Analyse van de mitochondriale dichtheid en longitudinale verdeling in levende skeletspiervezels van ratten door confocale microscopie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om veranderingen in mitochondriale dichtheid en longitudinale distributie te analyseren door middel van beeldvorming van levende skeletspieren met behulp van confocale microscopie voor het scannen van mitochondriale netwerken.

Samenvatting

Het mitochondrion is een organel dat kan worden uitgerekt, gefragmenteerd en gerenoveerd volgens de metabolische vereisten van de cellen. Door de hermodellering van het mitochondriale netwerk kunnen gezonde mitochondriën voldoen aan de cellulaire eisen; Het verlies van deze capaciteit is echter in verband gebracht met de ontwikkeling of progressie van verschillende pathologieën. In skeletspieren worden veranderingen in de mitochondriale dichtheid en distributie waargenomen bij fysiologische en pathologische aandoeningen zoals inspanning, veroudering en obesitas. Daarom kan de studie van het mitochondriale netwerk een beter begrip geven van mechanismen die verband houden met die aandoeningen.

Hier wordt een protocol beschreven voor mitochondriën beeldvorming van levende skeletspiervezels van ratten. Vezels worden handmatig ontleed in een ontspannende oplossing en geïncubeerd met een fluorescerende beeldvormingsindicator van mitochondriën (tetramethylrhodamine-ethylester, TMRE). Het mitochondriënsignaal wordt geregistreerd door confocale microscopie met behulp van de XYZ-scanmodus om confocale beelden van het intermyofibrillaire mitochondriale (IMF) netwerk te verkrijgen. Daarna worden de confocale beelden verwerkt door middel van drempels en binarisatie. Het gebinariseerde confocale beeld is verantwoordelijk voor de positieve pixels voor mitochondriën, die vervolgens worden geteld om de mitochondriale dichtheid te verkrijgen. Het mitochondriale netwerk in skeletspieren wordt gekenmerkt door een hoge dichtheid van de IMF-populatie, die een periodieke longitudinale verdeling heeft die vergelijkbaar is met die van T-tubuli (TT). De Fast Fourier Transform (FFT) is een standaard analysetechniek die wordt uitgevoerd om de verdeling van TT te evalueren en die het mogelijk maakt om de distributiefrequentie en het niveau van hun organisatie te vinden. In dit protocol wordt de implementatie van het FFT-algoritme beschreven voor de analyse van de longitudinale mitochondriale verdeling in skeletspieren.

Inleiding

Mitochondriën vormen zeer dynamische netwerken die voornamelijk worden gereguleerd door het evenwicht tussen de verlenging (fusie) en fragmentatie (splijting)1,2, die worden gemoduleerd door de expressie en activiteit van eiwitten zoals Mitofusine ¹ en ² (Mfn1 en Mfn2), en optische eiwitatrofie 1 (Opa1), die de fusie van het buitenste mitochondriale membraan en het binnenmembraan reguleren^, respectievelijk ^1,2. Dynamin-gerelateerd eiwit (Drp1) reguleert voornamelijk de mitochondriale splijting wanneer het wordt gefosforyleerd in de Ser616³.

In skeletspieren is het goed vastgesteld dat het mitochondriale netwerk is gerangschikt in structureel goed gedefinieerde subpopulaties op basis van hun nabijheid tot verschillende celregio's (myofibrillen, sarcolemma en kernen)^4,5. De mitochondriën die zich direct onder het sarcolemma bevinden, worden subsarcolemmale mitochondriën (SSM) genoemd, die tussen de contractiele filamenten worden intermyofibrillaire mitochondriën (IMF) genoemd en de mitochondriale subpopulatie rond de kernen wordt perinucleair mitochondriënnetwerk (PMN) genoemd. Bovendien is gesuggereerd dat deze mitochondriale subpopulaties regiospecifieke functies hebben en metabolisch gespecialiseerd zijn ^4,5.

Het behoud van de homeostase van cellulaire energie, die metabole en contractiele functie mogelijk maakt, hangt in grote mate af van de interactie en communicatie op specifieke plaatsen via het mitochondriale netwerk (bijv. IMF- en SSM-interactie)^4,6. Naast netwerkinteracties van mitochondriën kan het mitochondrion ook interageren met andere organellen, waardoor structurele en functionele complexen worden gevormd. In dit verband is aangetoond dat IMF kan worden gelokaliseerd naast het sarcoplasmatisch reticulum (SR) en in de nabijheid van de Ca²⁺ release units (CRU), gevormd door de transversale tubuli (TT)⁷. Dit feit is relevant vanwege de rol van mitochondriale^{Ca 2+} opname bij het reguleren van ATP-synthese en apoptose. Onlangs is ook een mogelijke rol bij het reguleren van cytosolische^{Ca 2+-}transiënten gesuggereerd⁸.

TT zijn invaginaties van sarcolemma die een periodieke verdeling hebben langs de lengteas van cardiomyocyten en skeletspiervezels ^9,10, vergelijkbaar met de IMF-verdeling 5. Veranderingen in de verdeling van TT hebben belangrijke fysiologische implicaties, gezien hun rol in de contractiele functie. Deze veranderingen zijn echter voornamelijk geëvalueerd in cardiomyocyten. Met behulp van Fast Fourier Transform (FFT)-analyse kunnen periodieke signalen van het afstandsdomein worden omgezet in het frequentiedomein, wat resulteert in een FFT-spectrum dat de frequentie en de regelmaat van het signaal 11,12,13 aangeeft. Hoewel er aanwijzingen zijn dat de organisatie van het mitochondriale netwerk in skeletspiervezels essentieel is voor aanpassing aan verschillende metabole omstandigheden, zoals tijdens regeneratie na spierblessure^14,15, worden de meeste analyses kwalitatief uitgevoerd.

Bovendien, gezien het feit dat mitochondriale disfunctie in verband is gebracht met verschillende skeletspiergerelateerde (bijv. atrofie in onbruik)² en niet-spierziekten, met name stofwisselingsziekten, en het daarmee gepaard gaande verlies van spiermassa (d.w.z. atrofie)¹⁶, is de kwantitatieve evaluatie van het mitochondriale netwerk en de verdeling in skeletspieren relevant. Onlangs is een significant verschil in de longitudinale verdeling van mitochondriën van gastrocnemius-spiervezels tussen een zwaarlijvige groep (Ob; Zucker fa /fa rats), en een lean groep (Lean; Zucker +/+ ratten) werd geïdentificeerd via FFT¹⁷. Deze studie toonde het nut van de FFT aan bij het analyseren van de mitochondriale verdeling. Daarom presenteert dit protocol een methodologie om mitochondriën in levende skeletspiervezels te bestuderen op basis van beelden verkregen door fluorescentie confocale microscopie. De mitochondriale dichtheid wordt gekwantificeerd door achtergronddrempels, en de analyse van de longitudinale mitochondriale verdeling door FFT-analyse wordt ook beschreven. In figuur 1 wordt een werkstroomschema weergegeven.

