Methodenartikel

Een pacing-gecontroleerde procedure voor de beoordeling van hartslagafhankelijke diastolische functies in muizen hartfalen modellen

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65384

⸱

21 juli 2023

 , 
1Department of Cardiovascular Medicine, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Therapeutic Strategy for Heart Failure, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division of Cardiology, Department of Medicine, The Johns Hopkins Medical Institutions

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft het verkrijgen van de druk-volumerelatie door middel van transoesofageale stimulatie, wat dient als een waardevol hulpmiddel bij het evalueren van de diastolische functie in muismodellen van hartfalen.

Samenvatting

Hartfalen met behouden ejectiefractie (HFpEF) is een aandoening die wordt gekenmerkt door diastolische disfunctie en inspanningsintolerantie. Hoewel inspanningsstressvolle hemodynamische tests of MRI kunnen worden gebruikt om diastolische disfunctie te detecteren en HFpEF bij mensen te diagnosticeren, zijn dergelijke modaliteiten beperkt in fundamenteel onderzoek met behulp van muismodellen. Een loopbandoefeningstest wordt vaak voor dit doel gebruikt bij muizen, maar de resultaten kunnen worden beïnvloed door lichaamsgewicht, skeletspierkracht en mentale toestand. Hier beschrijven we een atrial-pacing-protocol om hartslag (HR)-afhankelijke veranderingen in diastolische prestaties te detecteren en het nut ervan te valideren in een muismodel van HFpEF. De methode omvat het verdoven, intuberen en uitvoeren van druk-volume (PV) lusanalyse gelijktijdig met atriale stimulatie. In dit werk werd een geleidingskatheter ingebracht via een apicale benadering van het linkerventrikel en werd een atriale pacingkatheter in de slokdarm geplaatst. Baseline PV-lussen werden verzameld voordat de HR werd vertraagd met ivabradine. PV-lussen werden verzameld en geanalyseerd in HR-stappen variërend van 400 bpm tot 700 bpm via atriale pacing. Met behulp van dit protocol hebben we duidelijk HR-afhankelijke diastolische stoornissen aangetoond in een metabolisch geïnduceerd HFpEF-model. Zowel de relaxatietijdconstante (Tau) als de einddiastolische druk-volumerelatie (EDPVR) verslechterden naarmate de HR toenam in vergelijking met controlemuizen. Kortom, dit atriale pacing-gecontroleerde protocol is nuttig voor het detecteren van HR-afhankelijke hartdisfuncties. Het biedt een nieuwe manier om de onderliggende mechanismen van diastolische disfunctie in HFpEF-muismodellen te bestuderen en kan helpen bij het ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor deze aandoening.

Inleiding

Hartfalen is een belangrijke oorzaak van ziekenhuisopname en overlijden over de hele wereld, en hartfalen met behouden ejectiefractie (HFpEF) is goed voor ongeveer 50% van alle diagnoses van hartfalen. HFpEF wordt gekenmerkt door diastolische disfunctie en verminderde inspanningstolerantie, en de geassocieerde hemodynamische afwijkingen, zoals diastolische disfunctie, kunnen duidelijk worden gedetecteerd door middel van inspanningsstressvolle hemodynamische tests of MRI-scans 1,2.

In experimentele modellen zijn de beschikbare modaliteiten voor het beoordelen van de fysiologische afwijkingen gerelateerd aan HFpEF echter beperkt 3,4. Loopbandinspanningstesten (TMT) worden gebruikt om de looptijd en afstand te bepalen, wat een weerspiegeling kan zijn van de harthemodynamica van inspanningsstress; Deze methode is echter gevoelig voor interferentie van externe variabelen zoals het lichaamsgewicht, de kracht van de skeletspieren en de mentale toestand.

