Hier wordt een eenvoudige en snelle aanpak beschreven voor het uitvoeren van intracerebroventriculaire injecties bij muizen met behulp van een benadering uit de vrije hand (dat wil zeggen zonder stereotaxisch apparaat).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intracerebroventriculaire injecties uit de vrije hand bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het onderzoek van neuro-endocriene systemen vereist vaak de toediening van medicijnen, virussen of andere experimentele middelen rechtstreeks in de hersenen van muizen. Een intracerebroventriculaire (ICV) injectie maakt de wijdverspreide afgifte van het experimentele middel door de hersenen mogelijk (met name in de structuren nabij de ventrikels). Hier worden methoden beschreven voor het maken van ICV-injecties uit de vrije hand bij volwassen muizen. Door gebruik te maken van visuele en tactiele oriëntatiepunten op de hoofden van muizen, kunnen injecties in de laterale ventrikels snel en betrouwbaar worden uitgevoerd. De injecties worden toegediend met een glazen spuit die in de hand van de onderzoeker wordt gehouden en op ongeveer afstand van de oriëntatiepunten wordt geplaatst. Voor deze techniek is dus geen stereotaxisch frame nodig. Bovendien vereist deze techniek slechts een korte isofluraananesthesie, waardoor het gedrag en/of de fysiologie van muizen bij wakkere, zich vrij gedragende muizen achteraf kunnen worden beoordeeld. ICV-injectie uit de vrije hand is een krachtig hulpmiddel voor de efficiënte afgifte van experimentele middelen in de hersenen van levende muizen en kan worden gecombineerd met andere technieken zoals frequente bloedafname, neurale circuitmanipulatie of in vivo opname om neuro-endocriene processen te onderzoeken.
Inleiding
De afgifte van experimentele middelen, zoals geneesmiddelen1, virussen2 of cellen3, aan de hersenen is vaak nodig voor neuro-endocrien onderzoek. Als het middel niet gemakkelijk de bloed-hersenbarrière passeert of als het experimentele doel is om specifiek de centrale effecten van het middel te testen, is het belangrijk om een betrouwbare methode te hebben voor het toedienen van injecties in de hersenen. Bovendien biedt injectie in de intracerebroventriculaire (ICV) ruimte de mogelijkheid om het middel op grote schaal in de hersenen te verspreiden en biedt het een groot doelgebied, waardoor de kans op een succesvolle injectie toeneemt2.
Een veelgebruikte methode voor het maken van ICV-injecties is het plaatsen van een permanente verblijfscanule. Bij deze aanpak is een stereotaxisch frame nodig om de in de handel verkrijgbare of op maat gemaakte canule te positioneren, aangezien de canule op zijn plaats wordt gelijmd of gecementeerd. Vaak wordt bij herstel een suprafysiologische dosis angiotensine II via de canule toegediend en als het drinkgedrag onmiddellijk wordt waargenomen, wordt de canule als correct geplaatstbeschouwd 4. Deze aanpak heeft veel voordelen, waaronder de mogelijkheid om langdurige infusie uit te voeren en de mogelijkheid om hetzelfde dier meerdere keren te injecteren; bovendien, als angiotensine II wordt gebruikt, kan de juiste plaatsing worden bevestigd voorafgaand aan de toediening van experimentele verbindingen. Er zijn echter enkele beperkingen aan het plaatsen van een permanente canule, waaronder de vereiste voor dure apparatuur (stereotaxisch frame), de mogelijkheid van beschadiging van de canule na plaatsing (muizen kunnen bijvoorbeeld op de canule van een kooigenoot kauwen) en de mogelijkheid van infecties rond de permanente canule. Enkelvoudige ICV-injecties kunnen worden gemaakt met behulp van een stereotaxisch frame3, dat, hoewel effectief, aanzienlijke blootstelling aan anesthesie vereist en dus enkele acute fysiologische en gedragseffecten van de behandeling kan verdoezelen. Bovendien vereist de plaatsing van muizen in een stereotaxisch frame een aanzienlijke training om een stabiele plaatsing te bereiken en het scheuren van de gehoorgangen te voorkomen.