Protocol

Alle procedures voor dierproeven werden geëvalueerd en goedgekeurd door het Animal Use and Care Committee (CICUAL) van Tecnologico de Monterrey (Protocol 2019-007). Voor dit onderzoek werden mannelijke Zucker (+/+ en fa/fa) ratten van 12 tot 13 weken gebruikt. De dieren werden gehouden in standaard houderijomstandigheden (12 uur/12 uur licht/donkercyclus, 40-60% luchtvochtigheid) en hadden toegang tot voedsel (standaard rattenvoer) en water ad libitum.

1. Samenstelling van de oplossing

1. Bereid verse Relax-oplossing door de in tabel 1 getoonde componenten te mengen. Pas de pH aan tot 7,3 met behulp van natriumhydroxide (NaOH).
2. Bereken de vrije calciumconcentratie in de Relax-oplossing met behulp van een simulatieprogramma voor het bepalen van de vrije metaalconcentratie.
3. Bereid een voorraad tetramethylrhodaminemethylester (TMRE) van 5 mM in dimethylsulfoxide (DMSO) en vervolgens een verdunning van 0,1 mM in DMSO.

2. Dissectie van de gastrocnemius-spiervezelbundels

1. Plaats het dier in de inductiekamer en sluit het deksel. Zet de zuurstofbron aan, stel het gasdebiet in op 0.5 l/min en stel de verdamper in op 4% sevofluraan om anesthesie te induceren.
2. Zodra de rat slaapt, plaatst u hem buiten de kamer in rugligging terwijl u de anesthesie behoudt. Knijp in de teen of staart om het gebrek aan reflexen te verifiëren.
3. Knip met een schaar door de huid en spieren van de buik. Snijd vervolgens de borstkas door om toegang te krijgen tot het hart.
4. Om een cardiectomie uit te voeren, pakt u het hart uit de bovenste aderen en slagaders met een tang vast en snijdt u de bloedvaten door met een schaar. Verwijder het hart.
5. Desinfecteer direct na euthanasie de achterpoot met ethanol en scheer deze met een scheermachine.
6. Houd de achtervoet vast en maak met een schaar een incisie door de huid ter hoogte van de achillespees.
7. Knip de achterpoot af met een schaar ter hoogte van het proximale scheenbeen. Breng het over naar een petrischaal van 60 mm met 3 ml ijskoude Relax-oplossing in een dorsale positie. Bedek het met voldoende oplossing om uitdroging van de spieren te voorkomen.
8. Identificeer de achillespees, til deze voorzichtig op met een tang en ontleed de spieren weg van het bot met een irisschaar. Gebruik een stereomicroscoop vanaf deze stap vanaf de dissectie.
9. Identificeer en scheid de hele gastrocnemius-spier, de belangrijkste bulk aan de achterkant van de achterpoot.
10. Ontleed en gooi het bind- en vetweefsel rond de spier weg met een pincet met een fijne punt. Breng de laterale kop van de spier over in een nieuwe petrischaal met ijskoude Relax-oplossing (zie figuur 2A).
11. Houd de spier voorzichtig vast met een pincet aan het ene uiteinde en scheid deze voorzichtig in bundels met een microschaar. Manipuleer bundels altijd door ze voorzichtig aan één uiteinde vast te houden met een pincet.
    OPMERKING: Bundels zijn ongeveer 10 mm lang en 2 mm breed.
12. Breng de vezelbundels over in een nieuwe petrischaal met 2 ml ijskoude Relax-oplossing. Selecteer alleen degenen die er glad uitzien, van het ene uiteinde naar het andere compleet zijn en niet zijn ingekort (Figuur 2B).

3. Verwerving van mitochondriën in skeletspieren door confocale microscopie

1. Incubeer de vezels in 2,5 × ^10-4 mM TMRE in Relax-oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   NOTITIE: Met de aanbevolen werkconcentraties van TMRE wordt verwacht dat het zich in een niet-uitdovende modus bevindt. Bescherm vanaf dit punt tegen blootstelling aan licht.
2. Tijdens de incubatietijd:
   1. Open de standaardsoftware van de confocale microscoop, selecteer het configuratiekader en selecteer in het dialoogvenster voor hardwareconfiguratie laser en vink de optie HeNe 543 aan.
   2. Selecteer in het acquisitieframework het dialoogvenster Acquisitie en selecteer in de acquisitiemodus het deelvenster XYZ.
   3. Selecteer in het dialoogvenster XY de indeling 512 x 512, de snelheid van 400 Hz en controleer het pinholepaneel. Selecteer in het dialoogvenster Weergegeven gaatje AU voor eenheid en voeg een waarde van 3 Luchtig toe voor het gaatje.
      OPMERKING: Overweeg om de gaatjesgrootte te verkleinen die het dichtst bij het 1 Airy-optimale criterium ligt, als een adequaat fluorescentiesignaal behouden blijft.
   4. Selecteer in het dialoogvenster Instellingen voor straalpad een onderdompelingsobjectief voor water van 20x en een numerieke apertuur (NA) van 0,7 (20x/0,7 IMM) en selecteer het emissiegolflengtevenster van 576-700 nm. Selecteer DD488/543 en 15% van het laservermogen voor de 543-laser.
      NOTITIE: Een objectieflens voor het scannen van live beeldvorming wordt sterk aanbevolen (indien beschikbaar). Omdat een vergelijkbare brekingsindex van het immersiemedium en het incubatiemedium wordt bereikt.
3. Vervang na 20 minuten incubatie het incubatiemedium twee keer. Zorg ervoor dat de confocale beelden binnen 20-30 minuten na incubatie worden verkregen.
4. Bereid de opnamekamer voor met een 0,15 mm dekglaasje van borosilicaatglas.
   NOTITIE: Selecteer de dikte van het dekglaasje op basis van de beschikbare opnamekamer, aangezien de dikte meestal varieert van 0.15 tot 0.22 mm voor optimale prestaties.
5. Voeg 200 μL Relax-oplossing toe aan de opnamekamer en breng de vezelbundels over.
6. Gebruik in de confocale microscoop de helderveldmodus om levensvatbare vezels te identificeren voor de fluorescerende opname van mitochondriën. Levensvatbare vezels zijn compleet, niet samengetrokken en hebben een intact streeppatroon.
7. Scheid de vezelbundels van elkaar en lijn ze uit met een pincet. Selecteer degene die zich het dichtst bij het dekglaasje bevinden.
8. Scan de fluorescentie met de live-knop om de versterking en offset in de console van het Configuratiescherm aan te passen en houd rekening met het volgende:
   1. Selecteer lage fluorescerende intensiteitswaarden voor een achtergrond van bijna 0 willekeurige eenheden (A.U.).
   2. Selecteer een versterkingsniveau tussen 100 en 200 A.U. om verzadiging van het registratiesysteem te voorkomen. Noteer daarom niet de hoogste fluorescentieniveaus.
   3. Selecteer een pixelgrootte van 150-190 nm om de volledige breedte van de vezel te verkrijgen en pas de zoomfactor aan in het XY-dialoogvenster .
      OPMERKING: Overweeg om de pixelgrootte dichter bij de Nyquist-criteria (90 nm) te gebruiken, waardoor de volledige breedte van de vezel kan worden gescand.
9. Pas in het dialoogvenster Z-stapel de Z-afstand aan om het fluorescentiesignaal te verkrijgen, beginnend bij een vezeldiepte van 15 μm (beginknop) tot 22 μm (eindknop). Selecteer 3 μm als de Z-stapgrootte.
10. Klik op de Start knop om de confocale beelden te verkrijgen. Verkrijg een Z-stack die bestaat uit drie confocale beelden die zijn verkregen op een diepte van 15, 18 en 21 μm.

