Methodenartikel

Geoptimaliseerde geautomatiseerde analyse van homeostasemodulatie van levende neuronale mitochondriën door isovormspecifieke retinoïnezuurreceptoren

DOI:

10.3791/65452

⸱

28 juli 2023

 ,  ,  , 
1Neuroscience and Signalling Laboratory, Institute of Biomedicine (iBiMED), Department of Medical Sciences, University of Aveiro

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het mitochondriale netwerk is uiterst complex, waardoor het zeer uitdagend is om te analyseren. Een nieuwe MATLAB-tool analyseert live confocale mitochondriën in timelapse-beelden, maar resulteert in een groot uitvoervolume dat individuele handmatige aandacht vereist. Om dit probleem aan te pakken, werd een routinematige optimalisatie ontwikkeld, waardoor een snelle bestandsanalyse mogelijk is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het complexe mitochondriale netwerk maakt het zeer uitdagend om levende cellen te segmenteren, te volgen en te analyseren. MATLAB-tools maken de analyse van mitochondriën in timelapse-bestanden mogelijk, waardoor het proces van beeldverwerking aanzienlijk wordt vereenvoudigd en versneld. Desalniettemin produceren bestaande tools een groot uitvoervolume, dat individuele handmatige aandacht vereist, en experimentele basisopstellingen hebben een uitvoer van duizenden bestanden, die elk een uitgebreide en tijdrovende verwerking vereisen.

Om deze problemen aan te pakken, werd een routinematige optimalisatie ontwikkeld, zowel in MATLAB-code als in live-script-vormen, waardoor een snelle bestandsanalyse mogelijk is en het lezen en verwerken van documenten aanzienlijk wordt verminderd. Met een snelheid van 100 bestanden/min maakt de optimalisatie een algehele snelle analyse mogelijk. De optimalisatie bereikt de resultaten door het gemiddelde te nemen van framespecifieke gegevens voor individuele mitochondriën gedurende tijdsbestekken, waarbij gegevens op een gedefinieerde manier worden geanalyseerd, consistent met die uitvoer van bestaande tools. Live confocale beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de kleurstof tetramethylrhodaminemethylester, en de routinematige optimalisatie werd gevalideerd door neuronale cellen te behandelen met retinoïnezuurreceptor (RAR)-agonisten, waarvan de effecten op neuronale mitochondriën in de literatuur zijn vastgesteld. De resultaten waren consistent met de literatuur en maakten verdere karakterisering van het gedrag van mitochondriale netwerken mogelijk als reactie op isovormspecifieke RAR-modulatie.

Deze nieuwe methodologie maakte een snelle en gevalideerde karakterisering van het mitochondriënnetwerk van hele neuronen mogelijk, maar het maakt ook differentiatie mogelijk tussen axon- en cellichaammitochondriën, een essentieel kenmerk om toe te passen op het gebied van neurowetenschappen. Bovendien kan dit protocol worden toegepast op experimenten met snelwerkende behandelingen, waardoor dezelfde cellen voor en na behandelingen kunnen worden afgebeeld, wat het gebied van de neurowetenschappen overstijgt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulaire mitochondriën bevinden zich in het centrum van alle fysiologische toestanden, en een grondig begrip van hun homeostase (mitostase) en gedrag is van het grootste belang om te helpen bij het identificeren van farmacologische behandeling voor een breed scala aan ziekten, waaronder kanker en de ziekte van Alzheimer 1,2.

Mitochondriën spelen een cruciale cellulaire rol bij energiehomeostase, ATP-generatie, calciumbuffering en ROS-regulatie, en mitostase is essentieel voor het handhaven van eiwithomeostase, aangezien moleculaire chaperonnes energieafhankelijk zijn3. Deze vereisen een constante en dynamische netwerkmodulatie en -aanpassing om efficiënt aan de cellulaire behoeften te voldoen, en het transport van mitochondriën wordt gereguleerd door verschillende signaalroutes; Eerder werk heeft zo'n route beschreven, die van retinoïnezuurreceptoren (RAR's)4,5. Retinoïnezuur (RA) bevordert axonale en neurietuitgroei via RAR-activering. In primaire corticale neuronen van muizen stimuleert activering van RAR-β mitochondriale groei, snelheid en mobiliteit in de neuriet6.

