Method Article

Beeldvorming van ATG9A, een multi-overspanning membraaneiwit

DOI:

10.3791/65349

⸱

June 16th, 2023

 ,  ,  , 
1Molecular Cell Biology of Autophagy, The Francis Crick Institute, 2MRC Laboratory of Molecular Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft verschillende methoden die kunnen helpen bij de studie van ATG9A-biologie, waaronder immunofluorescentie gevolgd door beeldanalyse, overwegingen met betrekking tot voorbijgaande overexpressie en het onderzoeken van de ATG9A-glycosyleringsstatus met behulp van western blot.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autofagie is een sterk geconserveerde route die de cel gebruikt om homeostase te behouden, beschadigde organellen af te breken, binnendringende ziekteverwekkers te bestrijden en pathologische omstandigheden te overleven. Een reeks eiwitten, ATG-eiwitten genaamd, vormen de kern van de autofagie-machinerie en werken samen in een gedefinieerde hiërarchie. Studies in de afgelopen jaren hebben onze kennis van de autofagieroute verbeterd. Meest recentelijk is voorgesteld dat ATG9A-blaasjes de kern vormen van autofagie, omdat ze de snelle de novo synthese van een organel regelen dat de faagofoor wordt genoemd. De studie van ATG9A is een uitdaging gebleken, omdat ATG9A een transmembraaneiwit is en aanwezig is in verschillende membraancompartimenten. Als zodanig is het begrijpen van de handel in autofagie een belangrijk element voor het begrijpen van autofagie. Hier worden gedetailleerde methoden gepresenteerd die kunnen worden gebruikt om ATG9A te bestuderen en in het bijzonder de lokalisatie ervan met behulp van immunofluorescentietechnieken, die kunnen worden beoordeeld en gekwantificeerd. Ook de valkuilen van voorbijgaande overexpressie komen aan bod. De juiste karakterisering van de ATG9A-functie en de standaardisatie van technieken om de handel in ATG9A te analyseren, zijn cruciaal om de gebeurtenissen die de initiatie van autofagie beheersen verder te karakteriseren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATG9A is het enige transmembraaneiwit van de autofagie-kernmachinerie en wordt getransporteerd tussen het Golgi- en een cytosolisch ATG9A-blaasjescompartiment, dat door het endosomale compartiment1 gaat. ATG9A is al lang raadselachtig en is onlangs beschreven als een lipide scramblase, omdat het lipiden in evenwicht brengt over membraandubbellagen 2,3. Het is nu duidelijk dat ATG9A zich aan de top van de hiërarchie bevindt in de vorming van autofagosoomen, en de studie ervan is dus van vitaal belang voor het begrijpen van autofagie 4,5. Als zodanig zijn ATG9A-blaasjes onlangs voorgesteld als het "zaad" van het autofagosoom 6,7. Eerdere studies hebben echter aangetoond dat ATG9A slechts tijdelijk interageert met het vormende autofagosoom in verschillende stadia van zijn rijping en niet integreert in het autofagische membraan 6,8,9,10,11. Er is dus verder onderzoek nodig om de rol en mogelijke meervoudige functies van ATG9A bij de vorming van autofagosomen volledig te ontrafelen. De discrepantie tussen de huidige modellen en de eerdere gegevens kan echter alleen worden opgelost door middel van gerichte experimenten die de handel in ATG9A aanpakken met behulp van gevalideerde kwantitatieve benaderingen en intracellulaire markers.

Er zijn verschillende hulpmiddelen in gebruik om ATG9A te bestuderen, elk met voor- en nadelen, en het gebruik van deze hulpmiddelen wordt bemoeilijkt door de structuur van ATG9A, de moleculaire functie en cellulaire handel 2,8,12. ATG9A vormt een homotrimeer, wordt geglycosyleerd en wordt door de cel getransporteerd naar compartimenten zoals de Golgi, de endosomen en het plasmamembraan13,14. Gezien de complexe route zijn er verschillende uitdagingen bij het interpreteren van uitlezingen zoals ATG9A-verspreiding van de Golgi op specifieke behandelingen of stimuli (zoals uithongering van voedingsstoffen en serum). ATG9A is uiterst dynamisch in termen van vesiculaire handel; ATG9A-bevattende blaasjes zijn inderdaad gedefinieerd als het ATG9A-compartiment in de context van door uithongering geïnduceerde autofagie. Het ATG9A-compartiment, gevormd door deze dynamische blaasjes, interageert tijdelijk met verschillende intracellulaire organellen 8,15,16,17. De hier beschreven technieken, waaronder immunofluorescentie, live beeldvorming en glycosyleringstesten, zouden moeten helpen bij de detectie en het begrip van ATG9A-biologie. In het bijzonder zullen de benaderingen die in dit artikel worden beschreven, helpen bij het beantwoorden van vragen over lokalisatie naar specifieke cellulaire compartimenten en interacties met specifieke eiwitpartners en/of membraancompartimenten. Aangezien het ATG9A hydrofoob geconserveerd kerndomein (PFAM-domein PF04109) een unieke topologie heeft en ATG9A-cycli tussen verschillende membraancompartimenten, moeten onderzoekers zich bewust zijn van bepaalde valkuilen en artefacten bij het tijdelijk overexpressie brengen van ATG9A, inclusief, maar niet beperkt tot, retentie van endoplasmatisch reticulum (ER). Andere mogelijke problemen kunnen zich voordoen als gevolg van verkeerde vouwing van het eiwit, artefactische aggregatie in normale groeiomstandigheden of onvoldoende detectie van het vesiculaire compartiment als gevolg van suboptimale permeabilisatieprotocollen voor immunofluorescentie.

Bij het in beeld brengen van endogene ATG9A moet bij de monstervoorbereiding en beeldacquisitie zorg worden besteed aan de kwaliteit van de daaropvolgende kwantitatieve analyse en de juiste interpretatie van de gegevens. Het combineren van de technieken die in dit artikel worden beschreven met standaard biochemische benaderingen (zoals immunoprecipitatie of pull-down experimenten die hier niet worden beschreven) zou ons begrip van de ATG9A-functie moeten verbeteren. Deze experimentele toolkit is bedoeld om nieuwe onderzoekers te helpen bij het navigeren door enkele van de tests die nodig zijn om de functie van ATG9A in hun biologische systeem te bepalen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle reagentia die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn in de handel verkrijgbaar, met uitzondering van de ATG9A-DNA-constructen en zelfgemaakte STO-215-antilichamen (zie materiaaltabel), die op aanvraag verkrijgbaar zijn. De hier beschreven analysetools zijn gebaseerd op opensourcesoftware (FIJI/ImageJ)18.