4. Analyse van de mitochondriale dichtheid

1. Open in het open-sourceplatform voor biologische beeldanalyse¹⁸ het Z-stack-bestand en draai de afbeeldingen om de vezel horizontaal te plaatsen, zoals weergegeven in afbeelding 3B.
2. Selecteer willekeurig een rechthoekig interessegebied (ROI) dat het gebied omvat dat wordt ingenomen door de mitochondriën (ROI_mito). Selecteer ROI_{mito-grootten} van 65 tot 90 μm voor X. Voor Y hangt de grootte af van de vezelbreedte, waarbij de omtrek wordt vermeden.
3. Dupliceer de Z-stack met de geselecteerde ROI_mito en sla deze op als een nieuwe Z-stack (Mito-stack) in TIFF-formaat. Sla de ROI_mito-positie op die op de oorspronkelijke stack is geselecteerd met de ROI Manager-tool .
4. Bereken de drempel voor achtergrondaftrekking als volgt:
   1. Gebruik de sneltoets command+shift+t om het dialoogvenster Drempel te openen.
   2. Selecteer het drempelalgoritme Otsu |Zwart-wit | Donkere achtergrond optie. Merk op dat de afbeelding nu gebinariseerd is.
   3. Bekijk in het dialoogvenster Drempelwaarde het histogram van de fluorescentie-intensiteitsverdeling en de drempelwaarde die wordt weergegeven.
      OPMERKING: Mitochondriën-positieve pixels hebben fluorescentie-intensiteitswaarden die groter zijn dan de drempelwaarde en verschijnen als witte pixels in de binaire afbeelding.
   4. Pas de drempelwaarde toe op de binaire afbeeldingsstapel door Toepassen te selecteren. Selecteer in het weergegeven dialoogvenster Stapel converteren naar binair de opties Drempel berekenen voor elke afbeelding, Zwarte achtergrond, Nieuwe stapel maken en klik op OK.
5. Merk op dat een stapel met de drie binaire afbeeldingen wordt gegenereerd (BinDMito-stack). Sla het op in TIFF-formaat.
6. Bereken de mitochondriale dichtheid in de BinDMito-stack als volgt:
   1. Selecteer het menu Analyseren . Klik vervolgens op Histogram. Klik in het dialoogvenster Weergegeven histogram op Ja om alle afbeeldingen van de stapel op te nemen voor analyse.
   2. Klik in het dialoogvenster Histogram van stapel op Lijst om de histogramgegevens op te halen. Breng de histogramgegevens over naar een spreadsheet.
   3. Identificeer in een spreadsheet Mito-pixels met de waarde 255 . Bereken de mitochondriale dichtheid met behulp van vergelijking (1):
      Mitochondriale dichtheid = × 100 (1)
      Het totale aantal pixels wordt in het dialoogvenster Histogram aangeduid als N of berekend door in de spreadsheet het aantal pixels van het histogram bij elkaar op te tellen.
   4. Om het gebied te berekenen dat wordt ingenomen door mitochondriën (μm²), vermenigvuldigt u de Mito-pixels van de BinDMito-stack met de pixelgrootte.

