een verbeterde techniek voor trimethylaminedetectie in diergeneesmiddelen door Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65291

⸱

10 maart 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd, 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Shimadzu (China) Co., Ltd

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Hier wordt een headspace gaschromatografie-tandem quadrupool massaspectrometrie (HS-GC-MS/MS) methode beschreven die geschikt is voor de bepaling van trimethylamine (TMA) in diergeneesmiddelen. Het protocol omvat monstervoorbehandeling, headspace-behandeling, analyseomstandigheden, methodologische validatie en de bepaling van TMA in geneesmiddelen van dierlijke oorsprong.

Samenvatting

Diergeneesmiddelen hebben onderscheidende kenmerken en significante genezende effecten, maar de meeste hebben een duidelijke visgeur, wat resulteert in de slechte naleving van klinische patiënten. Trimethylamine (TMA) is een van de belangrijkste visgeurcomponenten in de diergeneeskunde. Het is moeilijk om TMA nauwkeurig te identificeren met behulp van de bestaande detectiemethode vanwege de verhoogde druk in de headspace-injectieflacon veroorzaakt door de snelle zuur-basereactie na de toevoeging van loog, waardoor TMA uit de headspace-injectieflacon ontsnapt, waardoor de onderzoeksvoortgang van de visgeur van dierlijke medicijnen wordt vertraagd. In deze studie stelden we een gecontroleerde detectiemethode voor die een paraffinelaag introduceerde als isolatielaag tussen zuur en loog. De snelheid van TMA-productie kan effectief worden gecontroleerd door de paraffinelaag langzaam vloeibaar te maken door middel van thermostatische ovenverwarming. Deze methode toonde bevredigende lineariteit, precisie-experimenten en terugvorderingen met een goede reproduceerbaarheid en hoge gevoeligheid. Het bood technische ondersteuning voor de deodorisatie van dierlijke medicijnen.

Inleiding

De behandeling van ziekten bij de mens door gebruik te maken van producten die zijn afgeleid van dierlijke delen en/of hun bijproducten (hier aangeduid als geneesmiddelen van dierlijke oorsprong) krijgt steeds meer aandacht. Ze spelen een belangrijke rol bij de behandeling van kanker, hart- en vaatziekten, levercirrose, mastitis en andere ziekten, met de voordelen van een sterk effect, kleine dosering en significante en specifieke klinische werkzaamheid. Dierlijke geneesmiddelen hebben echter over het algemeen een prominente visgeur, die de therapietrouw van patiënten sterk beïnvloedt en vooral ongunstig zijn voor kinderen 1,2. De visgeur komt voornamelijk van de eiwitten, aminozuren, vetten en andere stoffen in het geneesmiddel, die worden afgebroken door vetzuuroxidatie, aminozuurafbraak en andere manieren om een verscheidenheid aan stoffen te produceren met een visachtige geur 2,3,4. Onder hen is trimethylamine (TMA) een vluchtig gas met een visachtige geur die veel voorkomt in rottende of rotte dierlijke voedingsmiddelen5.

Tot nu toe werden gaschromatografie (GC), vloeistofchromatografie (LC), ionchromatografie, spectrofotometrie, vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) en sensormethoden vaak gebruikt om TMA in het milieu, voedsel en urine te detecteren 6,7,8,9. Gezien de lage verontreiniging van de GC-kolom en het injectiesysteem, evenals de hoge gevoeligheid, reproduceerbaarheid en lage detectiegrens (0,1-1 mg/kg), werd de voorkeur gegeven aan de headspace gaschromatografie-massaspectrometrie (HS-GC-MS) methode voor voedsel- en biologische analyse8. Op dit moment heeft alleen China een nationale standaard voor TMA in voedsel vastgesteld en HS-GC-MS is de eerste methode in de GB5009.179-2016-standaard10. Daarom werd de bovenstaande HS-GC-MS-methode gekozen om TMA te detecteren in diergeneesmiddelen. In het vroege stadium ontdekte onze onderzoeksgroep dat de HS-GC-MS-detectiestandaard voor TMA in voedsel de visgeur in verschillende van dieren afkomstige geneesmiddelen kon detecteren. In combinatie met de resultaten van de studies11,12 kon worden bewezen dat TMA de gemeenschappelijke sleutelstof is van visgeur in diergeneesmiddelen. Er werd echter vastgesteld dat de reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten slecht was en dat er problemen waren zoals TMA-ontsnapping en slechte stabiliteit, die niet door de methodologie konden worden geverifieerd. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat het loog in de headspace-injectieflacon werd geïnjecteerd en de snelle zuur-basereactie leidde tot verhoogde druk in de injectieflacon, waardoor TMA uit de injectieporie ontsnapte, waardoor de stabiele en nauwkeurige detectie van TMA werd voorkomen. Daarom stelde deze studie een verbeterde headspace gaschromatografie-tandem quadrupool massaspectrometrie (HS-GC-MS/MS) detectiemethode voor om deze problemen aan te pakken.