1. Celkweek

  1. Houd HEK293A cellen in een met T150-weefselkweek behandelde kolf op 80%-90% confluentie in DMEM met een hoog glucosegehalte (Dulbecco's Modified Eagle Medium) aangevuld met 10% FBS (foetaal runderserum) en 4 mM L-glutamine (zie Materiaaltabel). Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 10% CO2.
    OPMERKING: HEK293A cellen worden gebruikt in de huidige studie, omdat ze een robuuste canonieke autofagierespons hebben op aminozuuruithongering, die met name wordt gedetecteerd door een toename van lipide, membraan-geassocieerde LC3 1,9,19, en geschikt zijn voor beeldvorming.
  2. Passeer de cellen door het medium uit de kolf op te zuigen met behulp van een serologische pipet. Was de cellen eenmaal met 15 ml 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) of een vergelijkbare oplossing voordat u 2 ml trypsine-EDTA-oplossing (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) toevoegt om de cellen los te maken. Verzamel de losgemaakte cellen met 8 ml DMEM en zaai een aantal cellen terug zodat 80%-90% confluentie na 2 dagen wordt bereikt voor de hier beschreven experimenten.

2. Endogene kleuring van ATG9A

  1. Zaad HEK293A cellen (of cellen naar keuze) op steriele glazen dekglaasjes nr. 1.5 die in een plaat met 24 putjes zijn geplaatst, zodat ze de volgende dag ~80% samenvloeien. Dit geeft meestal 7 x 104 cellen/putje in 500 μL DMEM.
    NOTITIE: Voor HEK293A cellen of andere loszittende cellijnen moeten de dekglaasjes worden gecoat met poly-D-lysine van 0,1 mg/ml in gedeïoniseerd water. Voeg 500 μL poly-D-lysine (zie materiaaltabel) toe aan de bovenkant van de dekglaasjes die gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) in de putjes zijn geplaatst, gevolgd door drie wasbeurten met gedeïoniseerd water en een laatste wasbeurt in DMEM. Ga verder met het zaaien van de cellen na het coaten en zorg ervoor dat ze gelijkmatig in de kweekschaal worden verdeeld.
  2. Behandel de cellen volgens de specifieke experimentele omstandigheden (d.w.z. uithongering gedurende 2 uur in EBSS [Earle's Balanced Salt Solution]).
    OPMERKING: De EBSS-samenstelling is 1 g/L D-glucose, 6,8 g/L NaCl, 0,4 g/L KCl, 0,151 g/L CaCl 2,2H 2 O, 0,2 g/L mM MgSO 4,7H 2 O, 0,124 g/L NaH 2 HPO4,2H 2 O en 2,2 g/L NaHCO3 (zie Materiaaltabel) opgelost in gedestilleerd water.
  3. Zuig het medium op en vervang het voorzichtig door 500 μL 4% formaldehyde-oplossing in PBS aangevuld met 0,1 mM CaCl 2 en 0,1 mM MgCl2 gedurende 20 minuten bij RT om de cellen te fixeren.
  4. Zuig de 4% formaldehyde-oplossing uit elk putje op en vervang deze door 500 μL PBS. Herhaal deze wasstap drie keer. Laat de dekglaasjes niet uitdrogen of zonder vloeistof blijven.
  5. Blus de vrije aldehydegroepen af met 500 μL 50 mM NH4Cl-oplossing in PBS gedurende 10 minuten bij RT.
  6. Zuig de PBS op en vervang deze door 500 μL van een 50 μg/ml digitonine-oplossing in PBS (stockoplossing 1 mg/ml in gedeïoniseerd water, zie Materiaaltabel) gedurende 5 minuten bij RT om de cellen te permeabiliseren.
  7. Zuig de digitonine-oplossing uit elk putje op en vervang deze door 500 μL PBS. Herhaal deze wasstap drie keer.
  8. Zuig de PBS uit elk putje op en vervang deze door 500 μL blokkerende oplossing (5% BSA [runderserumalbumine] verdund in PBS) gedurende 30 minuten bij RT.
  9. Zuig de blokkerende oplossing op en vervang deze door 500 μL PBS.
  10. Verzamel met een pincet de dekglaasjes uit het putje, verwijder voorzichtig de overtollige PBS-oplossing met dunne doekjes of cellulosefilterpapier en leg elk dekglaasje voorzichtig met de celzijde naar beneden op een druppel van 50 μL primaire antilichaamoplossing (bijv. Armeense hamster 14F2 verdund tot 0,9 μg/ml in 1% BSA/PBS-oplossing, zie Materiaaltabel). Incubeer in een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij RT.
    OPMERKING: Voor eenvoudige hantering kunnen de druppels antilichaamoplossing op een vel zelfsluitende thermoplastische folie (zie Materiaaltabel) in een andere container worden geplaatst in plaats van rechtstreeks op een vast oppervlak.
  11. Verzamel de dekglaasjes met een pincet en, nadat u de overtollige primaire antilichaamoplossing voorzichtig hebt afgetapt met dunne tissuedoekjes, plaatst u de dekglaasjes (met de celzijde naar boven) terug in de plaat met 24 putjes en was ze drie keer met PBS.
  12. Herhaal stap 2.10. Verzamel met een pincet de dekglaasjes van elk putje, laat het overtollige PBS voorzichtig weglopen met dunne doekjes en leg elk dekglaasje voorzichtig neer (met de celzijde naar beneden) op een druppel van 50 μL secundaire antilichaamoplossing verdund 1:1.000 in 1% BSA/PBS-oplossing (bijv. Cy3 Geit Anti-Armeense Hamster IgG, die minimale kruisreactiviteit heeft met runderen, mensen, serumeiwitten van muizen, konijnen en ratten, zie Tabel met materialen). Incubeer in een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij RT.
    OPMERKING: Optioneel: Naast het secundaire antilichaam kan een cytoskeletmarker worden gebruikt voor de daaropvolgende beeldanalyse (d.w.z. Alexa Fluor 647 Phalloidin verdund 1:1.000, zie Materiaaltabel). Voor eenvoudige hantering kunnen de druppels antilichaamoplossing op een vel afdichtingsfolie in een andere container worden geplaatst in plaats van rechtstreeks op een vast oppervlak.
  13. Verzamel de dekglaasjes met een pincet en plaats de dekglaasjes, na het aftappen van de overtollige secundaire antilichaamoplossing, in de plaat met 24 putjes (met de celzijde naar boven) en was ze driemaal met 500 μL PBS.
  14. Verzamel met een pincet de dekglaasjes, laat het overtollige PBS voorzichtig weglopen met dunne doekjes en leg elk dekglaasje voorzichtig (met de cel naar beneden) op een druppel van 50 μl 1:4.000 Hoechst-oplossing (Hoechst 33342) in PBS. Incubeer in een vochtigheidskamer gedurende 5 minuten bij RT.
    OPMERKING: Voor eenvoudige hantering kunnen de druppels antilichaamoplossing op een vel afdichtingsfolie in een andere container worden geplaatst in plaats van rechtstreeks op een vast oppervlak.
  15. Verzamel de dekglaasjes met een pincet en plaats de dekglaasjes, nadat u de overtollige Hoechst-oplossing voorzichtig hebt afgetapt met dunne doekjes, terug in de plaat met 24 putjes en was ze drie keer met PBS en één keer met gedeïoniseerd water (500 μl per wasbeurt).
  16. Giet het overtollige gedeïoniseerde water voorzichtig af met dunne doekjes en leg elk dekglaasje voorzichtig (met de celzijde naar beneden) op een druppel montageoplossing van 10-20 μL (zie Materiaaltabel) op een microscoopglaasje voor immunofluorescentie, vermijd de vorming van luchtbellen.
    OPMERKING: Het hier gebruikte montagemedium heeft dezelfde brekingsindex als immersieolie en hardt uit na een paar uur bij RT of een nacht bij 4 °C. Niet-uithardende montageoplossingen kunnen worden gebruikt, maar er moet voor worden gezorgd dat het dekglaasje met nagellak wordt afgedicht.
  17. Verwijder de overtollige montageoplossing door aspiratie en laat de monsters drogen terwijl ze een nacht plat in het donker bij RT liggen, hetzij in een objectglaasjeshouder of afgedekt met aluminiumfolie.