5. Analyse van de mitochondriale verdeling door middel van Fast Fourier Transform

1. Open in het open-source platform voor biologische beeldanalyse de BinDMito-stack en teken een rechthoekige ROI van 256 pixels breed en 5 μm hoog. Lokaliseer een ROI in een centrale positie en een andere in een laterale positie, zoals weergegeven in figuur 4A,B.
2. Gebruik de ROI Manager-tool om de ROI's voor FFT-analyse te configureren en op te slaan.
   OPMERKING: Afhankelijk van de vereisten van de analyse kunnen andere ROI's op verschillende posities worden geselecteerd en kunnen hun groottes worden gewijzigd. Desalniettemin moet de breedte gelijk zijn aan 2ⁿ pixels om FFT uit te voeren (bijv. 128, 256, 512 pixels).
3. Verkrijg het plotprofiel van de ROI's met behulp van het snelkoppelingscommando + k en breng de gegevens over naar een spreadsheet.
4. Vul in de spreadsheet de B- en C-kolommen met de gegevens die zijn verkregen uit het plotprofiel. De B-kolom bevat de afstand in μm en de C-kolom de bijbehorende grijswaarde van de fluorescentie-intensiteit (A.U.).
5. De D-kolom komt overeen met de FFT-frequentie (gebeurtenis/μm), die als volgt wordt gevuld:
   1. Bereken de bemonsteringsfrequentie (Fs): Fs = 1/Δ d, waarbij Δd de afstandsstap is (de tweede waarde van B).
   2. Bereken de Δ Fs: Δ Fs= Fs/N, waarbij N het aantal datapunten van B is (256).
   3. Bereken de stopwaarde van de FFT-frequentie (S ): S = (N/2) ×ΔFs.
   4. Vul kolom D als volgt:
      1. De eerste waarde van kolom D is gelijk aan 0.
      2. Selecteer de tweede cel in kolom D , ga naar het startmenu, selecteer Vullen en klik op reeks. Selecteer kolommen. Gebruik voor de stapwaarde de berekende Δ Fs. Gebruik voor de stopwaarde de berekende S.
   5. Vul vervolgens de E-kolom als volgt met de FFT-complexwaarden:
      1. Voeg 0 in de eerste cel van de C-kolom in, omdat de afstand 0 moet samenvallen met een signaal 0 voor de berekening van de FFT.
      2. Ga vervolgens naar het menu Gegevens , klik op Gegevensanalyse en selecteer Fourieranalyse.
      3. Selecteer in het nieuwe venster het bereik van datapunten van het fluorescerende signaal beschreven in kolom C voor het ingangsbereik.
         NOTITIE: Het aantal datapunten moet 2ⁿ zijn (bijv. 256 of 128 datapunten van fluorescerend signaal).
      4. Selecteer het overeenkomstige bereik van de E voor het uitgangsbereik.
      5. Selecteer OK en laat de FFT-complexe waarden automatisch worden ingevuld.
6. Vul de F-kolom als volgt met de FFT-magnitude:
   1. Gebruik de functie IMABS om de absolute waarde in F terug te geven van het complexe getal in E en vermenigvuldig met 2/N om te normaliseren (vergelijking (2)):
      FFT-magnitude = (IM.ABS (E₁... E_n) × (2/N) (2)
7. Plot het FFT-spectrum met behulp van de FFT-magnitude in F, als functie van de FFT-frequentie in D, tot S. Zoek het punt van de maximale piek en de bijbehorende FFT-frequentie.
8. Converteer de FFT-frequentie van de maximale piek naar afstand met vergelijking (3). Deze berekende afstand vertegenwoordigt de longitudinale afstand van de mitochondriale verdeling.
   Afstand (μm) = 1/FFT-frequentie (3)
   OPMERKING: Vanwege FFT-symmetrie mag u de FFT-frequentie niet verder uitzetten dan de S-waarde , die overeenkomt met de helft van de datapunten, om duplicatie van het FFT-spectrum te voorkomen.

6. Facultatieve voorbewerkingsstappen om de beeldruis vóór beeldanalyse te verminderen

1. Pas als volgt een mediaanfilter of een 2D-deconvolutie toe:
   1. Voor mediaanfilter:
      1. Selecteer Proces | Filters en klik op de Mediaan optie.
      2. Selecteer in het weergegeven dialoogvenster Mediaan 2.0 voor Straal en klik op OK. Kies Ja om het proces toe te passen op alle afbeeldingen in de Mito-stack.
      3. Let op de vermindering van ruis in de beelden.
   2. Voor 2D-deconvolutie:
      1. Genereer een theoretische Point Spread Function (PSF).
      2. Download de plug-in PSF_Generator.jar en plaats het bestand in de map "Plugins".
      3. Klik in het dialoogvenster van de PSF-generator op de optie Born & Wolf 3D optisch model, voer de onderdompelingswaarde van de brekingsindex van 1,33 in die wordt gebruikt tijdens confocaal scannen en selecteer Beste voor de optie Nauwkeurigheidsberekening .
      4. Leg 576 nm vast voor emissiegolflengte, de NA van de gebruikte objectieflens van 0.7 en de Z-stap van 3.000 nm.
      5. Leg de pixelgrootte XY van het confocale beeld vast dat moet worden gedeconvolueerd, evenals de grootte XYZ die het aantal pixels van X en Y en het aantal Z-stappen aangeeft (3 voor dit protocol).
      6. Klik in het menu Weergave van de PSF-generator op de optie lineair, selecteer een resolutie van 8 bits en selecteer vervolgens de optie grijstinten voor de opzoektabel (LUT).
      7. Voer de PSF-generator uit en sla de theoretische PSF op die in TIFF-indeling is gemaakt.
      8. Maak een som van segmenten van de PSF die zijn gemaakt door het Z-projectgereedschap van de optie Stapels te openen die zich in het menu Afbeelding bevindt.
      9. Selecteer in het weergegeven dialoogvenster ZProjection de optie Segmenten optellen voor het type Projectie en klik op OK. Sla de nieuwe PSF op in TIFF-formaat.
         OPMERKING: Een PSF die experimenteel is verkregen door confocale scanning van fluorescerende microbeads met een bekende diameter kan worden gebruikt in plaats van de theoretische PSF.
      10. Download de plug-in "DeconvolutionLab_2.jar^"19 en plaats deze in de plug-inmap.
      11. Klik op het menu Plug-ins. Klik vervolgens op DeconvolutionLab2.
      12. Scheid de confocale afbeeldingen van de Mito-stapel met behulp van de tool Afbeeldingen om te stapelen van de optie Stapels in het menu Afbeelding en sla deze op in TIFF-formaat.
      13. Selecteer in het dialoogvenster DeconvolutionLab2 een van de afbeeldingen die zijn verkregen uit de Mito-stack. Selecteer de theoretische PSF gemaakt en selecteer het algoritme Richardson-Lucy met 15 iteraties.
      14. Voer DeconvolutionLab2 uit, controleer signaalverbetering en ruisonderdrukking in de afbeelding en sla deze op in TIFF-indeling.
2. Ga verder met stap 4.4 voor beeldanalyse.
3. Voor het drempelen van de gedeconvolueerde afbeeldingen converteert u ze naar een 8-bits masker tijdens het drempelproces. Maak een stapel met de binaire en gedeconvolueerde afbeeldingen door Afbeeldingen te selecteren om te stapelen in het gereedschap Stapels van het menu Afbeelding .
4. Voor de FFT-analyse van gedeconvolueerde afbeeldingen bevat het plotprofiel de afstand in pixeleenheden. Transformeer de pixeleenheden als volgt naar μm :
   1. Breng in de spreadsheet na het voltooien van stap 5.4 de gegevens over van B naar A. Vul vervolgens B met de afstand in μm door elk pixelnummer van A te vermenigvuldigen met de pixelgrootte.

Resultaten

Volgens het huidige protocol kan de analyse van de dichtheid en verdeling van mitochondriën worden bereikt in levende skeletspieren. Het protocol is verdeeld in drie hoofdfasen: dissectie van skeletspierbundels, confocale microscopiescans en beeldanalyse. Het workflowoverzicht is weergegeven in figuur 1. Figuur 2A toont een hele gastrocnemiusspier van een rat in een petrischaaltje, die de laterale kop markeert waaruit de vezels worden verkregen, terwijl figuur 2B de vezelbundels in Relax-oplossing toont. Door confocale microscopie kunnen de mitochondriën worden geregistreerd langs de diepte van levende skeletspiervezels met behulp van de fluorescerende indicator TMRE. TMRE is een lipofiele kationische fluorofoor die selectief wordt geaccumuleerd in mitochondriën volgens de mitochondriale membraanpotentiaal²⁰.