Om deze beperkingen te omzeilen, hebben we een atrial-pacing-protocol bedacht dat subtiele maar cruciale veranderingen in diastolische prestaties detecteert op basis van de hartslag (HR) en hebben we het nut ervan gevalideerd in een muismodel van HFpEF5. Verschillende fysiologische factoren dragen bij aan inspanningsgerelateerde hartfunctie, waaronder de sympathische zenuw- en catecholaminerespons, perifere vasodilatatie, de endotheelrespons en de hartslag6. Hiervan staat echter de HR-drukrelatie (ook wel het Bowditch-effect genoemd) bekend als een kritische determinant van cardiale fysiologische kenmerken 7,8,9.

Het protocol omvat het uitvoeren van een conventionele druk-volumeanalyse bij baseline om de systolische en diastolische functie te beoordelen, inclusief parameters zoals de snelheid van drukontwikkeling (dp/dt), de eindsystolische druk-volumerelatie (ESPVR) en de einddiastolische druk-volumerelatie (EDPVR). Er moet echter worden opgemerkt dat deze parameters worden beïnvloed door de HR, die tussen dieren kan variëren als gevolg van verschillen in hun intrinsieke hartslag. Daarnaast moet ook rekening worden gehouden met de effecten van anesthesie op de HR. Om dit aan te pakken, werd de HR gestandaardiseerd door atriale stimulatie gelijktijdig met ivabradine toe te dienen, en werden cardiale parametermetingen uitgevoerd bij incrementele hartslagen. Met name de HR-afhankelijke hartrespons onderscheidde HFpEF-muizen van de muizen uit de controlegroep, terwijl er geen significante verschillen werden waargenomen in de baseline PV-lusmetingen (met behulp van de intrinsieke hartslag)5.

Hoewel dit pacing-protocol relatief ingewikkeld lijkt, is het slagingspercentage meer dan 90% als het goed wordt begrepen. Dit protocol zou een nuttige manier zijn om de onderliggende mechanismen van diastolische disfunctie in HFpEF-muismodellen te bestuderen en te helpen bij de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor deze aandoening.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit dierprotocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee en volgde de voorschriften voor dierproeven en aanverwante activiteiten aan de Universiteit van Tokio. Voor de huidige studie werden mannelijke C57/Bl6J-muizen van 8-12 weken oud gebruikt. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie de materiaaltabel). Een model van HFpEF werd opgesteld door gedurende 15 weken een vetrijk dieet toe te dienen in combinatie met NG-nitro-L-argininemethylester, zoals eerder beschreven10.

1. Kathetervoorbereidingen en druk-/volumekalibratie

  1. Plaats een geleidingskatheter in een normale zoutoplossing en bevestig deze aan een module bestaande uit de PowerLab 8/35 en een druk-volume-eenheid (MPVS-module, zie de materiaaltabel).
  2. Kalibreer de druk en het volume elektronisch door de registratie van vooraf bepaalde druk- (0 mmHg en 100 mmHg) en volumeparameters (deze variëren per MPVS-module) op de MPVS-module 3,11 (zie ook de instructies van de fabrikant).

