De "Brain Milking"-methode voor de isolatie van neurale stamcellen en voorlopercellen van oligodendrocyten uit levende ratten

Samenvatting

Een methode voor de isolatie van neurale stamcellen en oligodendrocytenvoorlopercellen uit de hersenen van levende ratten wordt hier in experimenteel detail gepresenteerd. Het maakt meerdere verzamelingen van deze cellen van dezelfde dieren mogelijk zonder hun welzijn in gevaar te brengen.

Samenvatting

Weefselspecifieke neurale stamcellen (NSC's) blijven actief in de postnatale hersenen van zoogdieren. Ze bevinden zich in gespecialiseerde niches, waar ze nieuwe neuronen en glia genereren. Een van die niches is de subependymale zone (SEZ; ook wel de ventriculair-subventriculaire zone genoemd), die zich over de laterale wanden van de laterale ventrikels bevindt, grenzend aan de ependymale cellaag. Oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC's) zijn overvloedig verspreid over het centrale zenuwstelsel en vormen een pool van proliferatieve voorlopercellen die oligodendrocyten kunnen genereren.

Zowel NSC's als OPC's vertonen zelfvernieuwingspotentieel en rust-/activeringscycli. Vanwege hun locatie wordt het isolement en experimenteel onderzoek van deze cellen postmortaal uitgevoerd. Hier beschrijven we in detail "hersenmelken", een methode voor het isoleren van NSC's en OPC's, naast andere cellen, uit levende dieren. Dit is een protocol in twee stappen dat is ontworpen voor gebruik bij knaagdieren en is getest bij ratten. Eerst worden cellen "vrijgemaakt" uit het weefsel via stereotactische intracerebroventriculaire (i.c.v.) injectie van een "release cocktail". De belangrijkste componenten zijn neuraminidase, dat zich richt op ependymale cellen en ventriculaire wanddenudatie induceert, een integrine-β1-blokkerend antilichaam en fibroblastgroeifactor-2. Bij een tweede "verzamelingsstap" worden vloeibare biopsieën van hersenvocht uitgevoerd vanuit de cisterna magna, bij verdoofde ratten zonder dat een incisie nodig is.

De hier gepresenteerde resultaten laten zien dat geïsoleerde cellen hun endogene profiel behouden en dat NSC's van de SEZ hun rust behouden. De denudatie van de ependymale laag is beperkt tot het anatomische niveau van injectie en het protocol (vrijgave en verzameling) wordt goed verdragen door de dieren. Deze nieuwe benadering maakt de weg vrij voor het uitvoeren van longitudinale studies van endogene neurogenese en gliogenese bij proefdieren.

Inleiding

Weefselspecifieke stamcellen zijn gedeeltelijk geëngageerde cellen die aanleiding kunnen geven tot alle celpopulaties waaruit de respectieve weefsels bestaan. Behalve dat ze multipotent zijn, zijn het zelfvernieuwende cellen en cruciaal voor het behoud van de homeostase en het regeneratieve vermogen van^weefsels1. Sommige weefselspecifieke stamcellen blijven in een actieve, sterk proliferatieve toestand, zoals intestinale of hematopoëtische stamcellen. Andere, zoals hersenstamcellen, blijven grotendeels rustig of slapend². In het volwassen brein zijn neurale stamcellen (NSC's) te vinden in gespecialiseerde gebieden, vaak niches genoemd. Twee van dergelijke goed beschreven gebieden bestaan in de subependymale zone (SEZ) van de laterale ventrikels en in de gyrus dentatus van de hippocampus. De SEZ-niche genereert het hoogste aantal cellen, voornamelijk neuroblasten die naar de bulbus olfactorius migreren en bijdragen aan de lokale interneuronpopulatie; daarentegen migreren gegenereerde oligodendroblasten naar het aangrenzende corpus callosum (CC)³. Oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC's) zijn mitotisch actieve cellen, wijd verspreid over het centrale zenuwstelsel, die: i) toegewijd zijn aan de oligodendrogliale afstamming, ii) kunnen migreren naar plaatsen van demyelinisatie en iii) kunnen differentiëren tot myeliniserende oligodendrocyten. OPC's vertonen ook zelfvernieuwingspotentieel en rust⁴.