Een optimaal confocaal beeld van IMF kan worden verkregen door een Z-afstand van meer dan 15 μm diepte in de vezel te selecteren (Figuur 3A). Figuur 3B toont representatieve XY-confocale beelden van mitochondriën geladen met TMRE, verkregen langs de Z-afstand van gastrocnemius-spiervezels (15 tot 21 μm). De confocale beelden werden verwerkt door drempels om ze om te zetten in binaire beelden om mitochondriale analyse mogelijk te maken. Figuur 3B (linkerpaneel) toont een vezel van een getrainde Magere rat. Het vertegenwoordigt een verwacht confocaal record van mitochondriën van skeletspiervezels, omdat het een consistent patroon langs de vezel heeft. Daarentegen selecteerden we een vezel van een Ob-rat (Figuur 3B, rechterpaneel) die substantiële veranderingen in mitochondriale inhoud en distributie vertoont. Figuur 3C toont de kwantificering van het vezelgebied dat wordt ingenomen door de mitochondriën, uitgedrukt als mitochondriale dichtheid, verkregen uit elk gebinariseerd beeld (weergegeven in paneel B). Zoals verwacht vertoonde de Ob-vezel een lagere mitochondriale dichtheid. Het werd consistent gekwantificeerd langs de geanalyseerde Z-afstand, die ook wordt waargenomen in figuur 3D wanneer de mitochondriale dichtheid wordt berekend per stapel die wordt geconformeerd door de drie confocale beelden die zijn verkregen op 15, 18 en 21 μm.

Net als bij de mitochondriale dichtheidsanalyse, maakt het confocale scannen van een fluorescerende indicator voor beeldvorming van levende cellen, zoals TMRE, het mogelijk om de longitudinale organisatie van mitochondriën in levende skeletspieren te bestuderen. IMF presenteert een periodieke organisatie in de I-band in de buurt van TT⁷, die door FFT kan worden geanalyseerd om de frequentie van het mitochondriale signaal en het organisatieniveau¹⁷ te kwantificeren. Figuur 4 toont de verschillen in de organisatie van IMF gevonden in gastrocnemius afgeleid van Lean en Ob ratten en hoe FFT het mogelijk maakt om de veranderingen in de verdeling van het mitochondriale signaal te vinden. Figuur 4A,B toont longitudinale ROI's die zijn geselecteerd in een centrale en laterale positie in de vezel voor FFT-analyse. Voordat FFT wordt uitgevoerd, wordt de drempelwaarde voor achtergrondaftrekking berekend. Vervolgens wordt het beeld gebinariseerd; Deze procedures elimineren de variaties in fluorescentie-intensiteitsniveaus van het mitochondriale signaal. Het binaire beeld geeft het plotprofiel van de fluorescentieverdeling die nodig is om de FFT uit te voeren.

Figuur 4C,D toont de geselecteerde ROI's in panelen A en B met hun plotprofielen (bovenste panelen). Aan de hand van de plotprofielen kunnen verschillen in de fluorescentieverdeling tussen de vezels afkomstig van Lean en Ob-ratten worden waargenomen, evenals de variaties tussen ROI's binnen dezelfde vezel. Voor elk perceelsprofiel wordt hun respectieve FFT-spectrum gepresenteerd (onderste panelen). De piek van het maximale FFT-spectrum geeft de FFT-frequentie (X-as) van de mitochondriale signaalverdeling langs de lengteas aan. Het kan worden omgezet in een afstandswaarde van bijna 2 μm in de laterale en centrale ROI's van de Lean rat. Met name de FFT-grootte van de piek is een index van de regelmaat van het mitochondriale signaal, en veranderingen in deze amplitude onthullen veranderingen in de mitochondriale verdeling.

Figuur 4E,F toont de verschillen in het FFT-spectrum tussen Lean en Ob-afgeleide vezels waarbij respectievelijk laterale en centrale ROI's werden geanalyseerd. In laterale ROI's (Figuur 4E) was de frequentie van mitochondriale longitudinale verdeling vergelijkbaar in de magere en Ob-afgeleide vezels; niettemin was de amplitude van de maximale FFT-piek in de Ob-afgeleide vezels hoger, wat in overeenstemming is met de hogere regelmaat van het signaal dat wordt waargenomen in de afbeelding in figuur 4B. Desalniettemin wordt de centrale ROI (Figuur 4F) van de Ob waargenomen als een voorbeeld van een kritische vermindering van de FFT-piek in vergelijking met Lean wanneer een belangrijke verandering van de mitochondriale verdeling aanwezig is.