2. Een dier voorbereiden op katheterisatie

  1. Anesthesie en beademing
    1. Dien 5-10 minuten voorafgaand aan de intubatie een intraperitoneale injectie toe van 5 mg/kg etomidaat en 500 mg/kg urethaan (zie de materiaaltabel).
      OPMERKING: Urethaan, hoewel effectief als verdovingsmiddel in dierstudies, wordt ervan verdacht kankerverwekkend te zijn voor de mens. Wanneer urethaan noodzakelijk is voor het bereiken van experimentele doelstellingen en er geen alternatieve middelen volstaan, moet er daarom voorzichtig mee worden omgegaan. Passende beschermende maatregelen, zoals het dragen van handschoenen en maskers en het gebruik van een zuurkast tijdens de bereiding, zijn verplicht. Als mogelijk alternatief zou ketamine (80 mg/kg, ip) kunnen worden gebruikt.
    2. Plaats de muis in een anesthesiekamer die eerder verzadigd is met 2% isofluraan en breng het dier over naar een voorverwarmd verwarmingskussen dat bij de inductie van de anesthesie tussen 38 °C en 40 °C wordt gehouden.
    3. Scheer het operatiegebied. Desinfecteer vervolgens de operatieplaats met drie afwisselende rondes betadine en alcohol.
    4. Maak een horizontale incisie (1-2 cm) in de nek, snijd de tracheale spier weg en leg de luchtpijp bloot. Breng een chirurgische 2-0 zijden hechting onder de luchtpijp aan, til deze op en maak een kleine incisie (1-2 mm) om deze te openen.
    5. Steek een endotracheale tube in de luchtpijp en sluit deze aan op een beademingsapparaat dat een mengsel van 100% zuurstof en 2% isofluraan afgeeft (later teruggebracht tot 0,5% tot 1%).
  2. Centraal veneuze (CV) katheter inbrengen en vloeistofinjectie
    1. Lokaliseer de interne halsader onder de sternocleidomastoïde spier3.
    2. Breng de centraal veneuze katheter, bestaande uit PE-10 silastische slangen (zie de materiaaltabel) bevestigd aan een naald van 30 G, in de halsader.
    3. Dien een bolusinfusie toe van 5-6 μL/g lichaamsgewicht van 10% albumine/NaCl gedurende 3 minuten, gevolgd door een constante infusiesnelheid van 5-10 μL/min.
      OPMERKING: Deze stap is cruciaal voor het voorkomen van hypotensie als gevolg van de perifere vasodilatatie veroorzaakt door de anesthesie. De interne halsader bevindt zich tussen de sternocleidomastoïde spier en de halsslagader en lijkt donkerder van kleur dan de slagader.

3. Chirurgische ingreep voor linkerventrikelkatheterisatie (open thoraxbenadering)

  1. Scheer het operatiegebied van de verdoofde muis. Desinfecteer vervolgens de operatieplaats met drie afwisselende rondes betadine en alcohol.
  2. Bevestig de diepte van de anesthesie door een teenknijp uit te voeren. Maak vervolgens een horizontale incisie (2-3 cm) onder het xiphoid-proces en scheid de huid van de borstwand met een botte schaar.
  3. Snijd aan beide zijden zijdelings door de borstwand met behulp van elektrische cauterisatie (zie de tabel met materialen).
  4. Leg het hart bloot door het middenrif door te snijden en verwijder het hartzakje voorzichtig met een pincet uit het hart.
  5. Steek een naald van 27 G in de apex van de linker hartkamer (LV) en breng retrograde een geleidingskatheter in de LV via het prikgat.
  6. Pas de positie van de katheter zo aan dat een vierkante druk-volumelus wordt verkregen.
  7. Controleer of de katheter geen contact maakt met de papillaire spier wanneer er veranderingen in de belastingsomstandigheden optreden door de vorm van de PV-lus te controleren tijdens occlusie van de inferieure vena cava (IVC).
    OPMERKING: Adequate blootstelling van het hart vergemakkelijkt de procedure en helpt om een duidelijk zicht te krijgen.

4. Registratie van PV-lusgegevens en bepaling van de eindsystolische druk-volumerelatie (ESPVR) en de einddiastolische druk-volumerelatie (EDPVR)

NOTITIE: Door de voorbelasting door IVC-occlusie te verminderen, kunnen de ESPVR en EDPVR worden bepaald.

  1. Registreer en analyseer de basislijn druk-volume (PV)-lus met LabChart-software (zie de materiaaltabel), PowerLab en de MPVS-module na signaalstabilisatie (5-10 min na canulatie).
  2. Voer IVC-occlusie uit door de IVC samen te drukken met een pincet en registreer de PV-lus gedurende ten minste 20 hartcycli tijdens de IVC-occlusie. Bepaal de ESPVR door een lineaire regressielijn door de eindsystolische punten van de PV-lus te plaatsen en de EDPVR door een kromlijnige lijn door de einddiastolische punten van de PV-lus te plaatsen met behulp van LabChart-software.
    NOTITIE: Stop de beademingsmachine tijdens de IVC-occlusie om longbewegingsartefacten te voorkomen. Een verlammingsmiddel zoals pancuronium (0,5-1 mg/kg) kan nuttig zijn wanneer de longbeweging te groot is en mag alleen worden gebruikt nadat een stabiel anesthesievlak is bevestigd.