Gezien het aanpassingsvermogen en de dynamiek van het mitochondriale netwerk, is de mogelijkheid om mitostase in "realtime" te beoordelen essentieel, niet alleen voor het onderzoeken van energiehomeostase, maar ook voor proteostase, cellulaire gezondheid, proliferatie of signalering. Een veelgebruikte methode voor het evalueren van mitostase is gebaseerd op confocale microscopie na het markeren van mitochondriën met behulp van een fluorescerende kleurstof of marker, evenals een specifieke microscopie-opstelling die temperatuur- en/of CO2 -regulatie mogelijkmaakt 7. Dit type experimentele opstelling houdt in dat één experimentele replicatie tegelijk wordt uitgevoerd. Naast experimentele herhaling van verschillende behandelingen, moet er rekening mee worden gehouden dat de meeste experimenten hun technische replica's moeten hebben (waarbij meer dan één positie per plaat wordt afgebeeld), waarbij een reeks brandpuntsvlakken (z-stacks) wordt geregistreerd in een reeks tijdstippen. Een experimenteel ontwerp met drie herhalingen van één controle en twee behandelingen, met vijf beeldvormingsposities per plaat en 15 tijdstippen, resulteert dus in 225 te verwerken stapels. Klassiek werden video's van levende mitochondriën geanalyseerd door kymografen uit te zetten, die individueel zouden worden geanalyseerd8, in een tijdrovend proces dat uitgebreide handmatige invoer vereiste, zelfs wanneer men vertrouwde op computerhulpmiddelen.

Onlangs is een algoritme beschreven9 dat geautomatiseerde segmentatie en tracking van mitochondriën in live-cell 2D- en 3D-time-lapse-bestanden mogelijk maakt. Er zijn andere kwantificeringstechnieken beschikbaar, die allemaal hun beperkingen hebben10. Mitometer, een geautomatiseerde open-source applicatie, is met name geschikt voor time-lapse en analyse van de dynamiek van mitochondriën, waarvoor een lage gebruikersinput nodig is. Deze toepassing heeft een reeks voordelen ten opzichte van andere bestaande MATLAB-gebaseerde tools, namelijk het mogelijk maken van de automatische verwerking van individuele TIF-stacks, met behulp van maximaal 13 verschillende parameters, vooral interessant voor neurowetenschappen, omdat het onderscheid maakt tussen peri- en telenucleaire mitochondriën.

Voor een experiment zoals hierboven beschreven, resulteren deze 13 parameters toegepast op 225 stapels echter in 2.925 individuele uitvoerbestanden. Deze vereisen vier afzonderlijke computerinvoer, wat neerkomt op meer dan 10.000 handmatige invoer die nodig is om alle uitvoerbestanden te downloaden. Voor grote experimentele ontwerpen resulteert dit in een onnodig extreem tijdrovende analyse van elk bestand en data-integratie. Hierin presenteren we een routinematige optimalisatie die een snelle bestandsanalyse mogelijk maakt, het lezen en verwerken van documenten aanzienlijk vermindert, en gegevens op een gedefinieerde manier analyseert, consistent met de output van bestaande tools.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Dit protocol bestaat uit twee hoofdstappen: een natte laboratoriumstap, waarbij celkweek en levende confocale microscopie worden gebruikt om beelden van levende mitochondriën te verkrijgen (Figuur 1) en een in silico-stap om verkregen beelden te analyseren (Figuur 2). Voor geautomatiseerde data-analyse van 3D live gebeelde mitochondriën werd de MATLAB-applicatie Mitometer gebruikt zoals geleverd door Lefebvre et al.9. De Routine optimalisatie is geschreven in MATLAB. De software, bijgewerkte versies en verwerking van ImageJ-macro's zijn gratis online beschikbaar via GitHub, op https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.

