Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

4.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65328

⸱

12 mei 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cardiovascular Disease & Nutrition, U1263, Aix-Marseille University, 2Marseille Medical Genetics, U1251, Aix-Marseille University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Samenvatting

Het zich ontwikkelende hart is een complexe structuur die verschillende voorlopercellen bevat die worden bestuurd door complexe regulerende mechanismen. Het onderzoek van de genexpressie en chromatinetoestand van individuele cellen maakt de identificatie van het celtype en de toestand mogelijk. Single-cell sequencing benaderingen hebben een aantal belangrijke kenmerken van cardiale voorlopercel heterogeniteit onthuld. Deze methoden zijn echter over het algemeen beperkt tot vers weefsel, wat studies met verschillende experimentele omstandigheden beperkt, omdat het verse weefsel in één keer in dezelfde run moet worden verwerkt om de technische variabiliteit te verminderen. Daarom zijn eenvoudige en flexibele procedures nodig om gegevens te produceren van methoden zoals single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (snATAC-seq) in dit gebied. Hier presenteren we een protocol om kernen snel te isoleren voor volgende single-nuclei dual-omics (gecombineerde snRNA-seq en snATAC-seq). Deze methode maakt de isolatie van kernen uit bevroren monsters van cardiale voorlopercellen mogelijk en kan worden gecombineerd met platforms die microfluïdische kamers gebruiken.

Inleiding

Onder geboorteafwijkingen zijn aangeboren hartafwijkingen (CHD's) de meest voorkomende, die voorkomen bij ongeveer 1% van de levendgeborenen per jaar 1,2. Genetische mutaties worden slechts in een minderheid van de gevallen geïdentificeerd, wat impliceert dat andere oorzaken, zoals afwijkingen in genregulatie, betrokken zijn bij de etiologie van CHD 2,3. Cardiale ontwikkeling is een complex proces van diverse en op elkaar inwerkende celtypen, waardoor de identificatie van causale niet-coderende mutaties en hun effecten op genregulatie een uitdaging vormen. Organogenese van het hart begint met cellulaire voorlopers die aanleiding geven tot verschillende subtypen hartcellen, waaronder myocardiale, fibroblast-, epicardiale en endocardiale cellen 4,5. Single-cell genomics is in opkomst als een belangrijke methode voor het bestuderen van de ontwikkeling van het hart en het beoordelen van de impact van cellulaire heterogeniteit op gezondheid en ziekte6. De ontwikkeling van multi-omics-methoden voor de gelijktijdige meting van verschillende parameters en de uitbreiding van computationele pijplijnen heeft de ontdekking van celtypen en subtypen in het normale en zieke hart vergemakkelijkt6. Dit artikel beschrijft een betrouwbaar single-nucleus isolatieprotocol voor bevroren cardiale voorlopercellen verkregen uit muizenembryo's dat compatibel is met downstream snRNA-seq en snATAC-seq (evenals snRNA-seq en snATAC-seq gecombineerd)7,8,9.

ATAC-seq is een robuuste methode die de identificatie van regulerende open chromatinegebieden en de positionering van nucleosomen10,11 mogelijk maakt. Deze informatie wordt gebruikt om conclusies te trekken over de locatie, identiteit en activiteit van transcriptiefactoren. De activiteit van chromatinefactoren, inclusief remodelers, evenals de transcriptionele activiteit van RNA-polymerase, kan dus worden geanalyseerd omdat de methode zeer gevoelig is voor het meten van kwantitatieve veranderingen in chromatinestructuur 1,2. ATAC-seq biedt dus een robuuste en onpartijdige benadering voor het blootleggen van de mechanismen die transcriptionele regulatie in een specifiek celtype regelen. ATAC-seq-protocollen zijn ook gevalideerd om de toegankelijkheid van chromatine in afzonderlijke cellen te meten, wat variabiliteit in de chromatine-architectuur binnen celpopulaties10,12,13 onthult.