Hier wordt een gevestigde methode beschreven voor het maken van injecties uit de vrije hand bij muizen. Deze methode is gebaseerd op eerdere rapporten 5,6. De voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudig en snel is en dat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is, zoals een stereotaxisch frame. Zoals hieronder beschreven, omvat deze procedure het manipuleren van een glazen spuit ten opzichte van oriëntatiepunten op het hoofd van de muis om de injecties uit te voeren, wat snel kan worden gedaan en dus slechts enkele minuten gasanesthesie op de experimentele dag vereist.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Colorado State University (#3960) en de University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committees, waar de representatieve gegevens werden verzameld (S13235, PI Kellie Breen Church). Gegevens van vijf volwassen vrouwelijke en twee volwassen mannelijke C57/BL6-muizen (9-16 weken oud) zijn weergegeven in de sectie representatieve gegevens. Vrouwelijke muizen werden 3-4 weken voorafgaand aan ICV-injectie en bloedafname ovariëctomie toegediend, zoals eerder beschreven7. Voorafgaand aan de experimenten werden deze muizen gehuisvest met een lichtcyclus van 12 uur licht en 12 uur donker en hadden ze vrije toegang tot voer en water in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Craniotomie uitvoeren
OPMERKING: Craniotomie kan een of meer dagen voorafgaand aan de eigenlijke injectie worden uitgevoerd, waardoor het injectieproces op de dag van het experiment sneller verloopt.
- Bereid de materialen voor de craniotomie voor zoals hieronder beschreven.
- Leg een schone onderlegger of drapermateriaal op het werkoppervlak. Plak de neuskegel van een isofluraanverdamper op het werkoppervlak (dicht bij, maar van de onderzoeker af gericht; zie figuur 1A).
- Plaats silastic slang op het uiteinde van een steriele scherpe naald van 18 G zodat ~1 mm van de naaldpunt uitsteekt. Plaats silastic slangetjes op het uiteinde van een steriele stompe naald zodat ~1 mm van de naaldpunt uitsteekt.
OPMERKING: Voor elke muis moeten afzonderlijke en steriele voorverpakte naalden (scherp en stomp) worden gebruikt. - Verzamel een elektrisch scheerapparaat, jodiumscrub, steriel gaas en alcoholdoekjes om de injectieplaats voor te bereiden.
- Oefen met het bewegen van een naald 2 mm lateraal en 1 mm caudaal zoals hieronder beschreven.
- Gebruik een liniaal en een pen om een vel papier te markeren met een beginpunt (dit is bregma), een markering 2 mm naar links of rechts en een andere markering 1 mm boven de laatste (dit is de injectieplaats; zie figuur 1B).
- Oefen met het verplaatsen van de naald van het startpunt naar markeringspunt 1 naar markeringspunt 2 (bregma naar injectieplaats) totdat u er zeker van bent dat de beweging herhaalbaar is zonder geleiders.
OPMERKING: De hier beschreven coördinaten zijn effectief bij volwassen C57/BL6-muizen, maar andere stammen of leeftijdsgroepen kunnen aanpassing vereisen.
- Bereid de muis voor op craniotomie zoals hieronder beschreven.
- Plaats de muis in een inductiekamer en verdoven de muis met 3%-4% isofluraan in zuurstof van medische kwaliteit. Verkort met oefening en vertrouwdheid met de procedure de totale duur van blootstelling aan isofluraan tot minder dan 10 minuten voor de craniotomieprocedure.
LET OP: Blootstelling aan isofluraan is gevaarlijk voor de menselijke gezondheid; Gebruik een goedgekeurde en geïnspecteerde isofluraanverdamper in een goed geventileerde ruimte met middelen om afvalgassen op te vangen. - Zodra de teenreflex afwezig is, scheert u de kop van het dier. Breng oogsmeermiddel aan.
- Plaats de muis op het werkoppervlak met de kop in de neuskegel om de anesthesie te behouden.