Tot nu toe vereiste de isolatie en studie van NSC's en OPC's postmortale dissociatie van het ontlede hersen- en ruggenmergweefsel. Om deze experimentele beperking te omzeilen, hebben we een methode ontwikkeld die voor het eerst de isolatie van hersen-NSC's en OPC's van levende dieren mogelijk maakt. We noemen deze methode "melken", omdat het meerdere verzamelingen van cellen mogelijk maakt omdat hun poelen niet uitgeput raken. Het protocol is ontwikkeld bij ratten, vanwege hun grote hersenomvang, voornamelijk gericht op de SEZ, of de CC, en omvat twee belangrijke stappen. Eerst worden NSC's of OPC's uit het weefsel "verwijderd" via i.c.v. injectie van een "release cocktail" die neuraminidase bevat, een toxine dat ventriculaire wanddenudatie induceert, een integrine-β1-blokkerend antilichaam en fibroblastgroeifactor 2 (FGF2). De cocktail wordt stereotaxisch bilateraal geïnjecteerd in de laterale ventrikels. Als het beoogde gebruik de isolatie van NSC's is, zijn rostrale gebieden van de laterale ventrikels het doelwit. Als het doel is om OPC's zuiverder te isoleren, wordt de cocktail caudaal geïnjecteerd in het gebied van de hippocampusfimbrie. Bij een tweede "verzamelingsstap" worden vloeibare biopsieën van cerebrospinale vloeistof (CSF) uitgevoerd vanuit de cisterna magna van verdoofde ratten, zonder dat een incisie nodig is. De vloeibare biopsie wordt gemengd met NSC-kweekmedium en kan tot het uitplateren bij 4 °C worden bewaard.

Protocol

De fokkerij, het onderhoud en de experimentele procedures voor dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, geautoriseerd door het ministerie van Binnenlandse Zaken, en met het presidentieel decreet 56/2013 van de Helleense Republiek, onderzocht door de Animal Welfare and Ethical Review Bodies van de universiteiten van Cambridge en Patras, evenals goedgekeurd en onderzocht door de lokale prefecturale commissie voor dierenverzorging en -gebruik (protocolnummer: 5675/39/18-01-2021). Mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley-, Wistar- en Long-Evans-ratten, met leeftijden variërend tussen 2 en 4 maanden en met een lichaamsgewicht tussen 150 g en 250 g, werden gebruikt. Het protocol is grafisch samengevat in figuur 1.

1. Laat de cocktailbereiding los

NOTITIE: Vers bereiden op de dag van de procedure en bewaren op ijs. De hoeveelheden worden gegeven per 2 μL die i.c.v. in elke laterale ventrikel moet worden geïnjecteerd. Bereid een extra 1 μL per beoogde injectie.

1. Bereid 0,5 μl neuraminidase van 500 mU uit Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   OPMERKING: Bewaar dit als een bouillon van 1 E/μL verdund in steriel water bij -20 °C. Andere soorten neuraminidasen zijn niet getest.
2. Bereid 1 μL met 1 μg integrine-β1-blokkerend antilichaam.
   NOTITIE: Bewaar het bij 4 °C.
3. Bereid 0,5 μl met 0,5 μg basisch fibroblastgroeifactor (recombinant humaan FGF-basisch).
   OPMERKING: Bewaar het als een bouillon van 1 μg/μL verdund in steriel water bij -20 °C.

2. Injectie van afgiftecocktail

NOTITIE: Het hele proces kan binnen 20 minuten worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat u de operatie in aseptische omstandigheden uitvoert. Reinig alle oppervlakken met een antisepticum (bijv. 3% of 6% waterstofperoxide). Gebruik geautoclaveerd of gemakkelijk steriel gereedschap, handschoenen, jassen en gordijnen.