1. Levende microscopie

figure-protocol-1
Figuur 1: Experimenteel protocol. SH-SY5Y-cellen werden gedifferentieerd en behandeld met retinoïden. (A) TMRM werd gebruikt om gezonde mitochondriën in behandelde cellen live in beeld te brengen met behulp van een confocale microscoop, waarbij een time-lapse z-stack van vijf gezichtsvelden werd vastgelegd. (B) Mitometertoepassing MATLAB segmenteert en analyseert automatisch mitochondriënbeelden. Naast het analyseren discrimineert deze software automatisch mitochondriën op basis van nucleaire nabijheid. Blauwe stippen zijn mitochondriale beginposities; Rode stippen zijn eindposities. Schaalbalk = 30 μm. Afkorting: TMRM = tetramethylrhodamine, methylester. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Celkweek
    1. Incubeer SH-SY5Y-cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht, gekweekt in gelijke delen MEM (Minimal Essential Medium) en F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
    2. Plaat SH-SY5Y-cellen in celschalen met glazen bodem met een dichtheid van 15 × 104 cellen/ml.
    3. Differentieer cellen met 5 dagen behandeling met 10 μM all-trans-retinoïnezuur in 1% FBS-bevattend kweekmedium, gevolgd door 2 dagen behandeling met 10 ƞg/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
  2. Celbehandeling
    1. Was de cellen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en behandel gedurende 72 uur met 10-7 M RAR-isovormagonisten, in gelijke delen MEM (Minimal Essential Medium) en F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, aangevuld met 1% FBS.
      OPMERKING: De gebruikte RARα-agonist was AM580; De gebruikte RARβ-agonist was CD2314; Ch55 werd gebruikt als agonist als RARα en β co-agonist; opRA werd gebruikt als positieve controle; BMS493 werd gebruikt als een RAR-pan-antagonist.
  3. Live confocale beeldvorming
    1. Vervang het kweekmedium door vers 1% FBS-bevattend kweekmedium met 20 nM tetramethylrhodamine, methylester (TMRM) gedurende 45 min.
      OPMERKING: TMRM is een celgepermeaneerde fluorescerende kleurstof, afgezonderd door actieve mitochondriën, en deze incubatietijd stelt TMRM in staat een evenwicht te bereiken en te worden opgenomen door gepolariseerde mitochondriën11. Beeldvorming moet worden gestart voordat het evenwicht is bereikt, aangezien de intensiteit van het TMRM-signaal tijdens beeldvorming kunstmatig kan toenemen.
    2. Plaats de cellen in een incubator die is bevestigd aan een confocale microscoop met laserscanning bij 37 °C.
    3. Leg beelden vast met behulp van een 63x olie-immersie apochromaat objectief, met een beeldgrootte van 512 x 512 pixels verkregen met een gaatje diafragma van 1 luchtige eenheid, het vastleggen van een tijdreeks van 15 frames van vijf verschillende gezichtsvelden in elke celplaat, en een z-stack van 8 op gelijke afstand z-vlakken. Het resulterende .lsm-bestand is een tijd-, positie- en z-stack.
      NOTITIE: Instellingen voor versterking, contrast en helderheid moeten in eerste instantie worden geoptimaliseerd met behulp van het minimale laservermogen dat nodig is om het volledige dynamische bereik van de detector te gebruiken en gedurende het hele onderzoek constant worden gehouden, zodat alle beeldvorming onder dezelfde omstandigheden wordt uitgevoerd. In deze hardware-softwarecombinatie kunnen maximaal negen verschillende posities worden vastgelegd en de microscoop schakelt automatisch tussen beeldposities.