Figuur 1: Schema voor mitochondriale analyse in skeletspieren door confocale microscopie. Dit schema vat de belangrijkste stappen van het protocol samen in drie afzonderlijke fasen. De eerste fase, dissectie van gastrocnemius-spiervezelbundels, is onderverdeeld in drie opeenvolgende stappen, gastrocnemius-spierisolatie, gevolgd door spiermechanische dissectie in bundels om uiteindelijk een visuele selectie te maken van de levensvatbare. De tweede fase bestaat uit het verkrijgen van beeldvorming van levende cellen door confocale microscopie, die bestaat uit incubatie met de fluorofoor (TMRE) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de vezels in de kamer te plaatsen. Daarna worden de juiste instellingen in de microscoop gemaakt om de confocale beelden te verkrijgen. Tijdens de derde fase worden confocale beeldverwerking en data-analyse uitgevoerd. Te beginnen met beeldverwerking, waarbij een drempelwaarde nodig is om binaire beelden te genereren op basis waarvan mitochondriale dichtheidsberekeningen en mitochondriale distributie door FFT worden gedaan. Afkortingen: TMRE = tetramethylrhodamine ethylester; FFT = Snelle Fouriertransformatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Dissectie van skeletspierbundels. (A ) Ontlede laterale gastrocnemiuskop van de rat (zwarte pijl) in een petrischaal met Relax-oplossing. (B) Representatief beeld van gastrocnemius-spiervezelbundels in Relax-oplossing vóór TMRE-belasting. Afkorting: TMRE = tetramethylrhodamine ethylester. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Mitochondriale dichtheidsanalyse. (A) Illustratie die de aanbevolen Z-afstand weergeeft voor confocale scanning van IMF-mitochondriën in skeletspiervezels. (B) Reeks confocale beelden van mitochondriën geladen met TMRE in skeletspiervezels, verkregen van een getrainde Zucker +/+ rat (Lean) en van een zwaarlijvige Zucker fa /fa rat (Ob) opgenomen in de Z-afstand (van 15 tot 21 μm diepte). De beelden werden verwerkt door middel van drempels en omgezet in binaire beelden. (C) Berekende mitodichtheid van de confocale plakken verkregen op verschillende Z-afstanden waargenomen in paneel B. (D) De mitodichtheid verkregen uit de schoorsteen die is samengesteld uit de beelden die zijn waargenomen in paneel B. Beelden in paneel B zijn 65 x 50 μm. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: Mito-dichtheid = Mitochondriale dichtheid; IMF = intermyofibrillaire mitochondriën; Ob = zwaarlijvig; SSM = subsarcolemmale mitochondriën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Mitochondriale verdelingsanalyse door FFT. Representatieve confocale beelden van mitochondriën geladen met de fluorescerende indicator TMRE verkregen op 21 μm van de diepte van skeletspiervezels verkregen van een getrainde Zucker +/+ rat (Lean, panel A) en van een zwaarlijvige Zucker fa /fa rat (Ob, panel B). De beelden werden verwerkt door middel van drempels en omgezet in binaire beelden. Laterale en centrale ROI's van paneel A (paneel C) en paneel B (paneel D) met hun respectievelijke plotprofielen van fluorescentie-intensiteit (bovenste plot) en FFT-spectrum (onderste plot). FFT werd berekend op basis van ROI's met een breedte van 256 pixels, wat overeenkomt met een ROI-grootte van 39 x 5 μm in paneel A en een ROI-grootte van 50 x 5 μm in paneel B. Panel E toont de verschillen van het FFT-spectrum tussen mitochondriën afgeleid van Lean en Ob-ratten in de laterale ROI, terwijl panel F de verschillen van het FFT-spectrum van centrale ROI laat zien. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: A.U. = Arbitrary Units; FFT = Snelle Fouriertransformatie; ROI's = regio's van belang; Ob = zwaarlijvig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reagens	Eindconcentratie in 100 ml	Voorraad
K-aspartaat	100 mM
Kcl	20 mM
HEPES	20 mM
L-glutaminezuur	3 mM
Appelzuur	3 mM
EGTA	0,1 mM	10 mM
MgCl2	1 mM vrij Mg2+
CaCl2	0,00002 mM vrij Ca2+
Fosfocreatine di-Na	5 mM	500 mM
Creatine fosfokinase	5 E/ml	200 E/ml
MgATP	5 mM
pH 7,3 (met NaOH)

Tabel 1: Relaxoplossing, reagentia en concentratie.

Aanvullende figuur S1: Effect van de methoden voor het voorbewerken van afbeeldingen. (A) Representatieve confocale beelden van mitochondriën geladen met de fluorescerende indicator TMRE, verkregen op een diepte van 18 μm in skeletspiervezels, verkregen van een getrainde Zucker +/+ rat (Lean, bovenste paneel) en van een zwaarlijvige Zucker fa /fa rat (onderste paneel), samen met hun respectievelijke beelden verkregen na voorbewerking met behulp van Otsu'-drempelwaarde, mediaanfilter en Otsu'-drempelwaarde, en 2D-deconvolutie en Otsu'-drempels. (B) Plotprofiel van de mitodichtheid verkregen uit de confocale beelden (paneel A) na voorbewerking met verschillende methoden. Beelden in paneel A zijn 65 x 50 μm. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: 2D-Decon = 2D deconvolutie; Mito-dichtheid = Mitochondriale dichtheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Mitochondriën zijn organellen met een hoog remodelleringsvermogen. Hun inhoud, dichtheid en distributie kunnen snel worden gewijzigd door de activering van de mitochondriale fusie- en splijtingsmechanismen, bekend als mitochondriale dynamica¹, en de balans tussen de mitochondriale omzetmechanismen: de mitochondriale biogenese en de gespecialiseerde mitochondriënafbraakroute, mitofagie^21,22. Mitochondriale inhoud en morfologie kunnen variëren afhankelijk van het celtype en het ontwikkelingsstadium en kunnen worden gemodelleerd onder verschillende fysiologische en pathologische stimuli 17,22,23,24. Daarom is de studie van de mitochondriale morfologie al meer dan een halve eeuw relevant²⁵. Met name de analyse van mitochondriën door middel van elektronenmicroscopie is de standaardtechniek die in meerdere onderzoeken is^toegepast26.

Fluorescerende studies door confocale microscopie hebben de afgelopen jaren aan relevantie gewonnen vanwege hun vermogen voor beeldvorming van levende cellen van mitochondriën op verschillende vezeldiepten, wat zou kunnen helpen de rol van mitochondriën in skeletspieren beter te begrijpen in verschillende adaptieve en onaangepaste omstandigheden²⁷. In deze studie wordt een methodologie beschreven voor de analyse van de dichtheid en verdeling van mitochondriën in levende skeletspiervezels door middel van confocale microscopie. Een van de grootste uitdagingen bij het werken met levende skeletspiervezels is het voorkomen van samentrekking van de isolatieprocessen tot aan de mitochondriale confocale opname. Om dit doel te bereiken, wordt een hoge Mg- en ATP Relax-oplossing¹⁷ gebruikt om de vezels gedurende ten minste 2 uur ontspannen te houden, wat voldoende tijd geeft om het vezelisolatieproces, de fluorofoorbelasting en de verwerving van het mitochondriale signaal door confocale microscopie uit te voeren. Een kritiek punt van het protocol is het mechanisch verkrijgen van de vezels, omdat dit een hoge precisie en vers weefsel vereist; Het is echter mogelijk om levensvatbare vezelbundels uit rattenspieren te verkrijgen met deze eerder gebruikte en gerapporteerde techniek²⁸. Het verkrijgen van intacte vezels zorgt voor het behoud van het sarcolemma en de intracellulaire omgeving, waardoor de metabole en functionele overspraak tussen celstructuren behouden^{blijft 28,29}.

In tegenstelling tot het werken met weefsels of vaste cellen, maakt het verkrijgen van fluorescerende beelden van levende cellen door confocale microscopie real-time monitoring van het effect van verschillende experimentele omstandigheden mogelijk. Het huidige protocol kan worden gebruikt om veranderingen in mitochondriale dichtheid en distributie in real-time te onderzoeken en verschillen tussen experimentele groepen te onderzoeken, zoals de hier gepresenteerde voorbeelden tussen Lean en Ob-afgeleide vezels (Figuur 3 en Figuur 4). Er moet altijd rekening mee worden gehouden dat beeldvorming van levende cellen inhoudt dat optimale werkomstandigheden met kleine celbeschadiging worden gestandaardiseerd. De werktijd, de kwaliteit van de gebruikte oplossingen, de acquisitieparameters en de belichting van lasers moeten nauwkeurig worden gecontroleerd. Daarom worden hieronder essentiële overwegingen genoemd.