1. Verdoof het proefdier door inhalatie van isofluraan (2,5% voor inductie en 2% voor onderhoud). Bevestig de diepte van de anesthesie door de hoornvliesreflex, de reactie op stimuli (achterpoot- en staartknijptest) en de manier van ademen te controleren.
   OPMERKING: Chirurgische ingrepen kunnen worden uitgevoerd onder algemene anesthesie geïnduceerd door intraperitoneaal injecteerbare anesthesie (bijv. ketamine [40 mg/kg] en xylazine [10 mg/kg]). Diepe anesthesie werd bevestigd door het controleren van de hoornvliesreflex, de reactie op stimuli (achterpoot- en staartknijptest) en de manier van ademen.
2. Analgesie subcutaan toedienen (bijv. 0,3 mg/ml buprenorfine) bij inductie van anesthesie.
3. Monteer de rat op het stereotaxische frame.
4. Scheer de vacht van het hoofd met een scheermes en reinig de huid met antisepticum, zoals 10% povidon-jodiumoplossing en vervolgens alcohol. Breng het antisepticum driemaal aan met steriele wattenstaafjes. Wrijf elke keer in een cirkelvormige beweging gedurende 3-5 s. Breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen.
5. Maak een incisie van 2 cm in de huid van het hoofd langs de middellijn met behulp van een steriel scalpel.
6. Maak de schedel zorgvuldig schoon met behulp van steriele wattenstaafjes en steriele zoutoplossing.
7. Identificeer het bregma met behulp van de rand van de naald van een 10 μL Hamilton-spuit die op het stereotaxische apparaat is gemonteerd. Stel de bregma in op "punt 0,0".
   OPMERKING: Het bregma wordt geïdentificeerd als het snijpunt tussen de sagittale en de coronale hechtingen. Meer details zijn te vinden in de rattenhersenatlas van Paxinos en Watson⁵.
8. Verplaats het apparaat naar de coördinaten anterioposterior (AP) = 0.3 mm, lateraal (L) = +1.2 mm (om de SEZ te richten) of AP = 1.5 mm, L = +2.0 mm (om de CC te richten).
9. Boor een braamgat van 1 mm met een tandartsboor.
   NOTITIE: Als u met de hand boort, zorg er dan voor dat u het corticale oppervlak niet beschadigt. De bloeding zal naar verwachting niet aanzienlijk zijn. Verwijder eventueel bloed met zoutoplossing en oefen druk uit om hardnekkiger bloeden te stoppen.
10. Laad 4 μL van de afgiftecocktail in de 10 μL Hamilton-spuit.
11. Laat de naald (bij voorkeur stompe of conische rand) van de Hamilton-spuit zakken om in contact te komen met de dura.
12. Steek de naald in op de gewenste diepte (D = 3,5 mm).
    NOTITIE: Giet zoutoplossing op het oppervlak van de dura om het weefsel gehydrateerd te houden.
13. Laat 2 μL van de afgiftecocktail trekken met een snelheid van 1 μL/min.
14. Laat de naald nog 2 minuten op zijn plaats voordat u hem langzaam ophaalt om te voorkomen dat de vrijgavecocktail aan de oppervlakte komt.
15. Herhaal stap 2.8-2.14 voor het andere halfrond op de coördinaten AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (om de SEZ te richten), of AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (om de CC te richten).
16. Hecht de incisie met 5-0 nylon (diameter 0,1 mm) en reinig het gehechte gebied met een antisepticum.
17. Verwijder het masker dat de verdoving toedient en breng het dier over naar de controleruimte na de operatie.
    OPMERKING: Herstel van anesthesie en behoud van liggedrag zou binnen 5-10 minuten moeten plaatsvinden en volledig herstel (normaal gedrag) binnen 25 minuten.
    1. Houd het herstel nauwlettend in de gaten (levendige en ononderbroken beweging, frequente toegang tot water) in een goed verwarmde (24-25 °C), stille ruimte zonder beddengoed met kleine deeltjes, die de luchtwegen kunnen blokkeren. Breng het dier pas terug naar het gezelschap van zijn kooigenoten (niet naar nieuwe dieren) nadat volledig herstel is bevestigd.
    2. Bewaak het dier gedurende ten minste 48 uur na de operatie in de onderhoudsfaciliteit. Tekenen van pijn aanpakken (verbergen van het hoofd, abnormale hoofd- of lichaamshouding, overgevoeligheid en hyperexcitabiliteit voor hantering) door analgesie toe te dienen (bijv. 0,3 mg/ml buprenorfine, subcutaan). Verwijs dieren met een verkleurde of opgezette vacht door naar de verantwoordelijke dierenarts.

3. Cerebrospinale vloeistof (CSF) vloeibare biopsie

NOTITIE: Het hele proces kan binnen 10 minuten worden uitgevoerd. De hier beschreven vloeibare biopsie wordt 3 dagen na injectie van de afgiftecocktail uitgevoerd, maar kan indien nodig op precies dezelfde manier worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat u de operatie in aseptische omstandigheden uitvoert. Reinig alle oppervlakken met een antisepticum (bijv. 3% of 6% waterstofperoxide). Gebruik geautoclaveerd of gemakkelijk steriel gereedschap, handschoenen, jassen en gordijnen.