3. Beeldacquisitie

  1. Zet de confocale microscoop aan. Open de beeldvormingssoftware (zie Materiaaltabel) om de beeldacquisitie te starten.
  2. Selecteer op het tabblad Functie de Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27-objectieflens om de beelden vast te leggen voor analyse.
  3. Schakel op het tabblad Acquisitiefunctie de juiste lasers in de laserzone van het bedieningspaneel in (Argon, Diode-405-30, DPSS 561-10 en HeNe633).
  4. Maak in de zone Imaging Setup van het Configuratiescherm vier sporen, waarbij elke track overeenkomt met één kanaal, om sequentiële acquisitie uit te voeren.
  5. Stel de juiste resolutie van de afbeeldingen in het venster Acquisitiemodus in. Stel de resolutie in op 1.024 x 1.024 (framegrootte) en selecteer een bitdiepte van 16-bits.
  6. Pas voor elk kanaal het laservermogen en de versterking aan om een goed signaal te verkrijgen zonder verzadigde pixels, wat de analyse van de beeldintensiteit zou belemmeren. Stel met behulp van de Live-knop het laseruitgangsniveau en de versterking (Master) in.
    OPMERKING: Het gebruik van de optie bereikindicator wordt aanbevolen voor detectie van verzadigde pixels. Houd het laservermogen tussen 1% en 10% en de versterking (Master) onder de 850 om achtergrondruis te voorkomen.
  7. Stel in de zone Kanalen van het Configuratiescherm voor elk kanaal dezelfde gaatjesopening in, rekening houdend met 1 Airy Unit (AU) voor het kanaal met de hoogste golflengte.
  8. Verkrijg 10 willekeurige velden met vergelijkbare hoeveelheden cellen (20-30 cellen per veld). De verwerving van 100-200 cellen per aandoening zal een goede kracht opleveren voor de latere beeldanalyse.

4. Beeldanalyse van ATG9A-verspreiding

  1. Download FIJI-software van internet (zie Tabel met materialen). Open de afbeelding met FIJI door te klikken op Plugins > Bio-Formats > BioFormats Importer.
  2. Klik op Metingen analyseren > instellen en selecteer de gemiddelde grijswaarde in het metingenvenster voor de intensiteitsanalyse.
  3. Klik op Afbeelding > Kleur > Kanalen splitsen en scheid de kanalen in drie afbeeldingen (Golgi-marker, cytoskelet, ATG9A-signaal).
  4. Ga naar Afbeelding > Pas > drempel aan en definieer een drempel in het kanaal die overeenkomt met de Golgi-markering.
  5. Klik op Edit > Selection > Create Selection (Selectie bewerken) en maak een selectie uit de binaire afbeelding.
  6. Ga naar > selectie bewerken > Toevoegen aan manager > Naam wijzigen (Golgi), sla de selectie op in de ROI-manager en hernoem deze naar Golgi.
  7. Klik op Afbeelding > Pas > drempel aan en definieer een drempel in het kanaal dat overeenkomt met de cytoskeletmarker om de celcontour te definiëren.
  8. Ga naar Selectie bewerken > > Selectie maken en maak een selectie uit de binaire afbeelding.
  9. Klik op > selectie bewerken > Toevoegen aan manager > Naam wijzigen (Totaal), sla de selectie op in de ROI-manager en hernoem deze naar Totaal.
  10. Selecteer de afbeelding die overeenkomt met de ATG9A-kleuring.
  11. In Analyse > Measure pas je de ROI Golgi toe door erop te klikken, en meet je de intensiteit van de Golgi-regio .
  12. Klik op Analyze > Measure, pas het ROI-totaal toe door erop te klikken en meet de intensiteit van de Total-regio.
  13. Herhaal de procedure in alle afbeeldingen, sla de resultaten op als .csv bestanden en verwerk de gegevens met behulp van de volgende formule:
    ATG9A-verspreidingssnelheid = Golgi-intensiteit/Totale intensiteit