5. Transoesofageale stimulatie

  1. Steek een 2-Fr tetrapolaire elektrodekatheter in de slokdarm, sluit de katheter aan op een pulsstimulator (zie de materiaaltabel) en bepaal de drempel voor het vastleggen van het atrium (normaal gesproken is de stimulusamplitude 3 mA en de pulsbreedte is 1 ms).
  2. Vertraag de hartslag tot onder de 400 slagen/min met 20 mg/kg ivabradine (zie de materiaaltabel) intraperitoneaal toegediend.
  3. Verkrijg na stabilisatie 20 continue hartcycli van PV-lussen met verschillende temposnelheden van 400 slagen/min tot 700 slagen/min, met een toename van 100 slagen/min; Verkrijg de cycli gedurende 5 minuten bij elk tempo.

6. Kalibratie van zoutoplossing en aortastroom

  1. Inactiveer het beademingsapparaat en dien een 5-10 μL hypertone zoutoplossing intraveneus toe via de CV-katheter.
  2. Documenteer de fluctuaties in druk en volume tijdens de zoutoplossing injectie en bereken de Vp-waarde met behulp van PowerLab 3,11.
  3. Herhaal de kalibratie van de zoutoplossing om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te verbeteren.
  4. Draai de muis naar zijn linkerkant om het volumesignaal niet te verstoren.
  5. Maak een laterale thoracotomie tussen Th3 en Th5 in de richting van de wervelkolom en ontleed voorzichtig een klein deel van de dalende aorta met een pincet.
  6. Plaats een vasculaire flowsonde (zie de materiaaltabel) over de aorta om het hartminuutvolume te meten.
    OPMERKING: De nauwkeurige berekening van het absolute volume vereist het gebruik van twee soorten kalibratie: kalibratie van zoutoplossing en kalibratie van de aortastroom. Het is belangrijk om de potentiële risico's te erkennen die gepaard gaan met een hypertone infusie met zoutoplossing bij proefdieren, aangezien overmatige zoutbelasting kan leiden tot een afname van de contractiliteit.

7. Euthanasie

  1. Na het onderzoek euthanaseer je de muizen onder een overdosis verdoving via cervicale dislocatie.
    OPMERKING: Om de volledige stopzetting van de vitale functie te garanderen, wordt een secundaire methode van euthanasie gebruikt, zoals verbloeding onder anesthesie met daaropvolgende oogst van hartweefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De basisgegevens van de PV-lus worden weergegeven in figuur 1 en tabel 1. Bij aanvang (bij afwezigheid van stimulatie) waren er geen significante verschillen in diastolische parameters zoals de relaxatietijdconstante (Tau), de minimale snelheid van drukverandering (dP/dt min) en EDPVR tussen de controle- en HFpEF-muizen. De HFpEF-muizen vertoonden echter een hogere bloeddruk en arteriële elastantie (Ea), zoals weergegeven in figuur 1, en vertoon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteren een methodologie om druk-volumerelaties te beoordelen met de toepassing van transoesofageale stimulatie. Inspanningsintolerantie is een van de belangrijkste kenmerken van HFpEF, maar er zijn geen technieken beschikbaar voor de evaluatie van de hartfunctie bij muizen tijdens inspanning. Ons pacingprotocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het detecteren van diastolische disfunctie, die mogelijk niet zichtbaar is onder rustomstandigheden.