1. Verdoof het dier door inhalatie van isofluraan (2,5% voor inductie en 2% voor onderhoud). Bevestig de diepte van de anesthesie door het hoornvlies te controleren
   reflex, de reactie op prikkels (achterpoot- en staartknijptest) en de wijze van ademen.
   OPMERKING: De chirurgische ingrepen kunnen worden uitgevoerd onder algemene anesthesie geïnduceerd door intraperitoneaal injecteerbare anesthesie (bijv. ketamine [40 mg/kg] en xylazine [10 mg/kg]). Dit is echter niet aan te raden omdat de procedure kort is, vooral als biopsieën meerdere keren op opeenvolgende dagen worden uitgevoerd.
2. Analgesie subcutaan toedienen (bijv. 0,3 mg/ml buprenorfine) bij inductie van anesthesie.
3. Monteer het proefdier op het stereotaxische frame. Gebruik oorkappen om het hoofd vast te zetten zonder de rotatiebeweging naar voren en naar achteren te belemmeren.
4. Stabiliseer het hoofd in een neerwaartse hoek van 40°, zodat een goede extensie van de achterkant van de nek kan worden bereikt.
   NOTITIE: Een manier om dit te doen is door de mondstang van het apparaat⁶ te gebruiken.
5. Scheer de vacht in de nek met een scheermes en reinig de huid met antisepticum, zoals 10% povidon-jodiumoplossing en vervolgens alcohol. Breng het antisepticum driemaal aan met steriele wattenstaafjes. Wrijf elke keer in een cirkelvormige beweging gedurende 3-5 s.
6. Zoek met de vingertop het ruitvormige indrukbare gebied tussen het occipitale uitsteeksel en de wervelkolom van de atlas⁶.
7. Teken een puntmarkering (bijvoorbeeld met een stift).
8. Bevestig een spuit van 1 ml of 0,5 ml op het stereotaxische frame.
   OPMERKING: Het is raadzaam om spuiten te gebruiken met niet-verwijderbare naalden, omdat deze een betere zuigkracht produceren en minder dood volume hebben.
9. Breng de naald op het contactpunt met de huid bij de puntmarkering.
10. Til de huid met een pincet op terwijl u de spuit door de huidlagen laat zakken.
11. Trek de zuiger iets terug om onderdruk in de spuit te genereren.
12. Start opnieuw om de naald heel langzaam onder te dompelen totdat er vloeistof (CSF) in de spuit verschijnt.
13. Zet de naald op deze positie en laat de langzame stroom van CSF toe.
    NOTITIE: De naald kan iets worden verlaagd of verhoogd als de CSF-stroom erg traag is.
14. Begin langzaam met het verwijderen van de CSF (in stappen van 40 μL/min) tot 120 μL.
15. Haal de spuit langzaam terug.
16. Intraperitoneaal 1 ml normaal serum toedienen ter ondersteuning van de aanvulling van het vocht door het proefdier.
17. Meng de vloeibare biopsie (CSF) met 400 μL NSC-medium en houd de microcentrifugebuis op 4 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Vloeibare biopsieën moeten binnen 3 uur worden verwerkt als ze niet zijn ingevroren.
18. Verwijder het masker dat de verdoving toedient en breng het dier over naar de bewakingsruimte na de operatie.
    OPMERKING: Herstel van anesthesie en behoud van liggedrag zou binnen 5-10 minuten moeten plaatsvinden en volledig herstel (normaal gedrag) binnen 25 minuten.
    1. Houd het herstel nauwlettend in de gaten (levendige en ononderbroken beweging, frequente toegang tot water) in een goed verwarmde (24-25 °C), stille ruimte zonder beddengoed met kleine deeltjes, die de luchtwegen kunnen blokkeren. Breng het dier pas terug naar het gezelschap van zijn kooigenoten (niet naar nieuwe dieren) nadat volledig herstel is bevestigd.
    2. Bewaak het dier gedurende ten minste 48 uur na de operatie in de onderhoudsfaciliteit. Als er tekenen van pijn worden waargenomen (verbergen van het hoofd, abnormale hoofd- of lichaamshouding, overgevoeligheid en hyperexcitabiliteit voor hantering), moet analgesie worden toegediend (bijv. 0,3 mg/ml buprenorfine subcutaan). Verwijs dieren met een verkleurde of opgezette vacht door naar de verantwoordelijke dierenarts.