5. Beeldvorming van levende cellen van ATG9A-constructen

  1. Zaad HEK293A cellen (of cellen naar keuze) in 2 ml medium in een weefselkweekschaaltje van 60 mm, zodat ze de volgende dag ~65%-70% confluentie bereiken; Dit geeft meestal 1 x 10 6-2 x 106 cellen.
  2. Bereid de volgende dag Lipofectamine:DNA-mengsels (of een geschikt alternatief DNA-transfectiereagens, zie Materiaaltabel) als volgt:
    1. Afhankelijk van de efficiëntie van de constructexpressie, verdun 0,5-2 μg plasmide-DNA in 100 μL van een geschikt serumvrij medium en meng de oplossing voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij RT.
      OPMERKING: Het plasmide-DNA-construct is experimentspecifiek. Onderzoekers kunnen zelf klonen of op verzoek van de auteurs verkrijgen.
    2. Verdun Lipofectamine 2000 transfectiereagens in een verhouding van 3:1 Lipofectamine:DNA tot 100 μL van een geschikt serumvrij medium en meng de oplossing voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer deze mix gedurende 5 minuten bij RT.
    3. Meng beide oplossingen door zachtjes op en neer te pipetteren en 20 minuten te incuberen bij RT.
  3. Voeg de Lipofectamine:DNA-mix toe aan elke celkweekplaat met 4 ml groeimedium en schud de plaat voorzichtig heen en weer om de mix gelijkmatig te verdelen. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator bij 10% CO2 .
  4. Vervang het medium 4 uur na transfectie door vers groeimedium en incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator bij 10% CO2 gedurende een nacht.
  5. Trypsiniseer, tel en zaai de cellen de volgende dag opnieuw in op kweekschaaltjes die geschikt zijn voor levende celmicroscopie (kweekschaaltjes met een glazen dekglaasje nr. 1,5, zie Materiaaltabel). Zaai 0,4 x 10 6-0,7 x 106 cellen op de schalen om ~60%-75% confluentie op het dekglaasje te bereiken op het moment van beeldvorming.
    OPMERKING: Coating met poly-D-lysine, zoals uitgelegd in stap 2.1, wordt aanbevolen voor HEK293A cellen.
  6. Breng de volgende dag (48 uur na transfectie) de cellen in beeld.

6. Onderzoek naar de glycosyleringstoestand van ATG9A

  1. Zaad HEK293A cellen (of cellen naar keuze) in een weefselkweekschaal van 10 cm, zodat ze de volgende dag ~80% confluentie bereiken als u van plan bent om endogene ATG9A te onderzoeken, wat doorgaans 1,5 x 10 6-2,5 x 106 cellen in 10 ml geeft. U kunt de cellen ook zo zaaien dat ze ~65%-70% confluentie bereiken als ze ATG9A-constructen transfecteren, wat meestal 1 x 10 6-1,5 x 106 cellen in 10 ml oplevert.
  2. Behandel de cellen de volgende dag met 100 μg/ml cyclohexamide (CHX, zie Materiaaltabel) of vehiculum. Incubeer gedurende 24 uur (of tot een gewenst tijdstip).
  3. Haal de cellen uit de couveuse, zuig het medium op en plaats ze op ijs. Vervang het door 5 ml ijskoude 1x PBS. Maak de cellen fysiek los van de schaal met behulp van een celschraper en pipetteer de PBS-celoplossing in een buis met conische bodem van 15 ml. Centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
  4. Zuig het supernatant op en resuspendeer de cellen in ~100 μL (afhankelijk van de grootte van de celpellet) ijskoude TNTE-lysisbuffer (1% Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA) aangevuld met proteaseremmercocktailtabletten (zie Materiaaltabel) en breng over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    1. Incubeer de lysate 15 minuten op ijs. Centrifugeer daarna het lysaat bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de kernen en onoplosbaar puin te bezinken en breng het supernatans over in een verse microcentrifugebuis.
  5. Kwantificeer de eiwitconcentratie van het lysaat met behulp van de Bradford-methode20 en een spectrofotometer die kan meten bij een golflengte van 595 nm.
  6. Normaliseer de eiwithoeveelheden en combineer 16 μL van het lysaat (met in totaal niet meer dan 100 μg eiwit) met 5x PNGase F (Peptide:N-glycosidase F)-buffer volgens de instructies van de fabrikant voordat 1 μL PNGase F-enzym wordt toegevoegd (zie Materiaaltabel). Incubeer volgens de instructies van de fabrikant van PNGase F.
  7. Voeg een volume van 3x Laemmli-monsterbuffer toe om een concentratie van 1x te bereiken en incubeer gedurende 5 minuten bij 65 °C voordat u het laadt voor elektroforese met behulp van een Tris-acetaatgel om de scheiding van eiwitten te maximaliseren. Breng de eiwitten van de gel over naar een geschikt membraan (d.w.z. PVDF [polyvinylideendifluoride]) met behulp van standaard western blot-protocollen21 (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: Door de monsters bij 95 °C te koken, wordt ATG9A geaggregeerd, waardoor de detectie van ATG9A wordt verminderd.
  8. Voer de western blot uit met behulp van specifieke antilichamen voor ATG9A (STO-215-antilichaam, in eigen huis geproduceerd1) (zie Materiaaltabel). Laat het gedeelte met een hoger molecuulgewicht van het membraan ongesneden om de soorten met een hoger ATG9A-molecuulgewicht te visualiseren.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATG9A is een transmembraaneiwit geassocieerd met verschillende intracellulaire membraancompartimenten 8,17,22,23,24. In basale omstandigheden is ATG9A voornamelijk gelokaliseerd in het trans-Golgi-netwerk (TGN), zoals aangegeven door de immunofluorescentie van het endogene eiwit en de overlappingen met GM130, een cis-Golgi-marker (Figuur 1A), evenals in kleine blaasjes die gedeeltelijk overlappen met het endocytische recyclingcompartiment (ERC)23. ATG9A-lokalisatie op de Golgi kan worden gedetecteerd met behulp van verschillende immunofluorescentieprotocollen. De vesiculaire fractie van ATG9A, evenals de verandering van lokalisatie, in het bijzonder de toename van de vesiculaire pool, als reactie op specifieke stimuli zoals uithongering van voedingsstoffen en serum, kan echter behoorlijk variëren in intensiteit en moeilijk te visualiseren zijn met conventionele beeldvormingsbenaderingen. De verhouding tussen ATG9A gelokaliseerd op de Golgi en ATG9A gelokaliseerd in een vesiculaire fractie wordt de ATG9A-dispersiesnelheid genoemd. Om veranderingen in de ATG9A-dispersiesnelheid te detecteren, bijvoorbeeld bij EBSS-behandeling, die wordt gebruikt om zowel serum als aminozuren uit te putten, zijn een Golgi-marker zoals GM130 of TGN46 en een cytoskeletmarker zoals phalloidine, die de celcontour25 kleurt, nuttig om de ATG9A-dispersie gemakkelijk te kwantificeren (Figuur 1B). Belangrijk is dat de analyse van de gemiddelde fluorescentieverhouding alleen kan worden geïnterpreteerd als een vergelijkende maat tussen omstandigheden in plaats van als een vaste verspreidingssnelheid. De verhouding tussen compartimenten is sterk afhankelijk van biologische en niet-biologische factoren zoals de gebruikte cellijn, de kleuringskwaliteit of de toegepaste drempelwaarden (Figuur 1B). Om deze reden moet de onderzoeker een pijplijn opzetten die in staat is om ATG9A Golgi-verrijking te detecteren in hun specifieke experimentele omstandigheden en vervolgens de analyse met dezelfde parameters uit te breiden naar alle beelden in de te analyseren set. Representatieve binaire beelden en gebieden die zijn geselecteerd voor de analyse van de gemiddelde fluorescentie van ATG9A worden als richtlijn weergegeven in figuur 1B.