- Dien een pijnstillend middel toe, zoals buprenorfine (0,6-0,8 mg/kg lichaamsgewicht van muizen, subcutaan), zoals voorgeschreven door de leverancier.
- Reinig de injectieplaats door het hoofd af te vegen met een steriel gaasje gedrenkt in een jodiumoplossing (voer drie scrubs uit) en veeg vervolgens af met een alcoholscrubpad (drie keer uitvoeren).
OPMERKING: Verwijder de vacht en reinig de huid rond de injectieplaats en gebruik steriele instrumenten en naalden, zoals aanbevolen door de American Veterinary Medical Association om infecties te voorkomen.
- Plaats de muis in een inductiekamer en verdoven de muis met 3%-4% isofluraan in zuurstof van medische kwaliteit. Verkort met oefening en vertrouwdheid met de procedure de totale duur van blootstelling aan isofluraan tot minder dan 10 minuten voor de craniotomieprocedure.
- Houd de kop van de muis stevig vast met de niet-dominante hand. Plaats de kop zo plat mogelijk op het werkoppervlak.
- Lokaliseer de plaats van de injectie.
- Gebruik de voorbereide scherpe naald van 18 G om eerst bregma te identificeren; Sleep hiervoor de naald over de huid van het hoofd langs de middellijn en beweeg in het rostral-caudale vlak. Stel je een gelijkzijdige driehoek voor waarin de twee hoekpunten de ogen zijn en het derde hoekpunt de geschatte locatie van bregma is (zie figuur 1C).
- Beweeg de naald vanuit bregma 2 mm lateraal en 1 mm caudaal naar de injectieplaats.
- Terwijl u de naald verticaal houdt, duwt u de naald stevig door de huid en het bot totdat de slang gelijk ligt met de huid.
- Trek de naald terug, draai de naald en druk opnieuw door de huid en het bot. Herhaal het proces totdat er een klein gaatje in het bot ontstaat.
- Gebruik de stompe naald om te controleren of er voldoende gat in het bot is gemaakt. Probeer een opening in het bot te maken die groot genoeg is om de stompe naald doorheen te laten.
- Haal de muis uit de neuskegel, verwijder al het bloed van de injectieplaats met steriel gaas en plaats de muis in een kooi op een kooiverwarmer totdat hij wakker is. Omdat de opening die door de craniotomie wordt gemaakt klein is (naald van 18 G), hoeft de plaats niet te worden afgesloten met een hechtdraad of wondclips.
OPMERKING: De hier geproduceerde opening is klein (18 G), dus veel instellingen beschouwen deze procedure als een injectie in plaats van een operatie. Bovendien, hoewel er een opening door huid en bot naar de hersenen wordt gemaakt, resulteert het strak houden van de huid erin dat de gaten niet op één lijn liggen, wat waarschijnlijk helpt voorkomen dat huidflora of kooibedekking in contact komt met de hersenen.
2. Het toedienen van de injectie
- Bereid de materialen voor de injectie voor zoals hieronder beschreven.
- Leg een schone onderlegger of drapermateriaal op het werkoppervlak. Plak de neuskegel van een isofluraanverdamper op het werkoppervlak (dicht bij, maar van de onderzoeker af gericht; zie figuur 1A).
- Bevestig een 10 mm lange naald van 27 G met een afschuining van 45° op een glazen spuit van 5 μL. Plaats silastic slang op de naald zodat 3.5 mm van de naaldpunt uitsteekt; gebruik laboratoriumtape om de slang aan het lichaam van de spuit te bevestigen (zie afbeelding 1D).
- Bereid de injectiemedia (geneesmiddel, virus of andere vloeistof voor injectie) voor in een buisje. Voor de representatieve resultaten in deze studie werd steriele isotone zoutoplossing geïnjecteerd.
OPMERKING: Kies een slang die toegankelijk is voor de glazen spuit en naald, zoals een microcentrifugebuis van 2 ml. - Zuig 3 μL injectiemedia op in de glazen spuit. Zuig eerst meer op dan het gewenste volume en verwijder totdat er 3 μL in de spuit achterblijft.
