Een methode voor de isolatie van neurale stamcellen en oligodendrocytenvoorlopercellen uit de hersenen van levende ratten wordt hier in experimenteel detail gepresenteerd. Het maakt meerdere verzamelingen van deze cellen van dezelfde dieren mogelijk zonder hun welzijn in gevaar te brengen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De "Brain Milking"-methode voor de isolatie van neurale stamcellen en voorlopercellen van oligodendrocyten uit levende ratten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Weefselspecifieke neurale stamcellen (NSC's) blijven actief in de postnatale hersenen van zoogdieren. Ze bevinden zich in gespecialiseerde niches, waar ze nieuwe neuronen en glia genereren. Een van die niches is de subependymale zone (SEZ; ook wel de ventriculair-subventriculaire zone genoemd), die zich over de laterale wanden van de laterale ventrikels bevindt, grenzend aan de ependymale cellaag. Oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC's) zijn overvloedig verspreid over het centrale zenuwstelsel en vormen een pool van proliferatieve voorlopercellen die oligodendrocyten kunnen genereren.
Zowel NSC's als OPC's vertonen zelfvernieuwingspotentieel en rust-/activeringscycli. Vanwege hun locatie wordt het isolement en experimenteel onderzoek van deze cellen postmortaal uitgevoerd. Hier beschrijven we in detail "hersenmelken", een methode voor het isoleren van NSC's en OPC's, naast andere cellen, uit levende dieren. Dit is een protocol in twee stappen dat is ontworpen voor gebruik bij knaagdieren en is getest bij ratten. Eerst worden cellen "vrijgemaakt" uit het weefsel via stereotactische intracerebroventriculaire (i.c.v.) injectie van een "release cocktail". De belangrijkste componenten zijn neuraminidase, dat zich richt op ependymale cellen en ventriculaire wanddenudatie induceert, een integrine-β1-blokkerend antilichaam en fibroblastgroeifactor-2. Bij een tweede "verzamelingsstap" worden vloeibare biopsieën van hersenvocht uitgevoerd vanuit de cisterna magna, bij verdoofde ratten zonder dat een incisie nodig is.
De hier gepresenteerde resultaten laten zien dat geïsoleerde cellen hun endogene profiel behouden en dat NSC's van de SEZ hun rust behouden. De denudatie van de ependymale laag is beperkt tot het anatomische niveau van injectie en het protocol (vrijgave en verzameling) wordt goed verdragen door de dieren. Deze nieuwe benadering maakt de weg vrij voor het uitvoeren van longitudinale studies van endogene neurogenese en gliogenese bij proefdieren.
Inleiding
Weefselspecifieke stamcellen zijn gedeeltelijk geëngageerde cellen die aanleiding kunnen geven tot alle celpopulaties waaruit de respectieve weefsels bestaan. Behalve dat ze multipotent zijn, zijn het zelfvernieuwende cellen en cruciaal voor het behoud van de homeostase en het regeneratieve vermogen vanweefsels1. Sommige weefselspecifieke stamcellen blijven in een actieve, sterk proliferatieve toestand, zoals intestinale of hematopoëtische stamcellen. Andere, zoals hersenstamcellen, blijven grotendeels rustig of slapend2. In het volwassen brein zijn neurale stamcellen (NSC's) te vinden in gespecialiseerde gebieden, vaak niches genoemd. Twee van dergelijke goed beschreven gebieden bestaan in de subependymale zone (SEZ) van de laterale ventrikels en in de gyrus dentatus van de hippocampus. De SEZ-niche genereert het hoogste aantal cellen, voornamelijk neuroblasten die naar de bulbus olfactorius migreren en bijdragen aan de lokale interneuronpopulatie; daarentegen migreren gegenereerde oligodendroblasten naar het aangrenzende corpus callosum (CC)3. Oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC's) zijn mitotisch actieve cellen, wijd verspreid over het centrale zenuwstelsel, die: i) toegewijd zijn aan de oligodendrogliale afstamming, ii) kunnen migreren naar plaatsen van demyelinisatie en iii) kunnen differentiëren tot myeliniserende oligodendrocyten. OPC's vertonen ook zelfvernieuwingspotentieel en rust4.