ATG9A herbergt verschillende transmembraandomeinen geflankeerd door twee relatief flexibele en ongestructureerde N- en C-terminale domeinen, waarvan de C-terminale sequentie bijna de helft van het eiwit12 omvat. Belangrijk is dat het lokalisatiepatroon van overexpressie van ATG9A kan worden beïnvloed door welk eiwituiteinde is gelabeld (Figuur 2A). In het bijzonder, bij het gebruik van transiënte expressiesystemen en het labelen van ATG9A rechtstreeks op zijn N-terminus met een fluorescerende tag (bijv. eGFP, mRFP of derivaten), kan de Golgi-lokalisatie gedeeltelijk worden gecompromitteerd, met minder verrijking gezien in basale (d.w.z. gevoede) omstandigheden, terwijl de ATG9A-blaasjes nog steeds goed zichtbaar zijn (Figuur 2A). Het taggen van ATG9A op zijn C-terminus lijkt enigszins grotere GFP-positieve clusters te induceren die kunnen worden geaggregeerd. Ten slotte vertoont een monomere versie van mRFP-ATG9A ook vergelijkbare fluorescerende clusters van blaasjes en weinig Golgi-kleuring in cellen met overexpressie (Figuur 2A).

ATG9A vouwt zich in het ER-membraan voordat het naar de Golgi- en ATG9A-blaasjes wordt getransporteerd. Tijdens zijn verblijf in het ER wordt ATG9A gemodificeerd door N-gebonden glycanen op Asparagine 99, en bij het bereiken van de Golgi verwerft het complexe, rijpe N-gebonden glycanen 1,14. Deze modificatie door glycosylering kan worden gedetecteerd door middel van western blot door het verschijnen van een dubbele band14. In overeenstemming met de intracellulaire lokalisatie herbergt het meeste endogene ATG9A complexe N-gebonden glycanen, en daarom is de hogere molecuulgewichtband overheersend, met een vage lagere molecuulgewichtband ook zichtbaar (Figuur 2B). De aanwezigheid van een dubbele band is het gemakkelijkst te zien bij het gebruik van Tris-acetaatgels om de resolutie van eiwitten met een hoger molecuulgewicht te verbeteren (Figuur 2B, controle, t = 0). Wanneer het endogene eiwit wordt onderworpen aan PNGase F-behandeling (Peptide:N-glycosidase F), waarbij de meeste complexe N-gebonden glycanen worden verwijderd, werkt het eiwit als een enkele band (Figuur 2B, PNGase F, t = 0). Daarom kan de N-gebonden glycosyleringsstatus van ATG9A worden gebruikt als een proxy om het verlaten van ATG9A van het ER naar de Golgi te volgen, wat wordt weerspiegeld door de relatieve verhouding tussen de twee banden.

Bij transfectie van mRFP-ATG9A wordt tijdelijk geconstrueerd, hoopt het tot overexpressie gebrachte eiwit zich aanvankelijk op in het ER, mogelijk omdat de transportmachine niet in staat is om alle ATG9A te vouwen en te verhandelen, en de onderste molecuulgewichtsband overheerst (Figuur 2C, controle t = 0). Met name na 24 uur expressie van mRFP-ATG9A is er ongeveer een gelijke verdeling tussen de bovenste en onderste banden, wat suggereert dat de mRFP-ATG9A-pool zich verplaatst naar de Golgi (Figuur 2C, Controle, t = 24). Als de cellen worden behandeld met cycloheximide (CHX), dat de novo eiwitsyntheseblokkeert 26, kan het vouwen en verlaten van ATG9A uit het ER worden opgehelderd. Aangezien het endogene eiwit gevouwen, geglycosyleerd en aanwezig is in de Golgi, verandert behandeling met CHX de verhouding tussen de lagere en hogere molecuulgewichtbanden niet significant (Figuur 2B, Controle). Door gebruik te maken van de voorbijgaande expressie van mRFP-ATG9A, bevordert de CHX-behandeling echter de accumulatie van de hogere molecuulgewichtsband (Figuur 2C, Controle, CHX t = 24). De mRFP-ATG9A-band met een hoger molecuulgewicht stort in de onderste band na behandeling met PNGase F (Figuur 2C, PNGase F, t = 24). Deze gegevens tonen aan dat het endogene eiwit snel volwassen glycanen verwerft, zoals blijkt uit het overwicht van de hogere molecuulgewichtband, en dat de CHX-jacht geen invloed heeft op de verhouding van de dubbele banden (Figuur 2B). In het geval van tijdelijk tot overexpressie gebrachte mRFP-ATG9A, induceert CHX-behandeling de accumulatie van de bovenste band, wat aangeeft dat meer rijpe glycanen worden verworven als de ER-pool vouwt en de ER verlaat naar de Golgi (Figuur 2C).

De toevoeging van een linker tussen de ATG9A-sequentie en de fluorescerende tags kan nuttig zijn bij het bevorderen van een meer fysiologische lokalisatie en transport van het eiwit. Het samensmelten van een 3x-FLAG-sequentie (24 aminozuren) tussen een N-terminale fluorofoor en ATG9A helpt het tot overexpressie gebrachte eiwit zich op dezelfde manier te gedragen als het endogene eiwit (Figuur 3). Inderdaad, overexpressie mCherry-3xFLAG-ATG9A colokaliseert met de Golgi-marker GM130 in gevoede omstandigheden (Figuur 3A). Belangrijk is dat deze lokalisatie en het ATG9A vesiculaire compartiment in de loop van de tijd bewaard blijven, waardoor de spatiotemporele studie van de handel in ATG9A mogelijk is (Figuur 3B).