- Verzamel jodiumscrub, steriel gaas en alcoholdoekjes om de injectieplaats voor te bereiden.
- Start een laboratoriumtimer in de optelmodus en plaats de timer zo dat deze zichtbaar is voor de onderzoeker tijdens het toedienen van injecties.
- Oefen met het bewegen van een naald 2 mm lateraal en 1 mm caudaal zoals de vorige dag is uitgevoerd.
- Bereid de muis voor op injectie zoals hieronder beschreven.
- Plaats de muis in de inductiekamer en verdoven de muis met isofluraan. Zodra de teenreflex afwezig is, brengt u oogsmeermiddel aan en plaatst u de muis op het werkoppervlak met het hoofd in de neuskegel.
- Reinig de injectieplaats met drie doekjes jodium en alcohol. Identificeer de injectieplaats met een naald van 18 G (of stompe naald) zoals beschreven in stap 1.8. Het gat dat tijdens de craniotomie is ontstaan, moet detecteerbaar zijn.
OPMERKING: Als de craniotomie niet van tevoren is uitgevoerd, of als het gat in de schedel niet detecteerbaar is, kan de craniotomie hier worden uitgevoerd.
- Voer de injectie uit met een glazen spuit zoals hieronder beschreven.
- Houd de kop van de muis stevig vast met de niet-dominante hand. Plaats de kop zo plat mogelijk op het werkoppervlak.
- Steek de naald van de glazen spuit door het gat in de schedel totdat het slangetje dat over de in stap 2.1.2 voorbereide naald is geplaatst, op de huid van de muis rust.
- Houd de spuit zo verticaal mogelijk en let daarbij op zowel het coronale als het sagittale vlak. Injecteer het medium langzaam gedurende een periode van 1 minuut.
- Houd de spuit en naald nog een minuut op hun plaats na voltooiing van de injectie om terugstroming tot een minimum te beperken. Trek de naald langzaam terug uit de kop van de muis.
- Haal de muis uit de neuskegel, verwijder eventueel bloed van de injectieplaats met steriel gaasje (als dat aanwezig is) en plaats de muis in een kooi op een kooiverwarmer totdat hij wakker is.
3. Bevestiging van de injectieplaats
- Verdoof en doordrenk de muis diep met zoutoplossing en 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zoals eerder beschreven8. Bewaar de hersenen in 30% sucrose in PBS bij 4 °C totdat de hersenen zinken (meestal 2 dagen).
- Snijd coronale secties van 20-50 μm op een cryostaat zoals eerder beschreven9. Observeer tijdens het doorsnijden het injectiekanaal in het weefselblok. Noteer of het injectiekanaal duidelijk de laterale ventrikel snijdt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer deze techniek met succes wordt uitgevoerd, maakt het mogelijk om een experimenteel middel snel in het ventriculaire systeem af te geven. Een luteïniserend hormoon (LH) pulsprofiel van een ovariëctomie van een ovariëctomie die een ICV-injectie van 3 μL steriele isotone zoutoplossing kreeg, het vehikel voor veel farmacologische verbindingen, wordt weergegeven in figuur 2A. Dit voorbeeld toont aan dat korte blootstelling aan gasanesthesie en de injectie van 3 μL vloeistof in het ventric...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een eenvoudige en effectieve manier beschreven voor het maken van ICV-injecties bij muizen. Aangezien deze techniek geen stereotaxisch frame vereist, is deze aanpak voor de centrale toediening van medicijnen en experimentele middelen toegankelijk voor meer onderzoekers. Bovendien heeft deze aanpak een relatief hoge doorvoer, omdat de voorbereidings- en injectieprocedure snel kan worden uitgevoerd.
Aangezien deze procedure de manipulatie van naalden en een glazen spuit met de hand ve...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen Dr. Kellie Breen Church, de heer Michael Kreisman en mevrouw Jessica Jang bedanken voor hun bijdragen aan het verzamelen van de gegevens die in de representatieve resultaten worden getoond. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (RBM).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Gebrekstof |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | Zie ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
Referenties
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