2. Beeldanalyse

figure-protocol-2
Figuur 2: Routinematige optimalisatie. (A) Representatieve code van de routinematige optimalisatie. (B) Routinematige optimalisatie Live-Script. (C) Routinematige optimalisatieworkflow. (D) Validatie van routinematige optimalisatieresultaten: representatief beeld van mitochondriën in onbehandelde cellen (linkerpaneel), behandeld met RA(10-7 M, 72 uur, middelste paneel) en behandeld met RAR-antagonist BMS493 (10-7 M, 72 uur, rechterpaneel), afgebeeld na incubatie met TMRM (20 nM, 45 min incubatie). Schaalbalk = 30 μm. (E) TMRM-intensiteit in de mitochondriën van het cellichaam. Significante afname bij behandeling met all-transretinoïnezuur (bijRA, 10-7 M, 72 uur), vergeleken met de controlegroep (p=0,0062), niet waargenomen bij behandeling met RAR-antagonist (BMS493, 10-7 M, 72 uur). Vijf cellen werden gekwantificeerd van elk van de drie herhalingen per aandoening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Beeldverwerking
    1. Bestanden openen in ImageJ 2.1.0 en positiestapels scheiden per gezichtsveld: Open ImageJ en klik op Menubalk | Afbeelding | Dupliceren | Invoersegmenten/framenummer | Oké.
      OPMERKING: Om het aantal herhaalde invoer in de software te verminderen, is een ImageJ Macro ontwikkeld om het dupliceren en opslaan van gezichtsveldbeelden te vergemakkelijken.
  2. Macro protocol
    1. Teken een interessegebied (ROI) rond de cel met het gereedschap voor vrije selectie.
    2. Voer de macro uit door ImageJ te openen en naar Menubalk | Insteekfilters | Macro's | Voer de macro Achtergrond wissen en afbeeldingen opslaan uit.
      OPMERKING: Afbeeldingen kunnen in dit proces worden gerandomiseerd, waarbij de oplossingssleutel wordt opgeslagen volgens de optimalisatievereisten.
    3. Pixelgrootte en voxeldiepte bepalen: Open ImageJ | de afbeelding en navigeer naar Menubalk | Afbeelding | Eigenschappen.
  3. Alternatief direct protocol
    OPMERKING: Dit alternatief maakt geen gebruik van Macro om afbeeldingen te verwerken
    1. Zoek de pixelgrootte en voxeldiepte: Open ImageJ | Open Afbeelding en navigeer naar Menubalk | Afbeelding | Eigenschappen.
    2. Teken een ROI rond de cel met het gereedschap voor vrije selectie en zorg ervoor dat deze de hele cel gedurende de 15 frames omvat.
    3. Navigeer naar menubalk | Bewerken | Ruim buiten.
    4. Navigeer naar menubalk | Bestand | Opslaan als | Selecteer Tiff.
    5. Selecteer Map opslaan en klik op Opslaan.
      OPMERKING: Afbeeldingen kunnen op dit punt handmatig worden geblindeerd/gerandomiseerd voordat ze doorgaan met analyseren.
  4. Geautomatiseerde beeldanalyse
    1. Bereid de mappen voor analysebestanden voor.
      1. Maak drie hoofdmappen, getiteld "Alle sporen", "Perinucleaire sporen" en "Telenucleaire sporen".
        OPMERKING: Deze komen overeen met de belangrijkste geautomatiseerde trackopties.
      2. Maak in elke hoofdmap een submap voor elke afbeelding die u wilt verwerken, numeriek geïdentificeerd vanaf 1 en hoger.
      3. Voeg een kopie van de twee aanvullende routinematige optimalisatiebestanden (mitometer2table.m en getTXTfiles.m) toe aan elke afbeeldingsmap.
        OPMERKING: Deze bestanden helpen bij de analyse van de gegevens en de uiteindelijke indeling van het formaat. Het aantal mappen moet overeenkomen met het aantal elementen in de gerandomiseerde spreadsheet (.xlsx). Nadat alle genummerde submappen met aanvullende bestanden voor één gegevensset zijn gemaakt, kunnen ze batchgewijs worden gekopieerd en in de resterende gegevenssets worden geplakt.
  5. Gebruik de MATLAB-applicatie Mitometer om afbeeldingen te analyseren.
    NOTITIE: Dit protocol is uitgevoerd op een mitometer, geïnstalleerd op MATLAB R2022a. Laad afbeeldingen in batches van 30 voor een optimale tijd- en uitvoerbalans. De maximale MAT-bestandsgrootte wordt opgelegd door het native bestandssysteem: standaard kunnen "save"-bewerkingen een bestand maken < 231 bytes (~2 GB); MAT-bestanden opslaan Versie 7.3 kan in plaats daarvan worden gebruikt, omdat deze maximale variabele groottes van meer dan 2 GB toestaat.
    1. Identificeer/wijzig de standaard versie van het MAT-bestand: Klik op het tabblad Start in de sectie Omgeving op Voorkeuren en selecteer MATLAB | Algemeen | MAT-bestanden.
    2. Gebruik de MATLAB-tool Mitometer om te analyseren: Open MATLAB en navigeer naar Menubalk | APPS | Mitometer openen | Selecteer 3D starten | Invoergegevens (pixelgrootte (μm): 0,1395089 / Tijd tussen frames (s): 2 / Aantal z-vlakken: 8 / Axiale afstand tussen z-vlakken (μm): 0,418809 | Selecteer de afbeeldingen die u wilt invoeren.
    3. Ga naar het menu aan de zijkant van de mitometer, selecteer Afbeelding, klik op Gemarkeerd selecteren, navigeer naar de menubalk van de mitometer | Tracks selecteren | Weergaven bijhouden | selecteer All-Tracks, Telenuclear of Perinuclear | mitometer Menubalk | Selecteer Analyse | Kies een element (d.w.z. Lengte) | selecteer Opslaan in ".txt".
      OPMERKING: Er kan meer dan één parameter tegelijk worden gedownload, indien gelijktijdig geselecteerd.
    4. Pak resultaatbestanden uit in de aangemaakte mappen (2.2.1).
  6. Routinematige optimalisatie en data-analyse
    1. Voorbereiden/aanpassen van het "Randomization.xlsx"-bestand met de sleutel voor beeldcodering.
      1. Voeg een lijst met opeenvolgende gehele getallen, vanaf 1, in kolom A in.
        OPMERKING: Het is raadzaam om een gedupliceerde map te bewaren met afbeeldingen met een oorspronkelijke naam.
      2. Plaats de analytische variabelen in kolom B, bestaande uit alfanumerieke tekens.
        OPMERKING: Het aantal regels in het document moet consistent zijn met het aantal mappen dat aanwezig is in de hoofdgegevensset. Kopieer en plak dit "Randomization.xlsx"-bestand in de andere twee hoofdgegevenssets.
    2. Geoptimaliseerde data-analyse
      1. Dubbelklik op "executable.mlx", voer het aantal mappen in, specificeer de map mappen (kopieer de map van de bovenkant van de map) | de map opslaan (kopieer de map van de bovenkant van de map) | de naam van de spreadsheet in het uitvoerbestand en klik op Uitvoeren.
      2. Voer indien nodig statistische analyses uit.
        OPMERKING: Optioneel kan het maken van een .xlsx bestand in elke map met de .txt gegevens en een geluidssignaal aan het einde van de analyse worden geselecteerd. Live Script voert één spreadsheetbestand uit in een tabelindeling. In deze uitvoer vertegenwoordigen kolommen geanalyseerde parameters (bijv. "Major Axis Length"; "Intensiteit") en lijnen vertegenwoordigen visuele velden van analytische variabelen (bijv. "Controle").