4. Verwerking van weefsel voor immunofluorescentie

1. Euthanaseer het dier door intracardiale infusie van 20 ml ijskoude zoutoplossing, gevolgd door 50 ml ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA; in fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS] met pH = 7,4).
2. Ontleed het hersenweefsel.
   1. Scheid het hoofd van het lichaam met een schaar om een snee in het cervicale gebied te maken. Gebruik de schaar om de huid te verwijderen en knip vervolgens het bot van de schedel langs de sagittale middellijn, met de punten van de schaar naar boven gericht om het hersenweefsel niet te beschadigen. Streef ernaar om zoveel mogelijk te blijven snijden en de coronale middellijn te passeren.
   2. Gebruik een tang om de botten te verwijderen, beginnend bij de supraoccipitale en de pariëtale botten en tenslotte de voorhoofdsbeenderen.
   3. Zodra het hersenweefsel zichtbaar is, gebruik je de tang of een spatel om het uit de schedel te tillen. Om dit te vergemakkelijken, snijdt u de zenuwen aan de basis van de hersenen en de bulbus olfactorius door, indien niet gewenst.
3. Fixeer het weefsel 's nachts in 2% PFA bij 4 °C.
4. Cryo-bescherm het weefsel in 30% sucrose (in PBS) gedurende ten minste 48 uur bij 4 °C totdat het weefsel naar de bodem zakt.
5. Vries het weefsel in bij -80 °C.
6. Snijd het hersenweefsel met een cryostaat in 14 μm dikke coronale secties.
7. Voer immunofluorescentiekleuring uit met behulp van standaardprotocollen ^3,7
   1. Incubeer de coupes met blokkeerbuffer (3% runderserumalbumine [BSA], 0,1% Triton X-100, in PBS) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
   2. Voer antigeenextractie uit (15 minuten koken in 10 mM citraatbuffer, pH = 6,0, met behulp van glazen potten).
      OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar noodzakelijk voor nucleaire antigenen.
   3. Breng op kamertemperatuur en incubeer met primaire antilichamen tegen gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP), doublecortine (Dcx), S100β en β-catenine (zie de materiaaltabel) in een blokkeerbuffer gedurende een nacht bij 4 °C.
   4. Incubeer gedurende 2 uur met secundaire antilichamen in PBS met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) voor nucleaire tegenkleuring bij kamertemperatuur (zie de materiaaltabel).
   5. Monteer de dekglaasjes.

5. Verwerking van geïsoleerde cellen voor immunofluorescentie

1. Plaat de cellen in platen met 96 putjes die compatibel zijn voor microscopie, gecoat met poly-D-lysine (100 μg/ml).
2. Fixeer de cellen 10 min in ijskoude 2% PFA en was 3x met PBS.
3. Voer immunofluorescentie uit met behulp van standaardprocedures^3,7 voor PDGFRα, GFAP, Dcx^, SOX2 en ID3 (zie de materiaaltabel).
4. Bewaar de cellen in PBS + NaN₃ (0,1%) bij 4 °C in het donker.

6. Microscopie en beeldanalyse

1. Maak foto's met behulp van epifluorescentie of confocale microscopie en voer celtellingen uit met behulp van standaard softwaretools voor beeldanalyse, zoals celtellers.

Resultaten

Vrijgave en verzameling van NSC's
NSC's van de SEZ worden alleen van de CSF gescheiden door de monolaag van ependymale cellen, hoewel ze in direct contact blijven met de ventriculaire inhoud via intercalerende monociliated processen ^8,9. Neuraminidase werkt specifiek in op ependymale cellen via splitsing van siaalzuurresiduen en kan denudatie van de ventriculaire wand induceren. Dit leidt tot clustering van neuroblasten op het oppervlak van het ventrikel^10,11. Bovendien is een stroom van neuroblasten waargenomen in de liquor na de i.c.v.-injectie van een integrine-β1-blokkerend antilichaam, waarschijnlijk als gevolg van loskomen van de inter-ependymale celverbindingen¹². Deze waarnemingen hebben geleid tot de ontwikkeling van een protocol dat de isolatie van de stam- en voorlopercellen van de hersenen mogelijk maakt via een gecontroleerde aantasting van de integriteit van de wanden van de laterale ventrikel. In een eerste stap worden de afgifte van het parenchym en de daaropvolgende stroom van NSC's of OPC's in de CSF geïnduceerd via i.c.v. injectie van de afgiftecocktail. De cocktail wordt stereotaxisch geïnjecteerd met een snelheid van 1 μL/min, bilateraal (2 μL per injectie) in de laterale ventrikels (coördinaten gericht op SEZ NSC's: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; coördinaten gericht op CC OPC's: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). De tweede stap ("verzameling") omvat het uitvoeren van vloeibare ciopsieën uit de cisterna magna. De ratten moeten worden verdoofd en de biopsie kan worden gedaan met spuiten van 1 ml. Het gebruik van het stereotaxische apparaat maakt het bijna volledig mogelijk om ongeveer 100 μL CSF op te halen, zonder dat er incisies nodig zijn. De vloeibare biopsie wordt toegevoegd aan ijskweekmedium en wordt gedurende <3 uur op 4 °C bewaard tot uitplating (NSC-kweekmedium bevat Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium [DMEM], B27-supplement [2%], N2-supplement [1%], FGF2 [20 ng/ml] en epidermale groeifactor [EGF; 20 ng/ml]).