Om een PV-lus van nauwkeurige en constan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er zijn geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de Fukuda Foundation for Medical Technology (aan E.T. en G.N.) en de JSPS KAKENHI Scientific Research Grant-in-Aid 21K08047 (aan E.T.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-0 silk suture, sterlieAlfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan62-9965-57Chirurgische benodigdheden
2-Fr tetrapolar electrode catheterFukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japanop maat gemaaktChirurgische benodigdheden
Albumin Bovine SerumNacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan01859-47Diverse
C57/BI6J muisJackson Laboratorydieren
Conductance catheterMillar Instruments, Houston, TXPVR 1035
Elektrische cauter, Electrocautery Knife Kitellman-Japan,Osaka, Japan1-1861-21Chirurgische benodigdheden
EtomidateTokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo JapanE0897Anesthetisch
Grass Instrument S44G Square Pulse StimulatorAstro-Med, West Warwick, RIPacingapparatuur
IsofluraanViatris Inc., Tokyo, Japan8803998Anesthetisch
IvabradineTokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo JapanI0847Diverse
LabChart softwareADInstruments, Sydney, AustraliaLabChart 7Hemodynamische apparatuur
MPVS UltraMillar Instruments, Houston, TXPL3516B49Hemodynamische apparatuur
PancróniumbromideSigma Aldrich Co., St. Louis, MO15500-66-0Anesthetisch
PE10 polyethyleenbuisBio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan62101010Chirurgische benodigdheden
PowerLab 8/35ADInstruments, Sydney, AustraliaPL3508/PHemodynamische apparatuur
PVR 1035Millar Instruments, Houston, TX842-0002Hemodynamische apparatuur
Urethane (Ethyl Carbamate)Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan050-05821Anesthetisch
Vascular Flow ProbeTransonic, Ithaca, NYMA1PRBChirurgische benodigdheden

Referenties

  1. Backhaus, S. J. Exercise stress real-time cardiac magnetic resonance imaging for noninvasive characterization of heart failure with preserved ejection fraction. Circulation. 143 (15), 1484-1498 (2021).
  2. Borlaug, B. A., Nishimura, R. A., Sorajja, P., Lam, C. S. P., Redfield, M. M. Exercise hemodynamics enhance diagnosis of early heart failure with preserved ejection fraction. Circulation. Heart Failure. 3 (5), 588-595 (2010).
  3. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., David, A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
  4. Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2198-2206 (2011).
  5. Numata, G., et al. A pacing-controlled protocol for frequency-diastolic relations distinguishes diastolic dysfunction specific to a mouse HFpEF model. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 323 (3), H523-H527 (2022).
  6. Piña, I. L., et al. Exercise and heart failure. Circulation. 107 (8), 1210-1225 (2003).
  7. Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Minimal force-frequency modulation of inotropy and relaxation of in situ murine heart. Journal of Physiology. 534 (2), 535-545 (2001).
  8. Takimoto, E., et al. Frequency- and afterload-dependent cardiac modulation in vivo by troponin I with constitutively active protein kinase A phosphorylation sites. Circulation Research. 94 (4), 496-504 (2004).
  9. Meyer, M., Lewinter, M. M. Heart rate and heart failure with preserved ejection fraction: Time to slow β-blocker use? Circulation. Heart Failure. 12 (8), 006213(2019).
  10. Schiattarella, G. G., et al. Nitrosative stress drives heart failure with preserved ejection fraction. Nature. 568 (7752), 351-356 (2019).
  11. Abraham, D., Mao, L. Cardiac pressure-volume loop analysis using conductance catheters in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942(2015).
  12. Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac catheterization in mice to measure the pressure volume relationship: Investigating the Bowditch effect. Journal of Visualized Experiments. (100), e52618(2015).
  13. Townsend, D. W. Measuring pressure volume loops in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810(2016).
  14. Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), H47(2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Diastolische dysfunctieatriumstimulatiedruk volumelussenHFpEF muismodellenbeoordeling van de hartfunctiehartslagafhankelijkheidconductiekathetereinddiastolische drukrelaxatieconstante

Gerelateerde artikelen