Tot nu toe vereiste de isolatie en studie van NSC's en OPC's postmortale dissociatie van het ontlede hersen- en ruggenmergweefsel. Om deze experimentele beperking te omzeilen, hebben we een methode ontwikkeld die voor het eerst de isolatie van hersen-NSC's en OPC's van levende dieren mogelijk maakt. We noemen deze methode "melken", omdat het meerdere verzamelingen van cellen mogelijk maakt omdat hun poelen niet uitgeput raken. Het protocol is ontwikkeld bij ratten, vanwege hun grote hersenomvang, voornamelijk gericht op de SEZ, of de CC, en omvat twee belangrijke stappen. Eerst worden NSC's of OPC's uit het weefsel "verwijderd" via i.c.v. injectie van een "release cocktail" die neuraminidase bevat, een toxine dat ventriculaire wanddenudatie induceert, een integrine-β1-blokkerend antilichaam en fibroblastgroeifactor 2 (FGF2). De cocktail wordt stereotaxisch bilateraal geïnjecteerd in de laterale ventrikels. Als het beoogde gebruik de isolatie van NSC's is, zijn rostrale gebieden van de laterale ventrikels het doelwit. Als het doel is om OPC's zuiverder te isoleren, wordt de cocktail caudaal geïnjecteerd in het gebied van de hippocampusfimbrie. Bij een tweede "verzamelingsstap" worden vloeibare biopsieën van cerebrospinale vloeistof (CSF) uitgevoerd vanuit de cisterna magna van verdoofde ratten, zonder dat een incisie nodig is. De vloeibare biopsie wordt gemengd met NSC-kweekmedium en kan tot het uitplateren bij 4 °C worden bewaard.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De fokkerij, het onderhoud en de experimentele procedures voor dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, geautoriseerd door het ministerie van Binnenlandse Zaken, en met het presidentieel decreet 56/2013 van de Helleense Republiek, onderzocht door de Animal Welfare and Ethical Review Bodies van de universiteiten van Cambridge en Patras, evenals goedgekeurd en onderzocht door de lokale prefecturale commissie voor dierenverzorging en -gebruik (protocolnummer: 5675/39/18-01-2021). Mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley-, Wistar- en Long-Evans-ratten, met leeftijden variërend tussen 2 en 4 maanden en met een lichaamsgewicht tussen 150 g en 250 g, werden gebruikt. Het protocol is grafisch samengevat in figuur 1.
1. Laat de cocktailbereiding los
NOTITIE: Vers bereiden op de dag van de procedure en bewaren op ijs. De hoeveelheden worden gegeven per 2 μL die i.c.v. in elke laterale ventrikel moet worden geïnjecteerd. Bereid een extra 1 μL per beoogde injectie.
- Bereid 0,5 μl neuraminidase van 500 mU uit Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
OPMERKING: Bewaar dit als een bouillon van 1 E/μL verdund in steriel water bij -20 °C. Andere soorten neuraminidasen zijn niet getest. - Bereid 1 μL met 1 μg integrine-β1-blokkerend antilichaam.
NOTITIE: Bewaar het bij 4 °C. - Bereid 0,5 μl met 0,5 μg basisch fibroblastgroeifactor (recombinant humaan FGF-basisch).
OPMERKING: Bewaar het als een bouillon van 1 μg/μL verdund in steriel water bij -20 °C.
2. Injectie van afgiftecocktail
NOTITIE: Het hele proces kan binnen 20 minuten worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat u de operatie in aseptische omstandigheden uitvoert. Reinig alle oppervlakken met een antisepticum (bijv. 3% of 6% waterstofperoxide). Gebruik geautoclaveerd of gemakkelijk steriel gereedschap, handschoenen, jassen en gordijnen.
- Verdoof het proefdier door inhalatie van isofluraan (2,5% voor inductie en 2% voor onderhoud). Bevestig de diepte van de anesthesie door de hoornvliesreflex, de reactie op stimuli (achterpoot- en staartknijptest) en de manier van ademen te controleren.
OPMERKING: Chirurgische ingrepen kunnen worden uitgevoerd onder algemene anesthesie geïnduceerd door intraperitoneaal injecteerbare anesthesie (bijv. ketamine [40 mg/kg] en xylazine [10 mg/kg]). Diepe anesthesie werd bevestigd door het controleren van de hoornvliesreflex, de reactie op stimuli (achterpoot- en staartknijptest) en de manier van ademen. - Analgesie subcutaan toedienen (bijv. 0,3 mg/ml buprenorfine) bij inductie van anesthesie.
- Monteer de rat op het stereotaxische frame.