Histologische beoordeling van het periventriculaire gebied na de injectie van de releasecocktail
Een eerste cohort van experimenten toonde aan dat bij het injecteren van meer dan 3 μL vloeistof, de ventrikels beschadigd konden raken als gevolg van niet-specifiek, mechanisch letsel (Figuur 2B,C). De langzame injectie van 2 μL afgiftecocktail leidde tot het ontstaan van clusters van Dcx-immunopositieve neuroblasten aan het ventriculaire oppervlak. Deze clusters bleven zelfs 8 maanden na injectie zichtbaar (Figuur 2D). Omdat de methode bedoeld was voor longitudinale studies, gericht op langdurige follow-up van de dieren, werd de weefselschade veroorzaakt door de introductiecocktail beoordeeld. Immunokleuring werd uitgevoerd op 14 μm dikke cryostatische hersensecties voor ependymale celmarkers, zoals S100β en β-catenine¹³, en de algehele integriteit van de ependymale laag werd beoordeeld. De plaatsen van denudatie van de ependymale laag waren alleen aanwezig in de buurt van het rostrocaudale niveau van de injecties, met een geleidelijke afname van de verstoringen van de ependymale laag die werden gedetecteerd op meer posterieure en meer anterieure gebieden van de SEZ (figuur 2E,F) en afwezig werden na een afstand van ±2 mm van de injectieplaats. De bovengenoemde resultaten tonen aan dat de gedeeltelijke denudatie van de ependymale laag veroorzaakt door i.c.v. injectie van de afgiftecocktail focaal is, beperkt in de nabijheid van de injectieplaats, en de rest van de periventriculaire ependymale laag intact laat.

Markerprofiel en in vitro gedrag van verzamelde cellen
Vervolgens werden het in vitro gedrag en het markerprofiel van de cellen die via het melkprotocol werden geïsoleerd beoordeeld. De gemiddelde celopbrengst van elke vloeibare biopsie is ongeveer 300 ± 45 cellen (per biopsie van 100 μL)⁷. Melkbiopten resulteerden in NSC-culturen met een gemiddelde van 3,17 ± 0,45 doorgangspotentieel. Cellen geïsoleerd uit ratten met zoutoplossing konden gemiddeld 1,92 ± 0,76 keer worden gepasseerd; daarentegen bereikten degenen die via het melken werden geïsoleerd zelfs negen passages (p = 0,038, t-test) (Figuur 3A)⁷. De gemiddelde passeercapaciteit van standaard postmortem, SEZ-afgeleide neurosfeerculturen is hoger dan 12 passages in onze handen. Omdat is aangetoond dat het in vivo expansiepotentieel van SEZ NSC's, zoals onthuld door in vivo experimenten met het in kaart brengen van het lot van cellen¹⁴, beperkt is gebleken, produceert melken cellen met significant ander in vitro gedrag dan dat van cellen in standaardculturen, zij het veel dichter bij het gedrag van endogene NSC's. Verzamelde cellen werden geplateerd op poly-D-lysine-gecoate putjes, waar ze zowel als aanhangende monolagen groeiden als, zeldzamer, als neurosferen (Figuur 3B). Vers geïsoleerde cellen (verzameld 3 dagen na injectie en 24 uur na plating gefixeerd) die immunopositief waren voor de astrogliale marker GFAP waren ook immunopositief voor ID3, een marker van rust, en hadden de karakteristiek voor NSC bipolaire morfologie (Figuur 3C). Bovendien, zoals eerder gerapporteerd⁷, toonde een meer gedetailleerde immunocytochemische vergelijking van van biopsie afgeleide cellen en van postmortale cellen van dezelfde dieren, 3 dagen na injectie (op zoek naar GFAP+-astrocyten, Dcx+-neuroblasten, PDGFRa+-oligodendrocytenvoorlopercellen en SOX2+-cellen van de neurale lijn) aan dat het profiel van verzamelde cellen vergelijkbaar was met dat van endogene SEZ-cellen (Figuur 3D). Met name toen biopsie- en weefselcellen werden vergeleken in verschillende omstandigheden (bijv. injectie van een afgiftecocktail met en zonder FGF2), bleek dat de groeifactor resulteerde in een gelijktijdige en significante toename van de aanwezigheid van SOX2+-cellen, evenals in een significante afname van de aanwezigheid van Dcx+-neuroblasten in beide monsters (Figuur 3D). Deze gegevens bevestigden dat eventuele veranderingen in het profiel van endogene populaties van NSC's worden weerspiegeld in door melken gegenereerde celmonsters.

