Porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie

Samenvatting

Het protocol beschrijft hoe op porfyrine gebaseerde compensatieparels voor flowcytometrie worden bereid door de reactie van amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels met de porfyrine TCPP en het amidekoppelingsreagens EDC. Een filtratieprocedure wordt gebruikt om de deeltjesbijproducten te verminderen.

Samenvatting

Flowcytometrie kan snel diverse celpopulaties karakteriseren en kwantificeren op basis van fluorescentiemetingen. De cellen worden eerst gekleurd met een of meer fluorescerende reagentia, elk gefunctionaliseerd met een ander fluorescerend molecuul (fluorofoor) dat selectief aan cellen bindt op basis van hun fenotypische kenmerken, zoals antigeenexpressie van het celoppervlak. De intensiteit van fluorescentie van elk reagens gebonden aan cellen kan worden gemeten op de flowcytometer met behulp van kanalen die een bepaald golflengtebereik detecteren. Wanneer meerdere fluoroforen worden gebruikt, loopt het licht van individuele fluoroforen vaak over in ongewenste detectiekanalen, wat een correctie van de fluorescentie-intensiteitsgegevens vereist in een proces dat compensatie wordt genoemd.

Compensatiecontroledeeltjes, meestal polymeerparels gebonden aan een enkele fluorofoor, zijn nodig voor elke fluorofoor die wordt gebruikt in een celetiketteringsexperiment. Gegevens van compensatiedeeltjes van de flowcytometer worden gebruikt om een correctie toe te passen op de fluorescentie-intensiteitsmetingen. Dit protocol beschrijft de bereiding en zuivering van polystyreencompensatieparels covalent gefunctionaliseerd met het fluorescerende reagens meso-tetra(4-carboxyfenyl) porfine (TCPP) en hun toepassing in flowcytometriecompensatie. In dit werk werden amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels behandeld met TCPP en het amidekoppelingsreagens EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride) bij pH 6 en bij kamertemperatuur gedurende 16 uur met roeren. De TCPP-kralen werden geïsoleerd door centrifugeren en geresuspendeerd in een pH 7-buffer voor opslag. TCPP-gerelateerde deeltjes werden waargenomen als bijproduct. Het aantal van deze deeltjes kan worden verminderd met behulp van een optioneel filtratieprotocol. De resulterende TCPP-kralen werden met succes gebruikt op een flowcytometer voor compensatie in experimenten met menselijke sputumcellen gelabeld met meerdere fluoroforen. De TCPP-kralen bleken stabiel na 300 dagen bewaren in een koelkast.

Inleiding

Porfyrines zijn al vele jaren van belang op biomedisch gebied vanwege hun fluorescentie en tumorgerichte eigenschappen ^1,2,3. Therapeutische toepassingen zoals fotodynamische therapie (PDT) en sonodynamische therapie (SDT) omvatten de systemische toediening van een porfyrine aan een kankerpatiënt, de accumulatie van het geneesmiddel in de tumor en de gelokaliseerde blootstelling van de tumor aan een laserlicht van een specifieke golflengte of echografie. De blootstelling aan laserlicht of echografie leidt tot het genereren van reactieve zuurstofsoorten door de porfyrine en de....

Protocol

Alle procedures moeten worden uitgevoerd met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.

1. Bereiding van de TCPP-stamoplossing, 1,0 mg/ml

OPMERKING: Dit kan maandelijks worden voorbereid.

1. Weeg met behulp van een analytische balans, spatel en weegpapier 49,0-50,9 mg TCPP. Rond het gewicht af op 1/10 van een milligram. Zet de gemeten hoeveelheid TCPP opzij beschermd tegen licht.
   OPMERKING: Gebruik een statisch pistool als de gewichtsmeting onstabiel is.
2. Bepaal de vereiste hoeveelheden gezuiverd water en isopropanol (IPA) uit tabel 1 op basis van ....

Resultaten

Dit protocol voor de TCPP-etikettering van kralen is relatief snel en efficiënt. Figuur 1 toont een representatieve uitkomst van het TCPP-kraaletiketteringsproces zoals bepaald door flowcytometrie. Figuur 1A toont het gestandaardiseerde profiel van regenboogkralen, zoals gedetecteerd in het juiste kanaal voor het detecteren van TCPP. Deze kralen dienen als QC voor de standaardisatie van de laserspanningen voor de detectie van TCPP door de flowcytometer.

Discussie

Ondanks de vele toepassingen van porfyrines bij kankerdiagnose en -therapieën², is er beperkte literatuur over hun potentiële gebruik als flowcytometrisch reagens voor de identificatie van kankerachtige versus niet-kankerachtige celpopulaties in primaire menselijke weefsels^24,25,26. Ons onderzoek naar de flowcytometrische analyse van humaan sputum^{24,27<.......}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			met passende rotor
Disposable polystyrene bottle met dop, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS Nr:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glas coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glasvezel spuitfilters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glas microscoopglazen, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanische pipet, 1 kanaal, 100-1000 uL met tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS Nr:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscoop met DP73 camera en 40X objectief met cellSens software	Olympus		of soortgelijk
Pasteur pipetten, glas, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipet controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Kunststof spuit, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (niet-functioneel), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conisch	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, ronde bodem	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serologische pipetten, wegwerpbaar - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serologische pipetten, wegwerpbaar - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS Nr:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyfenyl)porfirine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS Nr:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (of soortgelijk)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365