- Scheer de vacht van het hoofd met een scheermes en reinig de huid met antisepticum, zoals 10% povidon-jodiumoplossing en vervolgens alcohol. Breng het antisepticum driemaal aan met steriele wattenstaafjes. Wrijf elke keer in een cirkelvormige beweging gedurende 3-5 s. Breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen.
- Maak een incisie van 2 cm in de huid van het hoofd langs de middellijn met behulp van een steriel scalpel.
- Maak de schedel zorgvuldig schoon met behulp van steriele wattenstaafjes en steriele zoutoplossing.
- Identificeer het bregma met behulp van de rand van de naald van een 10 μL Hamilton-spuit die op het stereotaxische apparaat is gemonteerd. Stel de bregma in op "punt 0,0".
OPMERKING: Het bregma wordt geïdentificeerd als het snijpunt tussen de sagittale en de coronale hechtingen. Meer details zijn te vinden in de rattenhersenatlas van Paxinos en Watson5. - Verplaats het apparaat naar de coördinaten anterioposterior (AP) = 0.3 mm, lateraal (L) = +1.2 mm (om de SEZ te richten) of AP = 1.5 mm, L = +2.0 mm (om de CC te richten).
- Boor een braamgat van 1 mm met een tandartsboor.
NOTITIE: Als u met de hand boort, zorg er dan voor dat u het corticale oppervlak niet beschadigt. De bloeding zal naar verwachting niet aanzienlijk zijn. Verwijder eventueel bloed met zoutoplossing en oefen druk uit om hardnekkiger bloeden te stoppen. - Laad 4 μL van de afgiftecocktail in de 10 μL Hamilton-spuit.
- Laat de naald (bij voorkeur stompe of conische rand) van de Hamilton-spuit zakken om in contact te komen met de dura.
- Steek de naald in op de gewenste diepte (D = 3,5 mm).
NOTITIE: Giet zoutoplossing op het oppervlak van de dura om het weefsel gehydrateerd te houden. - Laat 2 μL van de afgiftecocktail trekken met een snelheid van 1 μL/min.
- Laat de naald nog 2 minuten op zijn plaats voordat u hem langzaam ophaalt om te voorkomen dat de vrijgavecocktail aan de oppervlakte komt.
- Herhaal stap 2.8-2.14 voor het andere halfrond op de coördinaten AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (om de SEZ te richten), of AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (om de CC te richten).
- Hecht de incisie met 5-0 nylon (diameter 0,1 mm) en reinig het gehechte gebied met een antisepticum.
- Verwijder het masker dat de verdoving toedient en breng het dier over naar de controleruimte na de operatie.
OPMERKING: Herstel van anesthesie en behoud van liggedrag zou binnen 5-10 minuten moeten plaatsvinden en volledig herstel (normaal gedrag) binnen 25 minuten.- Houd het herstel nauwlettend in de gaten (levendige en ononderbroken beweging, frequente toegang tot water) in een goed verwarmde (24-25 °C), stille ruimte zonder beddengoed met kleine deeltjes, die de luchtwegen kunnen blokkeren. Breng het dier pas terug naar het gezelschap van zijn kooigenoten (niet naar nieuwe dieren) nadat volledig herstel is bevestigd.
- Bewaak het dier gedurende ten minste 48 uur na de operatie in de onderhoudsfaciliteit. Tekenen van pijn aanpakken (verbergen van het hoofd, abnormale hoofd- of lichaamshouding, overgevoeligheid en hyperexcitabiliteit voor hantering) door analgesie toe te dienen (bijv. 0,3 mg/ml buprenorfine, subcutaan). Verwijs dieren met een verkleurde of opgezette vacht door naar de verantwoordelijke dierenarts.
3. Cerebrospinale vloeistof (CSF) vloeibare biopsie
NOTITIE: Het hele proces kan binnen 10 minuten worden uitgevoerd. De hier beschreven vloeibare biopsie wordt 3 dagen na injectie van de afgiftecocktail uitgevoerd, maar kan indien nodig op precies dezelfde manier worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat u de operatie in aseptische omstandigheden uitvoert. Reinig alle oppervlakken met een antisepticum (bijv. 3% of 6% waterstofperoxide). Gebruik geautoclaveerd of gemakkelijk steriel gereedschap, handschoenen, jassen en gordijnen.
- Verdoof het dier door inhalatie van isofluraan (2,5% voor inductie en 2% voor onderhoud). Bevestig de diepte van de anesthesie door het hoornvlies te controleren
reflex, de reactie op prikkels (achterpoot- en staartknijptest) en de wijze van ademen.