Figuur 1: Grafisch overzicht van het melken. Een coronale doorsnede van één hersenhelft met de belangrijkste anatomische oriëntatiepunten (het laterale ventrikel, het bovenliggende corpus callosum en de voorste commissuur eronder [witte stofbanen in grijs], en de subependymale zone bij de laterale wanden [in blauw]). De afgiftecocktail wordt geïnjecteerd in het laterale ventrikel, wat leidt tot aantasting van de integriteit van het weefsel en het vrijkomen van postnatale neurale hersenstamcellen in het hersenvocht, waaruit ze kunnen worden verzameld via vloeibare biopten. Afkortingen: SEZ = subependymale zone; LV = laterale ventrikel; CSF = hersenvocht; pbNSC's = postnatale neurale stamcellen van de hersenen; β1-int = bèta1 integrine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Histologische beoordeling van de effecten van i.c.v. injecties. (A-D) Beelden met een lage vergroting van de dorsale helft van het laterale ventrikel na immunokleuring voor Dcx (in rood, om neuroblasten te markeren). (A) Het eenvoudig inbrengen van een Hamilton-spuit verstoort de cyto-architectuur van de SEZ niet, terwijl de infuusinjectie van 10 ml (infusiesnelheid van 1 ml/min) leidt tot ernstige beschadiging van de ventrikelwand, ongeacht de inhoud ervan. (B) Zoutoplossing en (C) afgiftecocktail. (D) De injectie van 2 μL van de afgiftecocktail leidt tot een gecontroleerde aantasting van de ventrikelwand, die zelfs 8 maanden na de operatie wordt waargenomen. Hogere vergrotingsdetails van de wand van de SEZ 7 en 14 dagen na injectie worden weergegeven in respectievelijk (E) en (F). Er is een ongeorganiseerde structuur, met Dcx+ neuroblasten (in groen) die op het oppervlak van de wand rusten en de andere cellen van de nis (Sox2+, in wit) die dieper rusten. Het periventriculaire weefsel is beschadigd op het rostrocaudale niveau van de injectie op het tijdstip van 2 maanden (in G), terwijl het weefsel intact is op een meer caudaal niveau (in H) bij hetzelfde dier. De ventriculaire wand wordt beoordeeld door middel van immunokleuring voor ependymale markers S100β en β-catenine. Detail van de typische architectuur van de muur is weergegeven in (I). Nucleaire kleuring wordt uitgevoerd met behulp van DAPI (weergegeven in blauw). Schaalbalken = 300 μm (A-C,G,H, inzetstukken), 150 μm (D), 30 μm (E,F) en 50 μm (I). Dit cijfer is aangepast aan McClenahan et ^al.13. Afkortingen: SEZ = subependymale zone; i.c.v = intracerebroventricular; Dcx = doublecortin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Beoordeling van de cellen die via het melken zijn geïsoleerd. (A) Grafiek met het maximale aantal passages dat per vloeibaar biopsiemonster is verkregen van dieren die met zoutoplossing zijn geïnjecteerd (grijze balken, in totaal 12 monsters) of na het melken (zwarte balken, in totaal 29 monsters, afgiftecocktail met neuraminidase en integrine-β1-blokkerend antilichaam). (B) Representatief confocaal microscopiebeeld van primaire cellen verkregen via melken, 3 dagen na injectie, immunogekleurd tegen GFAP en ID3. (C,D) Helderveldbeelden van cellen die 3 dagen na injectie zijn geïsoleerd, op poly-D-lysine-gecoate putjes zijn geplateerd en gedurende 7 dagen in NSC-proliferatiemedium hebben mogen groeien. (E) Grafiek met het celtypeprofiel van cellen die zijn geïsoleerd door het melken van de SEZ en van de endogene populatie van SEZ-NSC's van dezelfde proefdieren. De SOX2+- en de Dcx+-fracties waren respectievelijk significant verhoogd en verlaagd na de gelijktijdige injectie van FGF2. (Eenrichtings-ANOVA-analyse per marker, gevolgd door post-hocanalyse; n = 4-6 dieren per experimentele groep.) Schaalbalken = 100 μm (C,D) en 10 μm (B). Dit cijfer is aangepast aan McClenahan et ^al.13. Afkortingen: SEZ = subependymale zone; DPI = dagen na injectie; NSC = neurale stamcellen; Dcx = doublecortin; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Stam- en voorlopercellen zijn relatief schaars in hersenweefsel van zoogdieren. Bovendien bevinden NSC's zich in gebieden die niet toegankelijk zijn voor gemakkelijke en veilige biopsieën (ventriculaire wanden, hippocampus). Daarom is de enige manier om experimenteel met dergelijke cellen te werken, tot nu toe, hun postmortale isolatie geweest. Een methode die het mogelijk maakt om NSC's en OPC's van levende ratten enkelvoudig of herhaaldelijk te verzamelen, genaamd melken, wordt hier stap voor stap beschreven. De methode is gebaseerd op twee belangrijke kenmerken: i) NSC's of OPC's worden gescheiden door de ependymale celmonolaag van de CSF, die in het ventriculaire systeem van de hersenen stroomt; ii) Ependymale cellen en neurale voorlopercellen houden contact tussen hen en met andere naburige celtypen via integrinen. Daarom bevat de afgiftecocktail die in specifieke delen van de ventrikels wordt geïnjecteerd om de loskoppeling van NSC's, of OPC's, uit het hersenparenchym mogelijk te maken, neuraminidase, een toxine dat zich specifiek richt op ependymale cellen^10,11 en deze doodt^, en een integrine-β1-blokkerend antilichaam. Het bevat ook FGF2, omdat deze groeifactor essentieel is voor het voortbestaan en het behoud van NSC's in de niche en in cultuur^15,16. Eerder is aangetoond⁷ dat dit protocol goed wordt verdragen door de dieren; in dit rapport wordt verder bevestigd dat de schade aan ependymale cellen, veroorzaakt door de afgiftecocktail als voorwaarde voor de afgifte van NSC's/OPC's in de liquor van de liquor beperkt is rond het rostrocaudale niveau van de injectie. Dit was van cruciaal belang, omdat het protocol de homeostatische functie van de hersenen moet behouden, inclusief de stamcelniche zelf, en het welzijn van de dieren op lange termijn niet in gevaar mag brengen. De stereotaxische injectie van de afgiftecocktail is van milde ernst en heeft nooit tot de dood geleid. Bovendien is het uitvoeren van vloeibare biopsieën uit de cisterna magna een snelle en minimaal invasieve procedure die meerdere keren achter elkaar kan worden herhaald.