figure-results-1
Figuur 1: Beeldanalyse van endogene ATG9A-lokalisatie. (A) Representatief immunofluorescentiebeeld van endogene ATG9A (rood), GM130 als Golgi-marker (groen) en falloidine om het actinecytoskelet (cyaan) te visualiseren. Schaalbalk = 10 μm. (B) Workflow van de beeldanalyse om de fractie van endogene ATG9A te bepalen die zich in het Golgi-gebied bevindt. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Analyse van fluorescerend gelabelde ATG9A-constructen door lokalisatie en glycosylering . (A) eGFP N-terminaal gelabeld ATG9A is minder gelokaliseerd op de Golgi en bevindt zich voornamelijk in de blaasjes. eGFP C-terminaal gelabeld ATG9A vertoont aggregaten in de cel (sommige voorbeelden zijn gemarkeerd met witte pijlpunten; de eGFP-ATG9A en ATG9A-eGFP zijn groen). mRFP N-terminaal gelabeld ATG9A is minder gelokaliseerd op de Golgi en bevindt zich voornamelijk in de blaasjes. N geeft de geschatte locatie van de celkern aan en de mRFP-ATG9A is rood. Schaalbalk = 5 μm. (B) Endogeen ATG9A verschijnt als twee banden wanneer het wordt geanalyseerd met western blot (pijlpunten): een bovenste band (complexe N-gebonden glycanen) en een onderste band (geen rijpe N-gebonden glycanen). Behandeling met cyclohexamide (CHX) heeft geen invloed op de verhouding tussen de bovenste en onderste banden. Behandeling met PNGase F veroorzaakt het verdwijnen van de bovenste band. (C) Na voorbijgaande transfectie van mRFP-gelabeld ATG9A in HEK293A cellen, zijn twee prominente banden zichtbaar op western blot (pijlpunten). Behandeling met PNGase F veroorzaakt het verdwijnen van de bovenste band. Behandeling met CHX na transfectie leidt tot verhoogde glycosylering omdat de pool van getransfecteerd ATG9A van het ER naar de Golgi wordt getransporteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Analyse van mCherry-3xFLAG-ATG9A lokalisatie door middel van immunofluorescentie en live beeldvorming. (A) Immunofluorescentie-experimenten van HEK293A cellen die tijdelijk mCherry-3xFLAG-ATG9A tot overexpressie brengen en gekleurd met de Golgi-marker GM130. Schaalbalk = 10 μm. De mCherry-3xFLAG-ATG9A is rood en de GM130 Golgi-marker is groen. (B) Montage van live-imaging-experimenten in HEK293A cellen die mCherry-3xFLAG-ATG9A tijdelijk tot overexpressie brengen. N geeft bij benadering de locatie van de kern aan. Tijdsspanne: = 1 fps. Schaalbalk = 10 μm. De mCherry-3xFLAG-ATG9A is uitgevoerd in het rood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie illustreert de verschillende tools die kunnen worden gebruikt om ATG9A-lokalisatie te onderzoeken. Ten eerste beschrijft deze studie hoe ATG9A kan worden gevisualiseerd door immunofluorescentie en hoe dit kan worden gekwantificeerd. Ten tweede worden strategieën vergeleken die kunnen worden gebruikt om ATG9A te taggen met een fluorescerende marker voor visualisatie in vaste of levende cellen. Ten slotte beschrijft dit werk hoe de glycosyleringstoestand van ATG9A kan worden onderzocht en gebruikt om te bepalen of ATG9A het ER heeft verlaten en via de Golgi is gesmokkeld.

Wat betreft de karakterisering van endogene ATG9A-lokalisatie door immunofluorescentie, moet voorzichtig worden omgegaan met de fixatie- en permeabilisatiemethoden die voor het experiment worden gebruikt. Volgens de hier beschreven standaardprocedures zijn paraformaldehydefixatie in combinatie met digitoninepermeabilisatie goede omstandigheden om zowel Golgi-geassocieerde ATG9A- als ATG9A-positieve blaasjes7 te visualiseren. Samen met fixatie en permeabilisatie is ook de timing van incubatie met de primaire antilichaamoplossing van cruciaal belang. We hebben waargenomen, maar niet gedocumenteerd, dat hogere concentraties van primaire antilichaamoplossing en langere incubatietijden kunnen leiden tot een verkeerd representatieve toename van de Golgi-kleuring van ATG9A, wat uiteindelijk de detectie van ATG9A-herverdeling naar andere membraancompartimenten in gevaar brengt. Bovendien, aangezien ATG9A aanwezig is in veel intracellulaire compartimenten 1,13,17,22,23,24,27,28, is het belangrijk om specifieke membraanmarkers te gebruiken, samen met ATG9A, om te identificeren waar ATG9A zich bevindt. In het verleden zijn verschillende benaderingen gebruikt om ATG9A-lokalisatie te kwantificeren, waaronder de correlatiecoëfficiënt van Pearson voor colokalisatie29. De gedeeltelijke overlap van ATG9A met de Golgi en het duidelijke vesiculaire compartiment leidt echter tot een groot aantal pixeluitschieters, wat de interpretatie van de correlatiecoëfficiënt kan beïnvloeden. Om deze reden wordt de voorkeur gegeven aan een meer simplistische benadering op basis van de verhouding van de gemiddelde fluorescentie in de twee te analyseren compartimenten, en deze benadering is minder gevoelig voor cel-voor-cel variabiliteit. Voor meer informatie over beeldanalyse door middel van microscopie wordt verwezen naar dit boek hoofdstuk30.

Bij het onderzoeken van de glycosyleringsstatus van ATG9A is de selectie van gels voor het uitvoeren van de western blots belangrijk. Voor dit protocol hebben 3%-8% Tris-acetaatgels de voorkeur omdat ze de hoogste resolutie bieden voor grotere eiwitten, maar alternatieve gelsamenstellingen of lopende buffers die een goede scheiding van eiwitten met een hoog molecuulgewicht bieden, kunnen ook worden gebruikt. De onderzoeker kan zorgen voor de maximale scheiding van eiwitten door de tijd van elektroforese te verlengen.

Bij het voorbereiden van de monsters om ATG9A op western blot te visualiseren, moet ervoor worden gezorgd dat de monsters niet koken na het toevoegen van de Laemmli-buffer; koken bij 95 °C induceert de vorming van ATG9A-aggregaten, en vervolgens migreert ATG9A niet efficiënt in de gel1. Het wordt aanbevolen om de monsters gedurende 5 minuten op 65 °C te verwarmen27.

Hoge niveaus van transfectie leiden meestal tot een hogere accumulatie van ATG9A in het ER, terwijl matige expressieniveaus de fysiologische lokalisatie van het eiwit helpen. Anekdotisch helpen incubatietijden van 72 uur in plaats van 48 uur vaak om ER-lokalisatieartefacten te verminderen. Met name mRFP-ATG9A kan nauwkeurig rapporteren over ATG9A-handel en functioneren als de niveaus worden gecontroleerd door middel van expressieniveaus of door gebruik te maken van stabiele cellijnen 8,9,22,27.