OPMERKING: De chirurgische ingrepen kunnen worden uitgevoerd onder algemene anesthesie geïnduceerd door intraperitoneaal injecteerbare anesthesie (bijv. ketamine [40 mg/kg] en xylazine [10 mg/kg]). Dit is echter niet aan te raden omdat de procedure kort is, vooral als biopsieën meerdere keren op opeenvolgende dagen worden uitgevoerd. - Analgesie subcutaan toedienen (bijv. 0,3 mg/ml buprenorfine) bij inductie van anesthesie.
- Monteer het proefdier op het stereotaxische frame. Gebruik oorkappen om het hoofd vast te zetten zonder de rotatiebeweging naar voren en naar achteren te belemmeren.
- Stabiliseer het hoofd in een neerwaartse hoek van 40°, zodat een goede extensie van de achterkant van de nek kan worden bereikt.
NOTITIE: Een manier om dit te doen is door de mondstang van het apparaat6 te gebruiken. - Scheer de vacht in de nek met een scheermes en reinig de huid met antisepticum, zoals 10% povidon-jodiumoplossing en vervolgens alcohol. Breng het antisepticum driemaal aan met steriele wattenstaafjes. Wrijf elke keer in een cirkelvormige beweging gedurende 3-5 s.
- Zoek met de vingertop het ruitvormige indrukbare gebied tussen het occipitale uitsteeksel en de wervelkolom van de atlas6.
- Teken een puntmarkering (bijvoorbeeld met een stift).
- Bevestig een spuit van 1 ml of 0,5 ml op het stereotaxische frame.
OPMERKING: Het is raadzaam om spuiten te gebruiken met niet-verwijderbare naalden, omdat deze een betere zuigkracht produceren en minder dood volume hebben. - Breng de naald op het contactpunt met de huid bij de puntmarkering.
- Til de huid met een pincet op terwijl u de spuit door de huidlagen laat zakken.
- Trek de zuiger iets terug om onderdruk in de spuit te genereren.
- Start opnieuw om de naald heel langzaam onder te dompelen totdat er vloeistof (CSF) in de spuit verschijnt.
- Zet de naald op deze positie en laat de langzame stroom van CSF toe.
NOTITIE: De naald kan iets worden verlaagd of verhoogd als de CSF-stroom erg traag is. - Begin langzaam met het verwijderen van de CSF (in stappen van 40 μL/min) tot 120 μL.
- Haal de spuit langzaam terug.
- Intraperitoneaal 1 ml normaal serum toedienen ter ondersteuning van de aanvulling van het vocht door het proefdier.
- Meng de vloeibare biopsie (CSF) met 400 μL NSC-medium en houd de microcentrifugebuis op 4 °C tot verder gebruik.
OPMERKING: Vloeibare biopsieën moeten binnen 3 uur worden verwerkt als ze niet zijn ingevroren. - Verwijder het masker dat de verdoving toedient en breng het dier over naar de bewakingsruimte na de operatie.
OPMERKING: Herstel van anesthesie en behoud van liggedrag zou binnen 5-10 minuten moeten plaatsvinden en volledig herstel (normaal gedrag) binnen 25 minuten.- Houd het herstel nauwlettend in de gaten (levendige en ononderbroken beweging, frequente toegang tot water) in een goed verwarmde (24-25 °C), stille ruimte zonder beddengoed met kleine deeltjes, die de luchtwegen kunnen blokkeren. Breng het dier pas terug naar het gezelschap van zijn kooigenoten (niet naar nieuwe dieren) nadat volledig herstel is bevestigd.
- Bewaak het dier gedurende ten minste 48 uur na de operatie in de onderhoudsfaciliteit. Als er tekenen van pijn worden waargenomen (verbergen van het hoofd, abnormale hoofd- of lichaamshouding, overgevoeligheid en hyperexcitabiliteit voor hantering), moet analgesie worden toegediend (bijv. 0,3 mg/ml buprenorfine subcutaan). Verwijs dieren met een verkleurde of opgezette vacht door naar de verantwoordelijke dierenarts.
4. Verwerking van weefsel voor immunofluorescentie
- Euthanaseer het dier door intracardiale infusie van 20 ml ijskoude zoutoplossing, gevolgd door 50 ml ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA; in fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS] met pH = 7,4).
- Ontleed het hersenweefsel.