Hoewel er de laatste jaren opmerkelijke vooruitgang is geboekt op het gebied van afzonderlijke cellen, is de grootste moeilijkheid de verwerking van de verse monsters die nodig zijn om deze experimenten uit te voeren14. Om deze moeilijkheid te omzeilen zijn verschillende tests uitgevoerd met als doel analyses uit te voeren zoals snRNA-seq en snATAC-seq met bevroren hartweefsel of cellen15,16.

Verschillende platforms zijn gebruikt om single-cell genomics-gegevenste analyseren 17. De veelgebruikte platforms voor eencellige genexpressie en ATAC-profilering zijn platforms voor meervoudige microfluïdische druppelinkapseling17. Omdat deze platforms microfluïdische kamers gebruiken, kunnen puin of aggregaten het systeem verstoppen, wat resulteert in niet-bruikbare gegevens. Het succes van eencellige studies hangt dus af van de nauwkeurige isolatie van individuele cellen / kernen.

Het hier gepresenteerde protocol gebruikt een vergelijkbare benadering als recente studies met snRNA-seq en snATAC-seq om aangeboren hartafwijkingen te begrijpen 18,19,20,21,22,23. Deze procedure maakt gebruik van de enzymatische dissociatie van vers gemicrodisseceerd hartweefsel gevolgd door de cryopreservatie van hartvoorlopercellen van muizen. Na het ontdooien worden de levensvatbare cellen gezuiverd en verwerkt voor nucleaire isolatie. In dit werk werd dit protocol met succes gebruikt om snRNA-seq- en snATAC-seq-gegevens te verkrijgen van hetzelfde nucleaire preparaat van hartvoorlopercellen van muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dierprocedure die in deze studie werd gevolgd, werd goedgekeurd door de dierethische commissies van de universiteit van Aix-Marseille (C2EA-14) en werd uitgevoerd volgens protocollen die waren goedgekeurd door de aangewezen nationale ethische commissie voor dierproeven (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorisatie Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Het instellen van de getimede paring voorafgaand aan de dissectie

  1. Om muizenembryo's te genereren, voert u een getimede paring uit tussen volwassen muizen 9,5 dagen voorafgaand aan de isolatie van het hartgebied. In deze procedure werden wild-type C57BL / 6J-muizen van 2-6 maanden oud gebruikt en getimede paring werd 's nachts uitgevoerd.
  2. Controleer de volgende ochtend of de vrouwelijke muizen een vaginale plug hebben. Denk aan de dag waarop de plug wordt geïdentificeerd als embryonale dag (E) 0,5.

2. Weefselpreparatie en celisolatie

  1. Euthanaseer 2-6 maanden oude zwangere vrouw C57BL/6J op dag 9,5 na de conceptie via CO2 met een toenemende concentratie gevolgd door cervicale dislocatie. Reinig het onderste deel van de buik met 70% ethanol.
    OPMERKING: Het gebruik van anesthetica vóór cervicale dislocatie wordt niet aanbevolen, omdat dit de embryo's zou blootstellen aan veranderingen in de omgeving die van invloed kunnen zijn op latere transcriptomische en epigenomische onderzoeken.
  2. Open de buik en het buikvlies met een schaar. Visualiseer de baarmoederhoorns en gebruik een tang om beide hoorns weg te snijden.
  3. Plaats de hoorns in een petrischaaltje met koud medium met 1% FBS. Hoewel er geen specifiek volume nodig is, moet ervoor worden gezorgd dat de embryo's volledig in het medium worden ondergedompeld. Een geschat volume van 10 ml per petrischaal van 10 cm is geschikt.
  4. Verwijder onder de stereomicroscoop ingesteld op 5x vergroting en met behulp van een tang het endometriumweefsel, de placenta en de dooierzak van elk embryo.
  5. Plaats de embryo's in een petrischaaltje met koud medium met 1% FBS. Ontleed het embryonale hartgebied, zoals beschreven op het schematische embryo in figuur 1, in koud volledig medium.
  6. Bundel de hartgebieden ontleed uit vijf muizenembryo's in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Prechill draaiemmer centrifuges tot 4 °C.
  7. Centrifugeer op 300x g gedurende 1 minuut bij RT in een draaiende emmercentrifuge. Verwijder het supernatant en was de weefsels door 1 ml PBS van weefselkweekkwaliteit toe te voegen.
  8. Centrifugeer op 300 x g gedurende 1 minuut bij RT. Verwijder het supernatant en herhaal de wasstappen voor in totaal twee wasbeurten. Herhaal de was twee keer en vervang de PBS door 0,05% trypsine/EDTA (1x).
  9. Voeg voor weefselvertering 50 μL 0,25% trypsine/EDTA toe gedurende 10 minuten bij 37 °C. Breng na 5 minuten zachte mechanische dissociatie aan door op en neer te gaan met behulp van een filterpunt met brede opening.
  10. Inactiveer de trypsine-verteringsactiviteit door 350 μL volledig medium aan de gedissocieerde cellen toe te voegen. Laat de geresuspendeerde cellen door een celzeef van 40 μm gaan.

3. Celtelling en beoordeling van de levensvatbaarheid

OPMERKING: Het aantal cellen en de levensvatbaarheid zijn kritische parameters voor het succes van eencellige experimenten. De snATAC-seq benadering is gevoelig voor kleine variaties in celnummer. Te weinig cellen leiden tot oververtering van het chromatine, wat resulteert in een hoger aantal reads en het in kaart brengen van ontoegankelijke chromatinegebieden (ruis). Evenzo genereert het hebben van te veel cellen fragmenten met een hoog moleculair gewicht die moeilijk te sequencen zijn. Voor de nauwkeurige bepaling van de cel- en kernconcentraties werden het celgetal en de levensvatbaarheid met twee verschillende methoden beoordeeld.

  1. Voer een trypan blue assay uit voor celtelling, zoals hieronder beschreven.
    1. Vortex 0,4% trypan blauwe kleuringsoplossing, draai gedurende 10 s bij kamertemperatuur bij 2.000 x g en breng 10 μL over in een microbuis.
    2. Meng met behulp van een pipet de celsuspensie en voeg 10 μL suspensie toe aan de reeds gealiquoteerde 10 μL trypanblauwe oplossing. Meng voorzichtig 10 keer met een pipet.
    3. Breng 10 μL van de gekleurde cellen over in een telglaasje. Plaats de schuif in de teller om automatisch de celconcentratie en levensvatbaarheid te berekenen.
  2. Voer een op fluorescentie gebaseerde beoordeling van de mortaliteit uit zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Deze test is gebaseerd op het gebruik van fluorescerende kleurstoffen (ethidium homodimeer-1, EthD-1 en calceïne AM) om de levensvatbaarheid van de cel te evalueren. Er werd een in de handel verkrijgbare kit gebruikt en de instructies van de provider werden gevolgd voor de juiste voorbereiding en gebruik.
    1. Bereid een 10 μM EthD-1-oplossing door 5 μL van de meegeleverde 2 mM EthD-1-stamoplossing toe te voegen aan 1 ml steriele weefselkweekkwaliteit D-PBS en vortex gedurende 5 s om volledige menging te garanderen.
    2. Breng 2,5 μL van de meegeleverde 4 mM calceïne AM-voorraadoplossing over naar de reeds bereide EthD-1-oplossing. Vortex voor 5 s om volledige menging te garanderen.
    3. Voeg 10 μL van de resulterende 10 μM EthD-1 en 10 μM calceïne AM werkoplossing toe aan 10 μL celsuspensie.
      OPMERKING: Calceïne is zeer gevoelig voor hydrolyse in waterige oplossingen, dus gebruik deze werkoplossing binnen 1 dag.
    4. Breng 10 μL van de gekleurde cellen over op een telglaasje. Plaats de dia in de automatische fluorescerende celteller. Tel de levende cellen met een GFP-filter en de dode cellen met een RFP-filter.
      OPMERKING: De twee telmethoden gaven vergelijkbare celtellingen en levensvatbaarheid, en het totale aantal vers gedissocieerde cellen werd geschat op gemiddeld ongeveer 20.000 cellen per embryonaal hartgebied (0,06 mm3).

4. Bevriezing van cellen

  1. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de bodem van de buis aan te raken en resuspensie van de pellet in 1 ml gekoeld vriesmedium.
  2. Breng de celsuspensie over in een voorgekoelde cryovial en plaats de cryovial in een voorgekoelde vriescontainer.
  3. Plaats de container op −80 ◦C gedurende 4 uur tot 8 uur. Breng de cryoviale over naar vloeibare stikstof voor downstream single-nucleus RNA en ATAC sequencing experimenten.
    OPMERKING: De cryovial moet vóór gebruik op droogijs worden vervoerd. In onze ervaring kunnen de cellen gedurende ten minste 6 maanden in vloeibare stikstof worden opgeslagen zonder verlies van levensvatbaarheid van de cel. De opslagtemperatuur moet te allen tijde onder −150 °C worden gehouden om de vorming van ijskristallen te voorkomen.

5. Ontdooien van cellen en verwijderen van dode cellen

  1. Plaats de cryovialen in een waterbad van 37 °C gedurende 1-2 minuten. Verwijder het wanneer een klein kristal achterblijft in de cryovial.
  2. Voeg 1 ml voorverwarmd (37 °C) compleet medium toe. Meng drie keer met een pipet. Breng de suspensie over in een conische buis van 15 ml met 10 ml warm compleet medium.
  3. Breng de hele celsuspensie over een zeef van 30 μm. Spoel de zeef af met 1-2 ml warm medium en verzamel de doorstroming in dezelfde conische buis.
  4. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Was één keer met PBS en breng de celsuspensie over in een microbuisje van 1,5 ml.
  5. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g en verwijder het supernatant zonder de celkorrel te verstoren.
  6. Voeg 100 μL van de meegeleverde magnetische microbeads toe aan de gepelletiseerde cellen en homogeniseer vijf keer met behulp van een pipetpunt met brede boring. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
  7. Spoel ondertussen de magnetische scheidingskolom (capaciteit: 1 x 107 tot 2 x 108 cellen) af met 500 μL 1x bindingsbuffer.
  8. Zodra de incubatie is voltooid, verdunt u de celsuspensie met de microbeads met 500 μL 1x bindingsbuffer.
  9. Breng de celsuspensie (0,6 μL) aan op de voorbereide magnetische scheidingskolom. De doorstroming is de negatief geselecteerde levende celfractie en de magnetisch vastgehouden fractie is de positief geselecteerde dode cellen.
  10. Vang het effluent van de levende cel op in een centrifugebuis van 15 ml. Spoel de microbuis van 1,5 ml die de celsuspensie en de kolom bevatte met 2 ml 1x bindingsbuffer en verzamel het effluent in dezelfde buis van 15 ml.
  11. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant zonder de celkorrel te verstoren.
  12. Voeg 1 ml van de PBS-BSA-oplossing toe en meng voorzichtig door vijf keer te pipetteren met behulp van een pipetpunt met brede opening. Breng de celsuspensie over in een microbuis van 1,5 ml.
  13. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant zonder de celkorrel te verstoren.
  14. Voeg 1 ml PBS-BSA toe om de pellet te resuspenderen en herhaal de wasstap voor in totaal twee wasbeurten.
  15. Resuspendeer de cellen in 100 μL PBS-BSA-oplossing. Meng voorzichtig door 10 keer te pipetteren.
  16. Bepaal de concentratie en levensvatbaarheid van de cellen met behulp van de eerder beschreven methoden (stap 3.1 en stap 3.2). Om door te gaan naar de volgende stap, moet u zorgen voor een celtelling van ≥ 100.000 cellen. Zie figuur 2 voor representatieve resultaten.
    OPMERKING: Cryoreservatie resulteert in een verlies van ongeveer 40% van het oorspronkelijke uitgangsmateriaal van levende cellen. Afhankelijk van het beginaantal cellen resulteert kraalscheiding op een magnetische kolom in een hoge levensvatbaarheid van de cel, maar deelt het totale aantal cellen door tweevoudig tot vijfvoudig. Het gebruik van een op kolommen gebaseerde magnetische kit om de dode cellen te verwijderen, wordt alleen geadviseerd als er voldoende uitgangsmateriaal beschikbaar is.

6. Kernisolatie

OPMERKING: snATAC en snRNA-seq gecombineerd worden uitgevoerd met een suspensie van schone en intacte kernen. De optimalisatie van de lysiscondities (lysistijd en NP40-concentratie) voor het gebruikte celtype wordt aanbevolen. Het optimale lysistijdstip en de concentratie van het reinigingsmiddel zijn die welke resulteren in het maximale aantal cellen dat wordt gelyseerd zonder de nucleaire morfologie te verstoren. Het verlies van cellen/kernen kan worden verminderd door een draaiende emmercentrifuge te gebruiken in plaats van een centrifuge met een vaste hoek. Om het vasthouden van kernen op kunststoffen te minimaliseren, wordt aanbevolen om pipetpunten met een lage retentie en centrifugebuizen te gebruiken. Dit kan het herstel van de kernen verhogen. Het coaten van de pipetpunten en centrifugebuizen met 5% BSA is een goedkoper maar tijdrovender alternatief.

  1. Reinig de werkplek en materialen met 70% ethanol en RNase-verwijderingsoplossing.
  2. Prechill draaiemmer centrifuges tot 4 °C. Lysisbuffer, lysisverdunningsbuffer, 0,1x lysisbuffer en wasbuffer vers voorbereiden (zie tabel 1). Houd de buffers op ijs.
  3. Centrifugeer de celsuspensie op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een draaiende emmercentrifuge. Verwijder voorzichtig al het supernatant zonder de bodem van de buis aan te raken om te voorkomen dat de celkorrel losraakt.
  4. Voeg 100 μL gekoelde 0,1x lysisbuffer toe. Meng voorzichtig door 10 keer te pipetteren. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
  5. Voeg 1 ml gekoelde wasbuffer toe en meng voorzichtig door vijf keer te pipetteren. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant zonder de kernpellet te verstoren.
  6. Herhaal de wasbeurten met gekoelde wasbuffer voor een totaal van drie wasbeurten. Bereid de verdunde kernenbuffer voor. Houd na resuspensie de kernvoorraadoplossing op ijs.

7. Kwaliteits- en kwantiteitsbeoordelingen van de geïsoleerde kernen

OPMERKING: Op basis van het initiële celgetal en het schatten van ongeveer 50% kernverlies tijdens cellyse, resuspensie van het juiste aantal cellen in koud verdunde kernbuffer. De berekening van het resuspensievolume met gekoelde verdunde kernbuffer is gebaseerd op de beoogde kernterugwinning en de overeenkomstige kernvoorraadconcentraties die worden aanbevolen door de gebruikershandleiding van de fabrikant. Zie een voorbeeld van deze berekening in Aanvullend Protocol 1.

  1. Op basis van het initiële celgetal en het schatten van ongeveer 50% kernverlies tijdens cellyse, resuspensie van het juiste aantal cellen in koud verdunde kernbuffer.
  2. Bepaal de werkelijke kernconcentratie. Meng 2 μL kernstockoplossing met 8 μL verdunde kernbuffer en voeg het mengsel toe aan de vooraf gealiquoted 10 μL trypan blue of EthD-1/calceinAM werkoplossing. Tel de kernen met behulp van een geautomatiseerde celteller. Minder dan 5% van de cellen moet levensvatbaar zijn. Zie figuur 3 voor representatieve resultaten.
  3. Bereken het volume van de kernvoorraad en het volume van de verdunde kernbuffer om een totaal volume van 5 μl te verkrijgen bij de aanbevolen concentratie voor de omzettingsreactie (raadpleeg de gebruikershandleiding van de fabrikant). Ga onmiddellijk verder met de omzettingsreactie volgens de gebruikershandleiding17.
    OPMERKING: Alle stappen van de transpositiereactie tot de constructie van de ATAC- en GEX-bibliotheken werden uitgevoerd volgens de gebruikershandleiding van de kit die wordt gebruikt voor snRNA-seq en snATAC-seq gecombineerd17.

8. Kwaliteitsanalyse van de snRNA-seq en snATAC-seq bibliotheken

  1. Voordat u overgaat tot next-generation sequencing, valideert u de kwaliteit en grootteverdeling van de uiteindelijke snATAC-seq- en genexpressie GEX-bibliotheken. Beoordeel de kwaliteit en kwantiteit van sequenties die in de bibliotheken zijn geïdentificeerd met behulp van fragmentanalysesystemen. Zie figuur 4 voor de resultaten van de representatieve kwaliteitsbeoordeling.
    OPMERKING: Het laatste spoor van de snATAC-seq-bibliotheken moet de periodiciteit van nucleosoomwikkeling laten zien, en de groottes moeten variëren van 200 bp tot meerdere Kbp, terwijl de groottes in de genexpressiebibliotheek moeten variëren van 300 bp tot 600 bp.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vergeleken met de voorbereiding van eencellige suspensies voor eencellige benaderingen, is de bereiding van suspensies met één kern veel uitdagender en vereist een hogere mate van resolutie en verwerking. De sleutelfactor voor een succesvolle gecombineerde snRNA-seq en snATAC-seq is een schone en intacte kernsuspensie. Het protocol voor efficiënte kernisolatie moet worden aangepast aan elk weefseltype en elke toestand (vers of bevroren). Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven voor de isolatie van kernen uit i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De analyse van de cellulaire samenstelling van het zich ontwikkelende hart door gecombineerde snRNA-seq- en snATAC-seq-studies biedt een dieper inzicht in de oorsprong van aangeboren hartaandoeningen26. Verschillende onderzoekslaboratoria hebben de effecten van cryopreservatie van hartweefsel op snRNA-seq27 bestudeerd. Het uitvoeren van snRNA-seq en snATAC-seq met behulp van vers micro-ontleed weefsel van muismodellen van menselijke ziekten kan logistiek uitdagend zijn bij ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door ERA-CVD-2019 en ANR-JCJC-2020 tot SS. We danken de Genomics and Bioinformatics-faciliteit (GBiM) van het U 1251 / Marseille Medical Genetics-laboratorium en de anonieme reviewers voor het leveren van waardevolle opmerkingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentGeen catalogusnummer
5M Sodium chloride (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)10X Genomics1000285
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherGeen catalogusnummer
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094Steriel en RNase-vrij
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 10788561
HI-FBSThermofisherA3840001Heat inactivated
High sensitivity DNA kitAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermofisherL3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaGeen catalogusnummer
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µmPluriSelectV-PM15-2021-12
Rock inhibitorEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn10X Genomics1000212
Standard 90mm Petri dish SterilinThermofisher101R20
Sterile double-distilled waterThermofisherR0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)SigmaT2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%)InvitrogenT10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μlLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSGeen catalogusnummer

Referenties

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  3. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
  4. Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
  5. Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
  6. Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
  7. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  8. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  9. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
  11. Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124(2020).
  12. Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
  13. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  14. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130(2020).
  15. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480(2022).
  16. Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810(2020).
  17. 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
  18. Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877(2018).
  19. Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
  20. Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211(2021).
  21. Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
  22. Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
  23. Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820(2022).
  24. Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121(2022).
  25. What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
  26. Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
  27. Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
  28. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
  29. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  30. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  31. Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
  32. Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097(2021).
  33. Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
  34. Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
  35. Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42(2021).
  36. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  37. Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Single nucleus RNA seqsingle nucleus ATAC seqduale omics profileringprotocol voor bevroren weefselbeoordeling van cellevensvatbaarheidmagnetische scheidingchromatine toegankelijkheidhartontwikkeling
Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.