Het falen van een populatie van tot overexpressie gebracht ATG9A om rijpe N-gebonden glycanen te verwerven, kan worden gebruikt als een uitlezing voor verstoorde ATG9A-handel. Bij het muteren of verwijderen van bepaalde regio's van ATG9A bestaat het risico op verhoogde ER-retentie, wat kan leiden tot het niet verwerven van rijpe N-gebonden glycanen en dus tot een sneller migrerende ATG9A-band op western blot. Onderzoekers die werken met afgeknotte ATG9A-constructen moeten controleren op ER-retentie, glycosyleringstoestanden en Golgi-lokalisatie.

Voor de beeldvorming van levende cellen van ATG9A biedt een Airyscan-microscoop, die vertrouwt op de snelle Airyscan-functie, een optimale resolutie van doorgaans ongeveer 120 nm. Voor lokalisatienauwkeurigheid zijn framesnelheden van ongeveer 1-2 frames per seconde (fps) in de superresolutiemodus optimaal, afhankelijk van het aantal kanalen dat wordt afgebeeld. Soortgelijke confocale microscopen die met hoge snelheid beelden kunnen maken, kunnen ook worden gebruikt voor de beeldvorming van ATG9A-blaasjes; Er moet echter worden opgemerkt dat de beeldvormingssnelheid rechtstreeks van invloed kan zijn op de detectie van gebeurtenissen en dus op de interpretatie van de gegevens.

Samenvattend beschrijven de gepresenteerde protocollen manieren om ATG9A-lokalisatie te kwantificeren en te karakteriseren door middel van immunofluorescentie, live-celmicroscopie en de glycosyleringsstatus ervan. Deze protocollen kunnen onderzoekers die met ATG9A werken helpen en enkele valkuilen helpen vermijden.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.A.T. is lid van de wetenschappelijke adviesraad van Casma Therapeutics.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Rocco D'Antuono voor het proeflezen van aspecten van het manuscript, evenals alle huidige en voormalige leden van het Molecular Cell Biology of Autophagy (MCBA) lab voor de discussies die hebben geleid tot de verfijning van deze protocollen. A. V.V., S.D.T., E.A., S.A.T., werden ondersteund door het Francis Crick Institute, dat zijn kernfinanciering ontvangt van Cancer Research UK (CC2134), de UK Medical Research Council (CC2134). Dit onderzoek werd geheel of gedeeltelijk gefinancierd door de Wellcome Trust (CC2134). Met het oog op open access heeft de auteur een CC BY publieke auteursrechtlicentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortkomt uit deze inzending.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 multiwell plates Falcon353047For tissue culture
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | UncoatedMATTEKP35G-1.5-14-CCell culture dish for live-cell microscopy
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad1610747
60 mm tissue culture dish Thermofisher Scientific10099170For tissue culture
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermofisher ScientificA22287Actin stain
anti-ATG9A antibodyhome madeSTO-215Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A
anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked Invitrogen10794347/NA934-1mlSecondary antibody for rabbit polyclonal STO-215
anti-RFP antibodyEvrogenAB233for Western Blot
ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), InvitrogenInvitrogen15232826Antibody for immunofluorescence
ATG9A-eGFPhome madeConstruct which expresses tagged ATG9A
Bemis ParafilmThermofisher Scientific11747487self-sealing thermoplastic film 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad5000006For determining protein concentration
Bovine serum albumin (BSA) Merck10735086001For blocking non-specific labelling
CaCl2.2H2O/For PBS and EBSS
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche11697498001Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgGJackson ImmunoResearch127-165-099Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence
CyclohexamideSigma Aldrich66-81-9To stop protein translation
D-Glucose/For EBSS
Digitonin Merck300410For permeabilizing cells
DMEMMerckD6546-6x500mlFor tissue culture
eGFP-ATG9Ahome madeConstruct which expresses tagged ATG9A
Fetal Bovine SerumGibco10270-106Supplement for DMEM for cell culture
FIJI (ImageJ)/https:/fiji.sc/Open source image analysis software
Hoechst Thermofisher ScientificH3570Stains the nucleus
KCl/For EBSS
L-glutamine Sigma67513For tissue culture
Lipofectamine 2000 Invitrogen11668-019For Cell Transfection
LSM880 Airyscan microscope Zeiss/Confocal microscopy
MgCl2/For PBS
MgSO4.7H2O/For EBSS
Mowiol mounting solutionMillipore475904for permanent mounting glass coverslips
NaCl/For EBSS
NaH2PO4.2H2O/For EBSS
NaHCO3/For EBSS
NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein GelsThermofisher ScientificEA0378BOXfor Western Blotting
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Life TechNP0002for Western Blotting
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermofisher Scientific31985062For Cell Transfection
Paraformaldehyde Agar ScientificR1026For fixing cells
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9Ahome madeConstruct which expresses tagged ATG9A
Phosphate Buffered Saline (PBS)/For tissue culture
PNGaseFNEB P0710STo remove N-linked glycans
Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000MerckP0899For coating coverslips
Rapid PNGase F enzymeNEBP07105To remove N-linked glycans
RFP-ATG9Ahome madeConstruct which expresses tagged ATG9A
Triton X-100Thermofisher Scientific13454259Detergent for Cell lysis
Trypsin-EDTA solution SigmaT4049For tissue culture
Whatman Filter PaperMerckWHA1001325For Western Blot and IF
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis SystemInvitrogenEI0001For Western Blotting
Zen Black editionZeiss/Used to operate the LSM 880