Het protocol verbetert de monstervoorbehandeling door de zuur-base reactanten in de voorbehandeling te scheiden met behulp van vaste paraffine, een goed vast-vloeibaar faseveranderingsmateriaal. Terwijl de paraffine langzaam vloeibaar werd met de temperatuurstijging van de thermostatische oven, werd TMA ook langzaam vrijgegeven in de afgesloten headspace-injectieflacon, waardoor de drukverhoging veroorzaakt door de gewelddadige en snelle zuur-basereactie werd vermeden en een stabiele en nauwkeurige TMA-detectie werd gegarandeerd. Verder onderdrukte de headspace-injectie in combinatie met meervoudige reactiemonitoring (MRM) in GC-MS / MS effectief matrix chemische interferentie en zorgde voor de betrouwbaarheid van de resultaten. De resultaten van de methodologische validatie bewezen dat de lineariteit, precisietest en herstelsnelheid van de verbeterde detectiemethode aan de vereisten konden voldoen, met een goede reproduceerbaarheid en hoge gevoeligheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Zie tabel 1 voor informatie over de medicinale materialen van Pheretima, Periplaneta americana en Hirudo. Ze werden geïdentificeerd door Prof. Xu Runchun, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, als de gedroogde lichamen van Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. en Whitmania pigra Whitman.

1. Extractie van specimens

  1. Pheretima, Periplaneta americana en Hirudo verpletteren met een kruidenmolen (zie materiaaltabel), zeef het medicinale poeder door nr. 2 (zeefopening: 0,8 mm) en nr. 4 (zeefopening: 0,25 mm) standaard medicijnzeven en verzamel het poeder tussen de twee zeven om het vereiste monsterpoeder te verkrijgen.
    OPMERKING: De Pheretima is luchtig na het pletten, dus het poeder hoeft niet te worden gezeefd.
  2. Neem 1 g poeder (nauwkeurig tot 0,001 g) in een plastic centrifugebuis van 50 ml, voeg 20 ml 5% trichloorazijnzuur (TCA) -oplossing toe (zie materiaaltabel) en homogeniseer bij 1.000 rmin-1 gedurende 1 minuut met een hogesnelheidsdispersiehomogenisator.
  3. Centrifugeer na homogenisatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 1.717 x g , voeg een beetje absorberend katoen toe aan de glazen trechter en filtreer het supernatant in een maatkolf van 50 ml.
  4. Herhaal het bovenstaande extractieproces tweemaal met 15 ml en 10 ml 5% TCA-oplossing. Combineer het filtraat en verdun het tot 50 ml met 5% TCA-oplossing.

2. Reagenspreparaat

  1. Bereid 20% natriumhydroxideoplossing: weeg 20 g natriumhydroxide af en gebruik gedeïoniseerd water om het volume in een maatkolf van 100 ml te fixeren.
  2. Bereid 5% TCA-oplossing voor: weeg 25 g TCA af en gebruik gedeïoniseerd water om het volume in een maatkolf van 500 ml te fixeren.