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de analyse van uitvoerbestanden in .txt formaat te verbeteren en te versnellen, werd een routinematige optimalisatie gecodeerd die gegevens leest die consistent zijn met Mitometer- .txt-uitvoerbestanden, met kolommen die een frame vertegenwoordigen en lijnen die geïdentificeerde mitochondriën vertegenwoordigen. De routinematige optimalisatie produceert gegevens in een enkele waarde per parameter door het gemiddelde te nemen van de frames voor elke geïdentificeerde mitochondriën en vervolgens het gemiddelde te nemen va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Live cell imaging produceert grote bestanden die serieuze computerverwerking vereisen, maar zelfs de meest recente tools vereisen uitgebreide handmatige invoer om te verwerken. Deze routinematige optimalisatie is gericht op het vereenvoudigen van het proces van mitochondriënanalyse op de Mitometer, omdat deze tool een zeer goede balans biedt tussen gebruikersinvoer en gegevensuitvoer. Een uitgebreide vergelijking tussen verschillende tools voor beeldanalyse van mitochondriën is eerder besproken10....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beeldacquisitie werd uitgevoerd in de LiM-faciliteit van iBiMED, een knooppunt van PPBI (Portugees Platform voor BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Dit werk werd ondersteund door FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), een subsidie aan DT van de Fundação para a Ciência e Tecnologia van het Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), een subsidie van ATG-The Gabba Alumni Association aan VP, en het Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AM580Sigma-AldrichA8843
BDNF Thermo-FisherRP8642
BMS493Tocris Bioscience 3409
CD2314Tocris Bioscience3824
Ch55Tocris Bioscience 2020
Foetaal bovien serumThermo-Fisher10270106
GraphPad Prism v4.0GraphPad Software, La Jollan/a
Ham’s F12 voedingsmixThermo-Fisher21765029
MATLAB R2022a MathWorksn/a
Minimaal essentieel mediumThermo-Fisher31095
Nunc glazen bodemschalenThermo-Fisher150680
FosfaatbufferoplossingThermo-Fisher28372
RetinoïnezuurSigma-Aldrich R2625
TMRM Thermo-FisherT668
Zeiss LSM 510Carl Zeissn/aUitgerust met live-cell imaging kweekkamer en 63x olie-immersie objectief 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
  2. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
  3. Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
  4. Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
  5. Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
  6. Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
  7. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
  8. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754(2013).
  9. Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
  10. Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775(2022).
  11. Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
  12. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
  13. Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628(2021).
  14. Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Live cell imagingmitochondriaal netwerkmachine learning algoritmenbeeldsegmentatiehogeresolutiemicroscopiemitochondriaal kwantificeren

Gerelateerde artikelen