Belangrijk is dat de NSC-monsters die via melken worden geïsoleerd, nauw aansluiten bij de endogene pool van NSC's. Het profiel van SEZ-voorlopercellen kan worden beïnvloed door de i.c.v. injectie van FGF2. Wanneer dit gebeurt, wordt het profiel van van melken afgeleide cellen op dezelfde manier beïnvloed. Bovendien heeft eerder experimenteel werk aangetoond dat NSC's die zijn geïsoleerd via het melken van de SEZ een beperkt zelfvernieuwingspotentieel hebben, een gedrag dat vergelijkbaar is met dat van endogene NSC's, zoals onthuld met in vivo, transgene, cel-lotstrategieën^14,17. Postnatale hersen-NSC's worden in rust vastgehouden en gaan zelden over in de richting van mitotische activering om neurogene en gliogene nakomelingen te genereren^18,19,20. Hier wordt bewijs geleverd dat de fractie van van melken afgeleide cellen die GFAP tot expressie brengen en naar verwachting bonafide NSC's bevatten, samen ID3 tot expressie brengen, een marker van slapende NSC's²¹. De verrijkte aanwezigheid van slapende NSC's, die vervolgens worden geplateerd in het NSC-medium dat doorgaans wordt gebruikt voor de kweek van NSC's die postmortaal geïsoleerd zijn, lijkt het expansiepotentieel van verzamelde NSC's te beperken (bijvoorbeeld een proces dat cruciaal is als cellen zouden worden gebruikt voor autologe transplantaties). Dit komt omdat deze media specifiek zijn ontworpen voor de overleving en mitotische expansie van geactiveerde NSC's; dus het genereren van protocollen die de efficiënte en snelle mitotische activering van slapende NSC's mogelijk maken, zal de waarde en het toepassingsgebied van melken vergroten.

Over het algemeen geven deze gegevens aan dat melken het mogelijk maakt om postnatale hersen-NSC's en OPC's te bemonsteren (afhankelijk van het rostrocaudale niveau van het injecteren van de afgiftecocktail) van levende ratten. Dit werk geeft de haalbaarheid aan van het uitvoeren van opeenvolgende vloeibare biopsieën in hetzelfde dier, zelfs op aanzienlijke tijdsduur na injectie van de afgiftecocktail (dus om longitudinale experimentele studies te plannen en uit te voeren), aangezien neuroblasten geclusterd blijven op de ventriculaire wanden, zelfs 8 maanden na injectie. Dergelijke methoden zijn van cruciaal belang omdat ze het mogelijk maken om gebeurtenissen bij individuele dieren te onderzoeken, wat resulteert in minder biologische ruis die wordt gegenereerd door fysiologische variatie. Dit leidt op zijn beurt tot een grotere nauwkeurigheid en tot de implementatie van de principes van de "3V's" (vervanging, vermindering en verfijning). Toekomstige belangrijke stappen voor de verbetering van de methode zijn de bepaling van het maximale aantal en het tijdsbestek dat vloeibare biopsieën kunnen worden uitgevoerd na één afgifteprocedure, hoewel de uitvoering van aanvullende vrijgaveprocedures haalbaar moet zijn, indien nodig.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear, size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX