Dit protocol demonstreert een uniek muizenslagmodel met een middelgroot infarct en een uitstekende overlevingskans. Dit model stelt preklinische beroerte-onderzoekers in staat om de duur van de ischemie te verlengen, verouderde muizen te gebruiken en functionele resultaten op lange termijn te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een aangepast transcraniaal occlusiemodel voor de middelste cerebrale slagader om de uitkomsten van een beroerte bij oudere muizen te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In experimenteel onderzoek naar beroertes wordt occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO) met een intraluminaal filament veel gebruikt om ischemische beroerte bij muizen te modelleren. Het filament MCAO-model vertoont typisch een massaal herseninfarct bij C57Bl/6-muizen dat soms hersenweefsel bevat in het gebied dat wordt geleverd door de achterste hersenslagader, wat grotendeels te wijten is aan een hoge incidentie van atresie van de achterste communicerende slagader. Dit fenomeen wordt beschouwd als een belangrijke oorzaak van het hoge sterftecijfer dat wordt waargenomen bij C57Bl/6-muizen tijdens langdurig herstel van een beroerte na filament MCAO. Veel onderzoeken naar chronische beroertes maken dus gebruik van distale MCAO-modellen. Deze modellen veroorzaken echter meestal alleen een infarct in het cortexgebied, en bijgevolg kan de beoordeling van neurologische gebreken na een beroerte een uitdaging zijn. Deze studie heeft een aangepast transcranieel MCAO-model opgesteld waarin de MCA aan de romp gedeeltelijk permanent of tijdelijk wordt afgesloten via een klein schedelvenster. Aangezien de occlusielocatie relatief dicht bij de oorsprong van de MCA ligt, genereert dit model hersenbeschadiging in zowel de cortex als het striatum. Uitgebreide karakterisering van dit model heeft een uitstekende overlevingskans op lange termijn aangetoond, zelfs bij oudere muizen, evenals gemakkelijk detecteerbare neurologische tekorten. Daarom is het hier beschreven MCAO-muismodel een waardevol hulpmiddel voor experimenteel onderzoek naar beroertes.
Inleiding
Bijna 800.000 mensen krijgen elk jaar een beroerte in de VS, en de meeste van deze beroertes zijn ischemisch van aard. Tijdig herstel van de cerebrale doorbloeding met weefselplasminogeenactivator (tPA) en/of trombectomie is momenteel de meest effectieve behandeling voor patiënten met een beroerte; Het volledige herstel van neurologische functies op de lange termijn is echter zeldzaam 2,3. Het zoeken naar nieuwe beroertetherapie die gericht is op functionele verbetering is dus een intensief onderzoeksgebied dat klinisch relevante diermodellen van een beroerte vereist.
Het meest voorkomende ischemische beroertemodel bij knaagdieren maakt gebruik van intraluminale occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO) om een beroerte te induceren. In dit model, oorspronkelijk ontwikkeld door Zea Longa in 1989, wordt een nylon filament ingebracht in de interne halsslagader (ICA) om de bloedtoevoer naar de middelste hersenslagader (MCA) te blokkeren4. Dit model heeft echter beperkingen. Ten eerste, wanneer het filament in de ICA wordt ingebracht, kan de bloedtoevoer naar de achterste hersenslagader (PCA) ook gedeeltelijk worden geblokkeerd, vooral bij muizen. Van cruciaal belang is dat de posterieure communicerende slagader (PcomA), een kleine slagader die de voorste en achterste cerebrale circulatie met elkaar verbindt, vaak onderontwikkeld is bij sommige muizenstammen, zoals C57Bl/6, de stam die voornamelijk wordt gebruikt in experimenteel onderzoek naar beroertes. Deze doorgankelijkheid van de PcomA wordt verondersteld bij te dragen aan de variabiliteit in laesiegrootte bij muizen na beroerte5. Inderdaad, wanneer de bloedtoevoer naar de PCA tijdens MCAO snel daalt en de PcomA niet in staat is om voldoende collaterale bloedstroom te bieden, kan het beroerte-infarct zich uitbreiden naar het grondgebied van de PCA. Bovendien leidt in dit model een lange duur van ischemie tot een hogere kans op sterfte bij muizen. Daarom wordt bij muizen meestal een korte MCAO-duur van 30-60 minuten gebruikt. De meeste patiënten met een beroerte ervaren echter een paar uur ischemie vóór de reperfusiebehandeling. Een muisberoertemodel met een verlengde duur van ischemie is dus van hoge klinische relevantie.
Het algemene doel van deze procedure is om ischemische beroerte te modelleren bij muizen met een middelgroot infarct en een uitstekende overlevingskans. Dit transcraniële MCAO-model richt zich op kritieke kenmerken van klinische beroerte, aangezien langdurige ischemie kan worden uitgevoerd en oudere muizen dit model goed verdragen, waardoor de langetermijnbeoordeling van functioneel herstel mogelijk is.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures die in dit werk worden beschreven, worden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren in onderzoek, en het protocol is goedgekeurd door het Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Voor de huidige studie werden jonge (8-10 weken oud) en oude (22 maanden oude) mannelijke C57Bl/6-muizen gebruikt. Een overzicht van dit protocol wordt geïllustreerd in figuur 1.
1. Chirurgische voorbereiding
- Onderzoek de muis op grove afwijkingen en gedragsstoornissen.
OPMERKING: Vóór de operatie is het belangrijk dat chirurgen de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (beschermende persoonlijke uitrusting) dragen, waaronder een chirurgisch masker, pet, handschoenen en jas. - Weeg de muis; programmeer de ventilator (zie Materiaaltabel) op basis van het lichaamsgewicht.
- Plaats de muis in een inductiedoos van 4 x 4 x 7 in anesthesie. Zet de zuurstofflowmeter (zie Materiaaltabel), ingesteld op 30, en de lachgas flowmeter, ingesteld op 70, aan. Zet de vaporizer met 5% isofluraan aan.
- Steek de voerdraad in de 20 G intraveneuze (IV) katheter.
- Haal de muis uit de inductiebox wanneer de ademhalingsfrequentie is verlaagd tot 30-40 ademhalingen per minuut.
- Leg de muis in rugligging op de operatiebank. Trek de tong van de muis naar buiten en houd deze vast met de vingers van de linkerhand. Steek een laryngoscoop (zie Tabel met materialen) in de bek van het dier om de stemband te visualiseren.
- Stabiliseer de kin van de muis op de laryngoscoop met de rechter middelvinger. Maak de linkerhand vrij om de 20 G IV-katheter vast te houden.
- Steek de voerdraad lichtjes in de stemband en duw vervolgens langzaam de 20 G IV-katheter in de luchtpijp totdat het vleugelgedeelte van de katheter gelijk komt te staan met de neuspunt.
NOTITIE: Als de muis beweegt, steek de draad dan niet in. Dit kan trauma aan de luchtpijp en bloedingen veroorzaken. - Schakel het beademingsapparaat in (zie Materiaaltabel) en sluit het aan op de 20 G IV-katheter die in de muis is geïntubeerd. Verlaag de isofluraan tot 1,5% en zorg ervoor dat beide longen mechanisch worden geventileerd.
OPMERKING: Vergeet niet de isofluraanconcentratie te verlagen. Anders krijgt de muis een overdosis anesthesie. - Breng oogzalf aan op beide ogen en injecteer 5 mg/kg carprofen subcutaan.
- Houd de muis in een zijwaartse positie met het rechter temporale gebied naar boven gericht. Houd de rectale temperatuur op 37 °C met behulp van een verwarmingskussen (35 °C) en een warmtelamp die wordt aangestuurd door een temperatuurregelaar (zie Materiaaltabel).
- Scheer het oppervlak tussen het rechteroog en het oor en desinfecteer het operatiegebied minstens drie keer met jodium- en alcoholdoekjes.
2. MCAO-operatie
- Open het steriele instrumentenpakket voor MCAO-operaties. Draag steriele handschoenen en maak met een chirurgische schaar een huidincisie van 1 cm tussen het rechteroog en het rechteroor.
NOTITIE: Controleer elke 15 minuten de huidskleur, lichaamstemperatuur en reactie op teenknijpen. - Ontleed de onderliggende fascia met een tang om de temporale en kauwspieren bloot te leggen.
NOTITIE: Pas op dat u de oorspeekselklier niet beschadigt. - Gebruik een pincet om het onderste deel van de temporale spier aan te raken en de locatie van de jukbeenboog te detecteren. Trek de takken van de aangezichtszenuw voorzichtig opzij.
- Gebruik de punt van een cauterisatielus op hoge temperatuur (zie Materiaaltabel) om een dwarse incisie van 5 mm in de temporale spier door te snijden.
- Gebruik twee pincetten om de onderliggende jukbeenboog te ontleden en het gewricht tussen de bovenkaak en jukbeenderen bloot te leggen.
- Gebruik een schaar om een deel van 3 mm van de jukbeenboog af te knippen en te verwijderen. Scheid de kauwspier van de schedelbasis.
OPMERKING: Pas op dat u de retro-orbitale sinus en de oppervlakkige temporale ader niet breekt. - Breng vier kleine retractors aan die in verschillende richtingen zijn geplaatst om de schedelbasis bloot te leggen, waarbij de trigeminuszenuwtakken zijwaarts worden getrokken door één retractor.
OPMERKING: Een sulcus op het buitenoppervlak van de schedelbasis markeert de locatie van de laterale spleet tussen de frontale en temporale kwabben. De MCA ligt hier (Figuur 2A), en de stam en takken zijn zichtbaar door de dunne, transparante schedel (Figuur 2B). De relatie van deze slagader met andere belangrijke hersenslagaders is weergegeven in figuur 2A. - Breng een druppel van 0,9% normale zoutoplossing aan op de schedel boven de MCA-stam en proximaal van de tak van de rhinale cortex. Gebruik een elektrische slijper om de schedel uit te dunnen totdat een kleine breuk zichtbaar is.
NOTITIE: Duw de slijper niet tegen de schedel, omdat deze de schedel kan binnendringen en de onderliggende slagader kan verwonden. - Gebruik de punt van de pincet om de uitgedunde schedel op te tillen en te verwijderen. Voor schijnmuizen, stop hier en maak de slagader niet belast.
OPMERKING: Er wordt een klein rechthoekig venster over de MCA-stam gevormd. - Plaats een enkelstrengs lus van zwarte gevlochten zijde bovenop de MCA (Figuur 2C). Plaats een 8-0 microchirurgische naald om de MCA-stam op te tillen en bind de hechting (zie Materiaaltabel) onder de naald, waarbij beide uiteinden van de naald op de bovenkant van de zijden draadlusknoop blijven (Figuur 2D).
- Draai bij voorbijgaande MCAO de zijden draadknoop iets onder de naald aan om de arteriële bloedstroom te blokkeren (Figuur 2E), wat het begin van MCAO vertegenwoordigt.
- Gebruik de pincet om de hechting vast te houden en verwijder langzaam de naald aan het einde van de ischemie (bijv. 60 minuten of langer).
OPMERKING: Wanneer de naald wordt verwijderd, wordt de zijden draadknoop van de MCA geschoven en worden de hersenen opnieuw gefuseerd (Figuur 2F). - Voor permanente MCAO trekt u de zijden draadlus rond de slagader stevig vast en verwijdert u de naald. Knip en verwijder het overtollige hechtmateriaal.
- Breng een druppel 0,25% bupivacaïne aan op de huidincisie en hecht de spier en huid afzonderlijk met behulp van 6-0 nylon hechtingen met tussenpozen (zie Materiaaltabel). Breng antibiotische zalf aan op het oppervlak van de huidincisie.
OPMERKING: De huidincisie kan ook worden gesloten met steriele nietjes of lijm.
3. Postoperatieve zorg
- Schakel de isofluraan uit om de muis wakker te maken. Koppel de ventilator los wanneer de spontane ademhaling is hersteld.
- Breng de muis over naar een herstelkamer (zie Materiaaltabel) met een gecontroleerde temperatuur.
- Extubeer de muis wanneer zijn oprichtreflex is hersteld of wanneer hij begint te bewegen.
- Houd de muis nauwlettend in de gaten in een kamer met temperatuur- en vochtigheidsregeling. Breng de muis terug naar de thuiskooi nadat deze volledig bij bewustzijn is gekomen (herstelperiode ~ 2 uur). Dagelijks 5 mg/kg Carprofen subcutaan toedienen gedurende 3 dagen.
4. Beeldvorming met laserspikkelcontrast (LSCI)
- Zes en 24 uur na MCAO monteert u de verdoofde muis op het stereotaxische frame. Scheer de bovenkant van het hoofd en maak het schoon met drie afwisselende wattenstaafjes jodium en alcohol.
OPMERKING: De verdoving werd uitgevoerd zoals vermeld in stap 1.3. LSCI wordt ook uitgevoerd vóór MCAO. - Maak een incisie van 3 cm in de middellijn van de huid en ontleed de huid van de schedel. Breng vier kleine naaldretractors aan om de bovenkant van de schedel bloot te leggen.
- Beweeg de laserspikkelcamera (zie Materiaaltabel) boven het hoofd en pas de scherpstelling van de camera aan. Stel je de cerebrale bloedstroom voor.
5. 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC)-kleuring
- Verdoof de muis diep met 5% isofluraan aan het einde van het experiment, meestal op dag 1, 3 of 28 na een beroerte. Knijp in de staart om er zeker van te zijn dat er geen pijnreactie is.
- Onthoofd de muis met een chirurgische schaar en oogst de hersenen. Incubeer de hersenen gedurende 20 minuten in ijskoude zoutoplossing.
- Doe de hersenen in een hersensnijmachinematrix op ijs en druppel koude zoutoplossing op de hersenen. Snijd de hersenen in plakjes van 1 mm met behulp van dunne scheermesjes.
- Dompel de hersenplakjes in dezelfde richting onder in een schaal met 2% TTC-oplossing (zie Tabel met materialen). Bewaar de schaal 15 minuten in het donker op kamertemperatuur.
OPMERKING: Normaal hersenweefsel wordt rood en ischemisch weefsel blijft wit. - Breng de hersenplakjes over op 10% formaline gedurende 24 uur fixatie. Breng de hersenplakjes in beeld en meet het infarctgebied.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met een direct zicht onder een chirurgische microscoop kan visueel worden bevestigd dat de MCA-bloedstroom wordt geblokkeerd tijdens ischemie. Onze vorige studie toonde een vermindering van de bloedstroom met >80% in het ischemische gebied met behulp van een laser Doppler-monitor6. Om veranderingen in de bloedstroom na MCAO te bepalen, kan LSCI worden gebruikt om de ischemische insult en reperfusie verder te bevestigen (Figuur 1). In figuur 3A
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het eerste transcraniële MCA-occlusiemodel werd in 1981 bij ratten vastgesteld11,12 en in 1989 vervangen door het MCAO-model zonder craniectomie4. De initiële transcraniële MCA-occlusie had een breed chirurgisch veld, zodat de hele jukbeenboog werd verwijderd en de spieren lateraal werden getrokken. Lokale weefsels waren gezwollen na de operatie, wat stress veroorzaakte en een verminderde voedselinname voor de dieren veroorzaakte. In ons a...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs hebben geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Kathy Gage voor haar redactionele ondersteuning. Schemacijfers zijn gemaakt met BioRender.com. Deze studie werd ondersteund door fondsen van de afdeling Anesthesiologie (Duke University Medical Center) en NIH-subsidies (NS099590, HL157354, NS117973 en NS127163).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% bupivacaïne | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9% natriumchloride | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride (TTC) | Sigma of elke beschikbare leverancier | ||
| 20 G IV katheter | BD | 381534 | 20 GA 1,6 IN |
| 30 G naald | BD | 305106 | |
| 4-0 zijden hechtdraad | Look | SP116 | Zwarte gevlochten zijde |
| 8-0 hechtdraad met naald | Ethilon | 2822G | |
| Alcohol wattenstaafjes | BD | 326895 | |
| Anesthesie inductiebox | Elke geschikte leverancier | Gemaakt van pexiglas | |
| Elektrische grinder | JSDA | JD 700 | |
| Cauterisatielus met hoge temperatuurpunt | Bovie | AA03 | |
| Isofluraan | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Laser doppler perfusiemonitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Smeermiddel oogzalf | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Muis rectale sonde | Physitemp | RET-3 | |
| Lachgas | Airgas | UN1070 | |
| Otoscoop | Welchallyn | 728 | 2,5 mm Speculum Otoscoop diende als laryngoscoop om de stembanden bij muizen te visualiseren |
| Zuurstof | Airgas | UN1072 | |
| Povidon-jodium | CVS | 955338 | |
| Herstelkooi | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | 6100701 | Injecteerbaar 50 mg/mL |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | Rodent Jr. | |
| Temperatuurregelaar | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Drievoudige antibiotische & pijnverlichting | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Verdamper | RWD | R583S |
Referenties
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153(2022).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
- Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741(2020).
- Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
- Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646(2021).
- Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
- Li, X., et al. Beneficial effects of neuronal ATF6 activation in permanent ischemic stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 1016391(2022).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