3. TMA standaard voorraadoplossing voorbereiding

  1. Bereid TMA-standaardvoorraadoplossing voor: weeg 0,0162 g TMA-hydrochloridestandaardmonster af, los het op in een 5% TCA-oplossing en fixeer het volume op 100 ml, gelijk aan de concentratie van 100 μg / ml TMA-standaardvoorraadoplossing. Bewaar het bij 4 °C.
  2. Bereid TMA-standaardgebruiksoplossing: neem een bepaald volume TMA-standaardstamoplossing en verdun deze stap voor stap met 5% TCA-oplossing tot concentraties van 0,1 μg / ml, 0, 5 μg / ml, 1 μg / ml, 2 μg / ml, 5 μg / ml en 10 μg / ml TMA-standaardoplossing.

4. Sample headspace verwerking

  1. Weeg nauwkeurig 2 ml natriumhydroxideoplossing en 0,5 g vaste paraffine (smeltpunt: 58-60 °C) af in een injectieflacon met 20 ml headspace (zie materiaaltabel).
  2. Plaats de injectieflacon met headspace gedurende ongeveer 30 minuten in een oven op 70 °C. De vaste paraffine smelt volledig.
  3. Haal het eruit en laat het afkoelen tot kamertemperatuur zodat de paraffine stolt. De gestolde paraffine zal natriumhydroxide afdichten.
  4. Neem 2 ml van elke monsterextractieoplossing en leg deze op de paraffinelaag, druk op de dop en sluit af.
  5. Plaats de verzegelde injectieflacon met kopruimte op de machine (zie materiaaltabel) voor meting.

5. Instelling van de HS-GC-MS/MS-analysevoorwaarden

  1. Zie tabel 2 voor de omstandigheden van de hoofdruimte en de GC-MS-omstandigheden.
  2. Zie tabel 3 voor ioneninformatie.

6. Standaard curve tekening

  1. Raadpleeg de verwerking van de kopruimte van het monster in stap 4.1-4.3 om de injectieflacon met de kopruimte met loog en paraffineafdichtingslaag voor te bereiden.
  2. Zuig 2 ml van 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/ml, 5 μg/ml en 10 μg/ml TMA-standaardoplossing af in een injectieflacon met hoofdruimte van 20 ml, sluit de dop af en meet op de machine.

7. Precisietest

  1. Raadpleeg de verwerking van de kopruimte van het monster in stap 4.1-4.3 om de injectieflacon met loog en de paraffineafdichtingslaag voor te bereiden.
  2. Zuig 2 ml 0,1 μg/ml TMA-standaardoplossing aan in een injectieflacon met hoofdruimte van 20 ml en sluit de dop af. Voer zes parallelle tests uit in de machine volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).

8. Experiment met herstelpercentage

  1. Neem een partij Pheretima, Periplaneta Americana en Hirudo (S02, S05, S07; Tabel 1) als de representatieve geneesmiddelen voor het herstelpercentage-experiment.
  2. Neem verschillende partijen monsterpoeder (S02, S05, S07) en bak ze in een oven op 50 °C gedurende 72 uur totdat er geen TMA wordt gedetecteerd.
  3. Raadpleeg de monstervoorbereidingsmethode in rubrieken 4-6 om het gehalte aan TMA in gebakken medicijnpoeder te detecteren.
  4. Neem 1 g gebakken poeder (nauwkeurig tot 0,001 g), doe het in een plastic centrifugebuis van 50 ml en voeg 50 μl TMA-standaardoplossing toe.
    OPMERKING: De concentratie van TMA-standaardoplossing is 100 μg/ml, 1000 μg/ml en 10000 μg/ml.
  5. Voeg 20 ml 5% TCA-oplossing toe en homogeniseer bij 1000 rmin-1 gedurende 1 min.
  6. Na homogenisatie, centrifugeer op 1717 x g gedurende 5 minuten, voeg een beetje absorberend katoen toe in de glazen trechter en filtreer het supernatant in een maatkolf van 50 ml.
  7. Herhaal het bovenstaande extractieproces tweemaal met 15 ml en 10 ml 5% TCA-oplossing; combineer het filtraat en verdun het tot 50 ml met 5% TCA-oplossing.