Mitochondriën van spiervezels kunnen niet volledig longitudinaal worden geregistreerd door confocale microscopie vanwege de grootte van de vezel en de schade aan de vezel die kan worden veroorzaakt door lange laserblootstelling. Desalniettemin wordt met deze techniek een representatief monster van de vezel geregistreerd. Hoewel het mogelijk is om de volledige dikte van de skeletspiervezel van een rat vast te leggen door middel van confocale microscopie, impliceert dit een langere opnametijd en blootstelling aan de laserstraal. In het geval van controleratten zijn er geen problemen met deze opnames ondervonden. Vezels van pathologische aandoeningen kunnen echter vatbaarder zijn voor schade, zoals waargenomen in de vezels van Ob-ratten. Daarom verdient het de voorkeur om een stapel representatieve confocale beelden te verkrijgen die op verschillende Z-afstanden zijn verkregen. Wanneer slechts een deel van de vezeldikte wordt geregistreerd, wordt aanbevolen om de stapel op dezelfde diepte te nemen op alle geteste vezels, aangezien de mitochondriale verdeling en dichtheid kunnen variëren afhankelijk van de positie in de vezel. Acquisitie van het signaal op een diepte van meer dan 15 μm wordt aanbevolen om representatieve confocale beelden van IMF te verkrijgen, waarbij SSM-populaties die zich dicht bij de periferie bevinden, worden vermeden.

Bij de confocale acquisitie moet rekening worden gehouden met enkele belangrijke overwegingen. Ten eerste de selectie van de immersieobjectieflens, rekening houdend met de vergroting, hoge NA en het onderdompelingsmedium. Aangezien cellen in een hydrofiel incubatiemedium worden bewaard, moet de brekingsindex van het incubatie- en immersiemedium vergelijkbaar zijn om een goed signaal te verkrijgen en diep in het weefsel te scannen. Meestal bereikt met behulp van een objectieflens voor onderdompeling in water. Confocale beelden van figuur 3 en figuur 4 werden verkregen met een 20x, 0,7 NA, wateronderdompelingsobjectief. Dit objectief maakt het mogelijk om de vezel in al zijn diepte vast te leggen, maar scannen op 15, 18 en 21 μm werd besloten omdat representatieve confocale beelden van IMF kunnen worden verkregen met een signaal met een hoge fluorescentie-intensiteit en kleine vezelbeschadiging. Andere vergrotingen, zoals 40x en olie als immersiemedium, kunnen worden overwogen, maar moeten worden geëvalueerd.

Ten tweede wordt de pixelgrootte voor beeldvorming berekend volgens de stelling van Nyquist, die het mogelijk maakt een geschikte pixelgrootte te selecteren die over-sample (hogere laserblootstelling) en onder-sample (leidt tot minder resolutie) vermijdt30. De berekening is afhankelijk van de kenmerken van de geselecteerde objectieflens en de golflengte (~90 nm). Het kan worden aangepast met de zoom; Daarom biedt slechts één zoominstelling een optimale pixelgrootte^{van 30}. Toch hangt de zoom in de praktijk ook af van het gebied van het te analyseren monster. Het vinden van balans maakt het dus mogelijk om te werken met een pixelgrootte die het dichtst bij het Nyquist-criterium ligt en die ook past bij het te analyseren gebied. Figuur 3 en Figuur 4 werden verkregen met een pixelgrootte van 150 en 190 nm, waardoor de volledige breedte van de vezel kon worden geanalyseerd, namelijk ~50-80 μm.

Ten derde moet een geschikte gaatjesdiameter worden gebruikt die voorkomt dat onscherp licht de detector bereikt. Doorgaans wordt 1 Airy beschouwd als de optimale pinhole-grootte, omdat het de detectie mogelijk maakt van ~80% van de fotonen die afkomstig zijn van het focusvlak³⁰. Desalniettemin vereisen sommige gekleurde biologische monsters die lage fluorescentieniveaus vertonen een gaatjesverhoging³⁰. Confocale beelden van figuur 3 en figuur 4 werden verkregen met een gaatjesmaat van 3 Airy vanwege een laag signaal dat werd vastgelegd met een lagere Airy. Het is belangrijk om te bedenken dat de toename van de signaalintensiteit als gevolg van het vergroten van de pinhole-grootte leidt tot een verlaging van de resolutie als gevolg van meer onscherp opgevangen licht. Om deze reden raden we aan om een gaatjesmaat te gebruiken die zo dicht mogelijk bij 1 luchtig ligt.

Wanneer ze adequaat zijn verkregen, kunnen confocale beelden worden verwerkt om kwantitatieve informatie over de mitochondriale dichtheid en distributie te verkrijgen. Hoe dan ook, de kritische verwerkingsbeeldstap van drempels moet vóór de analyse worden uitgevoerd om de kwantificering van het signaal te verbeteren. Tijdens deze cruciale stap wordt de fluorescentie-intensiteitswaarde gedefinieerd die de positieve pixels voor mitochondriën scheidt van die van de achtergrond. De drempel kan worden gedefinieerd door een Gaussiaanse fit van de piek die mitochondriën vertegenwoordigt wanneer het histogram van de afbeelding twee pieken weergeeft, één die overeenkomt met de achtergrond en de andere met de mitochondriën. Een bimodale verdeling wordt echter niet altijd in elk van de afbeeldingen bereikt, dus moeten andere drempelmethoden worden toegepast.