- Scheid het hoofd van het lichaam met een schaar om een snee in het cervicale gebied te maken. Gebruik de schaar om de huid te verwijderen en knip vervolgens het bot van de schedel langs de sagittale middellijn, met de punten van de schaar naar boven gericht om het hersenweefsel niet te beschadigen. Streef ernaar om zoveel mogelijk te blijven snijden en de coronale middellijn te passeren.
- Gebruik een tang om de botten te verwijderen, beginnend bij de supraoccipitale en de pariëtale botten en tenslotte de voorhoofdsbeenderen.
- Zodra het hersenweefsel zichtbaar is, gebruik je de tang of een spatel om het uit de schedel te tillen. Om dit te vergemakkelijken, snijdt u de zenuwen aan de basis van de hersenen en de bulbus olfactorius door, indien niet gewenst.
- Fixeer het weefsel 's nachts in 2% PFA bij 4 °C.
- Cryo-bescherm het weefsel in 30% sucrose (in PBS) gedurende ten minste 48 uur bij 4 °C totdat het weefsel naar de bodem zakt.
- Vries het weefsel in bij -80 °C.
- Snijd het hersenweefsel met een cryostaat in 14 μm dikke coronale secties.
- Voer immunofluorescentiekleuring uit met behulp van standaardprotocollen 3,7
- Incubeer de coupes met blokkeerbuffer (3% runderserumalbumine [BSA], 0,1% Triton X-100, in PBS) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Voer antigeenextractie uit (15 minuten koken in 10 mM citraatbuffer, pH = 6,0, met behulp van glazen potten).
OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar noodzakelijk voor nucleaire antigenen. - Breng op kamertemperatuur en incubeer met primaire antilichamen tegen gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP), doublecortine (Dcx), S100β en β-catenine (zie de materiaaltabel) in een blokkeerbuffer gedurende een nacht bij 4 °C.
- Incubeer gedurende 2 uur met secundaire antilichamen in PBS met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) voor nucleaire tegenkleuring bij kamertemperatuur (zie de materiaaltabel).
- Monteer de dekglaasjes.
5. Verwerking van geïsoleerde cellen voor immunofluorescentie
- Plaat de cellen in platen met 96 putjes die compatibel zijn voor microscopie, gecoat met poly-D-lysine (100 μg/ml).
- Fixeer de cellen 10 min in ijskoude 2% PFA en was 3x met PBS.
- Voer immunofluorescentie uit met behulp van standaardprocedures3,7 voor PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 en ID3 (zie de materiaaltabel).
- Bewaar de cellen in PBS + NaN3 (0,1%) bij 4 °C in het donker.
6. Microscopie en beeldanalyse
- Maak foto's met behulp van epifluorescentie of confocale microscopie en voer celtellingen uit met behulp van standaard softwaretools voor beeldanalyse, zoals celtellers.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vrijgave en verzameling van NSC's
NSC's van de SEZ worden alleen van de CSF gescheiden door de monolaag van ependymale cellen, hoewel ze in direct contact blijven met de ventriculaire inhoud via intercalerende monociliated processen 8,9. Neuraminidase werkt specifiek in op ependymale cellen via splitsing van siaalzuurresiduen en kan denudatie van de ventriculaire wand induceren. Dit leidt tot clustering van neuroblasten op he...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Stam- en voorlopercellen zijn relatief schaars in hersenweefsel van zoogdieren. Bovendien bevinden NSC's zich in gebieden die niet toegankelijk zijn voor gemakkelijke en veilige biopsieën (ventriculaire wanden, hippocampus). Daarom is de enige manier om experimenteel met dergelijke cellen te werken, tot nu toe, hun postmortale isolatie geweest. Een methode die het mogelijk maakt om NSC's en OPC's van levende ratten enkelvoudig of herhaaldelijk te verzamelen, genaamd melken, wordt hier stap voor stap beschreven. De method...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen of andere belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van Action Medical Research (UK) (GN2291) aan R.J.M.F. en I.K. Het onderzoekswerk werd ook gedeeltelijk ondersteund (dierlijke kosten en steun aan D.D.) door de Hellenic Foundation for Research and Innovation (H.F.R.I.) in het kader van de "Eerste oproep voor H.F.R.I.-onderzoeksprojecten ter ondersteuning van faculteitsleden en onderzoekers en de aanschaf van dure onderzoeksapparatuur" (projectnummer: 3395).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear, size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
Referenties
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013).
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