9. Bepaling van de detectiegrenzen (LOD) en kwantificering (LOQ)

  1. Bepaal de LOD aan de hand van de overeenkomstige concentratie wanneer de signaal-ruisverhouding (S/N) = 3.
  2. Bepaal de LOQ aan de hand van de overeenkomstige concentratie wanneer de S/N = 10.

10. Bepaling van het TMA-gehalte van het monster

  1. Neem ongeveer 1 g fijn poeder van respectievelijk Pheretima, Periplaneta americana en Hirudo , extraheer het monster volgens de bovenstaande methode en bepaal het op de machine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Schematische schema's van het voorbewerkingsprincipe en de werking van dit protocol zijn weergegeven in respectievelijk figuur 1 en figuur 2. De piektijd van TMA was 2,3 min, met een scherpe piekvorm en geen interferentie van andere onzuiverheden (figuur 3). Door het lineaire bereik van 0,1-10 μg/ml TMA-standaardoplossing te meten, met TMA-concentratie als abscis en piekgebied als ordinaat, werd een standaardcurve getekend. De linea...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dierlijke geneesmiddelen komen uit het hele lichaam, organen of weefsels, fysiologische of pathologische producten, uitscheidingen of afscheidingen en verwerkte producten van dieren. TMA is een belangrijke bron van visgeur in geneesmiddelen van dierlijke oorsprong; het is een typische stinkende stof met een zeer lage reukdrempel (0,000032 × 10-6 V/V) en een sterke visgeur13. Op dit moment kan de veelgebruikte HS-GC-MS-methode TMA in diergeneesmiddelen niet stabiel en nauwkeurig detecter...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82173991) en het Sichuan Science and Technology Program (2022YFS0442).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CentrifugeBeckman Coulter Trading (China) Co.SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinderZhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical FactoryHX-200K
Convection ovenSanyo Electric Co., LtdMOV-112F
Decapper voor 20 mm aluminiumdoppenANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) IncV1750004
Elektronische weegschaalShimadzu Corporation JapanAUW220D
Gaschromatografie massaspectrometrieShimadzu Corporation JapanTQ-8050 NX
Headspace-flesANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc25760200
HomogenisatorShanghai biaomo FactoryFJ200-SH
Voorassemberde dopANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) IncL4150050
StaalzeefZhenxing Sieve Factory/
SH-Vluchtige amineChengdu Meimelte Technology Co., Ltd227-3626-01
NatriumhydroxideChengdu Chron Chemicals Co., Ltd2022101401
Vaste paraffinewasShanghai Hualing Kangfu apparatus factory20221112
TrichloroazijnzuurChengdu Chron Chemicals Co., Ltd2022102001
Trimethylamine hydrochlorideChengdu Aifa Biotechnology Co., LtdAF22022108
Ultrapuur watersysteemSichuan Youpu Ultrapure Technology Co., LtdUPR-11-5T

Referenties

  1. Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
  2. Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
  3. Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
  4. Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50(2017).
  5. Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
  6. Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318(2022).
  7. Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
  8. Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062(2020).
  9. Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
  10. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. GB 5009. 179-2016. , 12(2016).
  11. Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
  12. Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
  13. Yoshiharu, I. Odor olfactory measurement. , Japan Association on Odor Environment. Tokyo. (2004).
  14. Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum


Formal Correction: Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 11/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. The Authors section was updated from:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
Haozhou Huang2
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin3
Xiaoming Bao4
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4Shimadzu (China) Co., Ltd

to:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
JiaBao Liao2
Haozhou Huang3
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin4
Xiaoming Bao5
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Shimadzu (China) Co., Ltd

Trefwoorden

Analyse van visgeurParaffine isolatielaagVoorbehandeling van monstersTrichloorazijnzuurextractieExperiment naar herstelpercentageAnalyse van kruidengeneesmiddelen

Gerelateerde artikelen