In dit protocol wordt de implementatie van Otsu's drempelwaarde beschreven, een niet-parametrische en niet-gecontroleerde methode die is ontworpen om de drempelwaarde te vinden wanneer de twee pieken niet gescheiden zijn, of wanneer er andere pieken aanwezig zijn³¹. Otsu kan eenvoudig worden toegepast met behulp van een open-source platform voor biologische beeldanalyse; Er kunnen echter ook andere drempelmethoden worden getest. Dezelfde drempelmethode moet worden toegepast op alle confocale beelden en moet voor elk confocaal beeld afzonderlijk worden berekend. Het toepassen van de drempel op een hele stapel leidt tot onjuiste resultaten. Zodra de binaire beelden zijn verkregen na het drempelproces, kan de analyse van de mitochondriale dichtheid en FFT eenvoudig worden uitgevoerd door de instructies te volgen die in dit protocol worden beschreven. Bij het uitvoeren van beide analyses moet er echter op worden gelet dat kernen en haarvaten niet worden opgenomen, omdat dit tot kwantificeringsfouten zou leiden. Wat de dichtheid betreft, volstaat het om de pixels, of het gebied dat wordt ingenomen door de kernen of haarvaten, af te trekken van de pixels of het totale te analyseren gebied. Bovendien moet bij het uitvoeren van de FFT-analyse worden geverifieerd dat het mitochondriënsignaal recht is. Omgekeerd, wanneer het mitochondriënsignaal wordt gekanteld, kan het profielen produceren die niet de mitochondriale longitudinale verdeling vertegenwoordigen, wat onjuiste FFT-spectrumgegevens oplevert. Daarnaast kan een voorbewerkingsstap worden toegepast om de ruis in de beelden te verminderen. Dit protocol beschrijft twee optionele voorbewerkingsstappen met behulp van een mediaanfilter en 2D-deconvolutie. De effecten van deze voorbewerkingsmethoden op het beeld en de mitochondriale dichtheid zijn weergegeven in aanvullende figuur S1. Het is belangrijk om te bedenken dat hoewel deze voorprocessen de beeldkwaliteit kunnen verbeteren, ze ook kunnen leiden tot het verlies van bepaalde beelddetails. Daarom moeten ze met de nodige voorzichtigheid worden gebruikt en consequent worden toegepast op alle afbeeldingen die worden geanalyseerd.

Ondanks de voordelen wordt confocale microscopie beperkt door een laterale resolutie (XY) van 180-250 nm wanneer de optimale omstandigheden voor acquisitie worden geïmplementeerd³². De mitochondriale diameter is ~200-700 nm, dicht bij de diffractielimiet van confocale microscopie; submitochondriale structuren kunnen dus niet adequaat worden gedetecteerd³³ en kunnen niet worden geëvalueerd door dichtheids- en FFT-analyses die in dit protocol worden getoond. Andere superresolutietechnieken van microscopie, zoals stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), gestimuleerde emissiedepletie (STED) nanoscopie of gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), kunnen worden onderzocht om submitochondriale structuren op te lossen³². In dit protocol worden de confocale beelden van mitochondriën verkregen met behulp van de fluorofoor TMRE, die afhankelijk is van de mitochondriale membraanpotentiaal. Daarom kan de mitochondriale fluorescentie-intensiteit variëren afhankelijk van hun membraanpotentiaal. Voorafgaand aan de gegevensanalyse wordt een drempelproces uitgevoerd om dit probleem op te lossen. Alle pixels boven een gedefinieerde drempel worden als positief beschouwd voor het mitochondriale signaal, onafhankelijk van hun fluorescentiewaarde. Desalniettemin moet worden opgemerkt dat mitochondriën met een zeer laag membraanpotentiaal niet kunnen worden opgelost met deze techniek. Daarom worden aanvullende studies van de kwantificering van het mitochondriale eiwitgehalte aanbevolen. Een voordeel van het gebruik van TMRE is dat confocale beelden ook kunnen worden gebruikt voor mitochondriale membraanpotentiaalanalyse, maar dat er adequate controles met ontkoppelingsmiddelen moeten worden uitgevoerd, zoals carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP). Bovendien kunnen de instructies voor mitochondriale dichtheids- en distributieanalyse worden bereikt met behulp van groene fluorescerende indicatoren voor mitochondriën, die mitochondriën belasten ongeacht hun membraanpotentieel, maar de incubatiestrategie en confocale acquisitie-instellingen moeten worden gestandaardiseerd.

Aangezien de structuur van mitochondriën verband houdt met essentiële mitochondriale en cellulaire functies, kan het hier beschreven protocol waardevolle informatie opleveren over hun remodellering tijdens ziekte of door een bepaalde stressbelediging. Het zou kunnen bijdragen aan een beter begrip van de belangrijkste functies van skeletspieren die worden bestuurd door mitochondriën, zoals energieproductie, of waarin mitochondriën een belangrijke rol spelen bij de interactie met andere organellen, zoals contractie-metabolismekoppeling. Door de protocolinstructies te volgen, kan de mitochondriale dichtheid en distributie in levende skeletspieren worden geschat. De protocolstappen zijn onderverdeeld in drie hoofdfasen die gericht zijn op dissectie van skeletspierbundels, confocale microscopiescans en beeldanalyse, waarbij gedetailleerde instructies en belangrijke overwegingen zijn opgenomen. Het protocol kan met name verder worden geoptimaliseerd om aanvullende Z-stappen te verkennen voor volledige mitochondriale reconstructie binnen de vezel volgens de behoeften van de gebruiker. De confocale beeld- en analysestappen kunnen bijvoorbeeld worden getest om cellulaire structuren met een vergelijkbare verdeling te bestuderen, zoals TT in levende en vaste monsters.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adenosine 5’-trifosfaat dinatriumzout hydraat	Sigma-Aldrich	A6419
Borosilicaatglazen dekglas	Warner Instruments	64-0709
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	C5670
Confocale microscoop	Leica	TCS SP5
Confocale microscoop software Leica Application Suite	Leica	2.7.3.9723
Creatinefosfokinase	Sigma-Aldrich	C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)	Biomedical Imaging Group, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
DL-Asparaginezuur kaliumzout hemihydraat	Sigma-Aldrich	11240
Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraazijnzuur	Sigma-Aldrich	E4378
Pincetten	Miltex	MH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objectief	Leica	506517
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Iris schaar	Miltex	5-304
L-(-)-Apfelzuur	Sigma-Aldrich	M7397
L-(-)-Glutaminzuur mononatriumzout hydraat	Sigma-Aldrich	G1626
Magnesiumchloride hexahydraat	Sigma-Aldrich	M2393
Maxchelator	UC Davis Health	https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm
Micro schaar	Miltex	18-1633
Open-source platform voor biologische-beeldanalyse Fiji	Openbaar, onderhouden door Eliceiri/LOCI groep, Jug groep en Tomancak lab.Fiji	https://fiji.sc/
Fosfocreatine dinatriumzout hydraat	Sigma-Aldrich	P7936
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar)	Biomedical Imaging Group, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/
Opnamekamer	Warner Instruments	RC-27N
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spreadsheet Microsoft Excel	Microsoft
Stereomicroscoop	Zeiss	Stemi 508
Tetramethylrodamine, ethylester	Invitrogen	T669