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes. Journal of Cell Science. 119, 3888-3900 (2006).">Young, A. R., et al. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes. Journal of Cell Science. 119, 3888-3900 (2006).
  2. lipid scrambling activity and role in autophagosome formation of ATG9A. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1194-1201 (2020).">Maeda, S., et al. lipid scrambling activity and role in autophagosome formation of ATG9A. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1194-1201 (2020).
  3. Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1185-1193 (2020).">Matoba, K., et al. Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1185-1193 (2020).
  4. A molecular perspective of mammalian autophagosome biogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5386-5395 (2018).">Mercer, T. J., Gubas, A., Tooze, S. A. A molecular perspective of mammalian autophagosome biogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5386-5395 (2018).
  5. Autophagy genes in biology and disease. Nature Reviews: Genetics. , (2023).">Yamamoto, H., Zhang, S., Mizushima, N. Autophagy genes in biology and disease. Nature Reviews: Genetics. , (2023).
  6. Reconstitution of autophagosome nucleation defines Atg9 vesicles as seeds for membrane formation. Science. 369 (6508), (2020).">Sawa-Makarska, J., et al. Reconstitution of autophagosome nucleation defines Atg9 vesicles as seeds for membrane formation. Science. 369 (6508), (2020).
  7. Autophagosome biogenesis: From membrane growth to closure. Journal of Cell Biology. 219 (6), 202002085(2020).">Melia, T. J., Lystad, A. H., Simonsen, A. Autophagosome biogenesis: From membrane growth to closure. Journal of Cell Biology. 219 (6), 202002085(2020).
  8. Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy. Molecular Biology of the Cell. 23 (10), 1860-1873 (2012).">Orsi, A., et al. Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy. Molecular Biology of the Cell. 23 (10), 1860-1873 (2012).
  9. ATG9A shapes the forming autophagosome through Arfaptin 2 and phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1634-1652 (2019).">Judith, D., et al. ATG9A shapes the forming autophagosome through Arfaptin 2 and phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1634-1652 (2019).
  10. Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles. Nature Communications. 7, 12420(2016).">Karanasios, E., et al. Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles. Nature Communications. 7, 12420(2016).
  11. Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site. Autophagy. 9 (10), 1491-1499 (2013).">Koyama-Honda, I., Itakura, E., Fujiwara, T. K., Mizushima, N. Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site. Autophagy. 9 (10), 1491-1499 (2013).
  12. Structure of human ATG9A, the only transmembrane protein of the core autophagy machinery. Cell Reports. 31 (13), 107837(2020).">Guardia, C. M., et al. Structure of human ATG9A, the only transmembrane protein of the core autophagy machinery. Cell Reports. 31 (13), 107837(2020).
  13. SNX18 regulates ATG9A trafficking from recycling endosomes by recruiting Dynamin-2. EMBO Reports. 19 (4), e44837(2018).">Soreng, K., et al. SNX18 regulates ATG9A trafficking from recycling endosomes by recruiting Dynamin-2. EMBO Reports. 19 (4), e44837(2018).
  14. Molecular determinants that mediate the sorting of human ATG9A from the endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1863 (9), 2299-2310 (2016).">Staudt, C., Gilis, F., Boonen, M., Jadot, M. Molecular determinants that mediate the sorting of human ATG9A from the endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1863 (9), 2299-2310 (2016).
  15. SNX18 tubulates recycling endosomes for autophagosome biogenesis. Autophagy. 9 (10), 1639-1641 (2013).">Knaevelsrud, H., Carlsson, S. R., Simonsen, A. SNX18 tubulates recycling endosomes for autophagosome biogenesis. Autophagy. 9 (10), 1639-1641 (2013).
  16. The Bif-1-Dynamin 2 membrane fission machinery regulates Atg9-containing vesicle generation at the Rab11-positive reservoirs. Oncotarget. 7 (15), 20855-20868 (2016).">Takahashi, Y., et al. The Bif-1-Dynamin 2 membrane fission machinery regulates Atg9-containing vesicle generation at the Rab11-positive reservoirs. Oncotarget. 7 (15), 20855-20868 (2016).
  17. Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation. Journal of Cell Science. 129 (20), 3781-3791 (2016).">Imai, K., et al. Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation. Journal of Cell Science. 129 (20), 3781-3791 (2016).
  18. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation. Molecular Cell. 82 (22), 4324-4339 (2022).">van Vliet, A. R., et al. ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation. Molecular Cell. 82 (22), 4324-4339 (2022).
  20. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (4), 102269(2020).">Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (4), 102269(2020).
  21. Validating antibody specificities for immunohistochemistry by protein blotting. Methods in Molecular Biology. 2593, 21-33 (2023).">Kurien, B. T., Scofield, R. H. Validating antibody specificities for immunohistochemistry by protein blotting. Methods in Molecular Biology. 2593, 21-33 (2023).
  22. TBC1D14 regulates autophagy via the TRAPP complex and ATG9 traffic. EMBO Journal. 35 (3), 281-301 (2016).">Lamb, C. A., et al. TBC1D14 regulates autophagy via the TRAPP complex and ATG9 traffic. EMBO Journal. 35 (3), 281-301 (2016).
  23. TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 197 (5), 659-675 (2012).">Longatti, A., et al. TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 197 (5), 659-675 (2012).
  24. The phosphatidylinositol 3-phosphate-binding protein SNX4 controls ATG9A recycling and autophagy. Journal of Cell Science. 134 (3), (2021).">Ravussin, A., Brech, A., Tooze, S. A., Stenmark, H. The phosphatidylinositol 3-phosphate-binding protein SNX4 controls ATG9A recycling and autophagy. Journal of Cell Science. 134 (3), (2021).
  25. Optimizing leading edge F-actin labeling using multiple actin probes, fixation methods and imaging modalities. BioTechniques. 66 (3), 113-119 (2019).">DesMarais, V., Eddy, R. J., Sharma, V. P., Stone, O., Condeelis, J. S. Optimizing leading edge F-actin labeling using multiple actin probes, fixation methods and imaging modalities. BioTechniques. 66 (3), 113-119 (2019).
  26. Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).">Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  27. Coordinated regulation of autophagy by p38alpha MAPK through mAtg9 and p38IP. EMBO Journal. 29 (1), 27-40 (2010).">Webber, J. L., Tooze, S. A. Coordinated regulation of autophagy by p38alpha MAPK through mAtg9 and p38IP. EMBO Journal. 29 (1), 27-40 (2010).
  28. ATG9A protects the plasma membrane from programmed and incidental permeabilization. Nature Cell Biology. 23 (8), 846-858 (2021).">Claude-Taupin, A., et al. ATG9A protects the plasma membrane from programmed and incidental permeabilization. Nature Cell Biology. 23 (8), 846-858 (2021).
  29. Image co-localization - Co-occurrence versus correlation. Journal of Cell Science. 131 (3), 211847(2018).">Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. Image co-localization - Co-occurrence versus correlation. Journal of Cell Science. 131 (3), 211847(2018).
  30. Principles of Light Microscopy: From Basic to Advanced. Nechyporuk-Zloy, V. , Springer. Cham, Switzerland. 77-104 (2022).">D'Antuono, R. Basic digital image acquisition, design, processing, analysis, management, and presentation. Principles of Light Microscopy: From Basic to Advanced. Nechyporuk-Zloy, V. , Springer. Cham, Switzerland. 77-104 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ATG9A TraffickingAutophagy PathwayMulti Spanning Membrane ProteinImmunofluorescence ImagingVesicle TraffickingConfocal MicroscopyProtein TaggingPhagophore FormationLive Cell ImagingGolgi Localization

Related Articles