Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie

5.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65485

⸱

5 mei 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, York University, 2Department of Genetic Engineering and Biotechnology, Shahjalal University of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de zeer efficiënte productie van transgene sojabonenharige wortels.

Samenvatting

Soja (Glycine max) is een waardevol gewas in de landbouw dat duizenden industriële toepassingen heeft. Sojawortels zijn de primaire plaats van interactie met bodemmicroben die symbiose vormen om stikstof en pathogenen te fixeren, waardoor onderzoek met sojawortelgenetica van het grootste belang is om de landbouwproductie te verbeteren. De genetische transformatie van sojabonen harige wortels (HRs) wordt gemedieerd door de Agrobacterium rhizogenes stam NCPPB2659 (K599) en is een efficiënt hulpmiddel voor het bestuderen van de genfunctie in sojawortels, die slechts 2 maanden van begin tot eind duurt. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat de methode schetst voor het overexpressie en het uitschakelen van een gen dat van belang is in HRs van sojabonen. Deze methodologie omvat sterilisatie van sojazaad, infectie van zaadlobben met K599 en de selectie en oogst van genetisch getransformeerde HRs voor RNA-isolatie en, indien gerechtvaardigd, metabolietanalyses. De doorvoer van de aanpak is voldoende om tegelijkertijd verschillende genen of netwerken te bestuderen en zou de optimale engineeringstrategieën kunnen bepalen voordat ze zich committeren aan stabiele transformatiebenaderingen op lange termijn.

Inleiding

Soja (Glycine max) is een van de meest waardevolle gewassen in de landbouw. Het heeft duizenden commerciële en industriële toepassingen, zoals voedsel, veevoer, olie en als bron van grondstoffen voor de productie1. Het vermogen om een symbiotische relatie te vormen met stikstofbindende bodemmicro-organismen, namelijk wortelstokken, verhoogt het belang van het bestuderen van de genetica van sojabonen verder2. Het verfijnen van stikstoffixatie-eigenschappen in sojawortels kan bijvoorbeeld leiden tot de vermindering van koolstofemissies en de behoefte aan stikstofmeststofaanzienlijk verminderen 3. Het begrijpen van de genetica die aspecten van de biologie van sojabonenwortels controleert, heeft dus brede toepassingen in de landbouw en de industrie. Gezien deze voordelen is het belangrijk om een betrouwbaar protocol te hebben om de functie van sojaboongenen te analyseren.

Agrobacterium tumefaciens is misschien wel het meest gebruikte hulpmiddel voor genetische transformatie van planten, omdat het de mogelijkheid heeft om overdrachts-DNA (T-DNA) te integreren in het nucleaire genoom van veel plantensoorten. Wanneer Agrobacterium een plant infecteert, brengt het het tumor-inducerende (Ti) plasmide over naar het gastheerchromosoom, wat leidt tot de vorming van een tumor op de infectieplaats. De Agrobacterium-gemedieerde transformatie wordt al tientallen jaren op grote schaal gebruikt voor genfunctionele analyse en om gewaskenmerken te wijzigen4. Hoewel elk gen van belang gemakkelijk kan worden overgedragen in waardplantencellen door middel van A. tumefaciens-gemedieerde transformatie, heeft deze methode verschillende nadelen; Het is tijdrovend, duur en vereist uitgebreide expertise voor veel plantensoorten, zoals sojabonen. Hoewel een paar soorten sojabonen kunnen worden getransformeerd door de cotyledonaire knooppuntbenadering met behulp van A. tumefaciens, vereist de inefficiëntie van deze aanpak de behoefte aan een alternatieve genetische transformatietechnologie die snel en zeer efficiënt is 4,5. Zelfs een niet-expert kan deze Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde harige wortel (HR) transformatiemethode gebruiken om deze nadelen te overwinnen.

HR-transformatie is een relatief snel hulpmiddel, niet alleen voor het analyseren van de genfunctie, maar ook voor biotechnologische toepassingen, zoals de productie van gespecialiseerde metabolieten en fijne chemicaliën, en complexe bioactieve glycoproteïnen6. De productie van HRs van sojabonen vereist geen uitgebreide expertise, omdat ze kunnen worden gegenereerd door de oppervlakken van zaadlobben te verwonden, gevolgd door inenting met Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes brengt virulentie (Vir) genen tot expressie die gecodeerd zijn door zijn Ti-plasmide die zijn T-DNA-segment overbrengen, dragen en integreren in het genoom van plantencellen en tegelijkertijd de buitenbaarmoederlijke wortelgroei stimuleren8.

In vergelijking met andere genexpressiesystemen voor sojabonen, zoals biolistica of op A. tumefaciens gebaseerde transformatie van weefsel-, cel- en orgaancultuur, vertoont het HR-expressiesysteem verschillende voordelen. Ten eerste zijn HRs genetisch stabiel en worden ze snel geproduceerd op hormoonvrije media 1,9,10. Bovendien kunnen HRs gespecialiseerde metabolieten produceren in hoeveelheden gelijk aan of groter dan inheemse wortels11,12. Deze voordelen maken HRs een wenselijk biotechnologisch hulpmiddel voor plantensoorten die onverenigbaar zijn met A. tumefaciens of die speciale weefselkweekomstandigheden vereisen om compatibele weefsels te vormen. De HR-methode is een efficiënte benadering voor het analyseren van eiwit-eiwitinteracties, eiwitsubcellulaire lokalisatie, recombinante eiwitproductie, fytoremediatie, mutagenese en genoombrede effecten met behulp van RNA-sequencing13,14,15. Het kan ook worden gebruikt om de productie van gespecialiseerde metabolieten te bestuderen die waarde hebben in de industrie, waaronder glyceollen, die de verdediging van sojabonen tegen de belangrijke microbiële ziekteverwekker Phytophthora sojae mediteren en indrukwekkende antikanker- en neuroprotectieve activiteiten bij mensen hebben16,17.

Dit rapport toont een eenvoudig, efficiënt protocol om HRs voor sojabonen te produceren. In vergelijking met eerdere HR-transformatiemethoden biedt dit protocol een significante (33% -50%) verbetering van de snelheid van HR-vorming door A. rhizogenes-transformanten vooraf te screenen op de aanwezigheid van het Ti-plasmide voorafgaand aan het enten van soja-zaadlobben. We tonen de toepasbaarheid van dit protocol aan door verschillende binaire vectoren te transformeren die de transcriptiefactorgenen van sojabonen overexpressie of het zwijgen opleggen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om alle stappen van de procedure onder steriele omstandigheden uit te voeren.

1. Sojazaadsterilisatie

  1. Plaats in een bioveiligheidskast 16-20 ronde Williams 82 sojabonenzaden in onberispelijke staat (d.w.z. geen scheuren of vlekken) in een centrifugebuis van 50 ml.
  2. Voeg 30 ml 70% isopropylalcohol toe, schud zachtjes gedurende 30 s en decanteer vervolgens de alcohol.
  3. Schud de zaden voorzichtig met 30 ml 10% bleekmiddel gedurende 10 s en laat de zaden 5 minuten in de oplossing zitten bij kamertemperatuur (RT, 25 °C). Giet na 5 minuten het bleekmiddel af.
  4. Herhaal het schudden drie keer met 30 ml steriele ultrazuivere H 2 O gedurende1 minuut per spoeling en gooi de H2O tussen elke spoeling weg.
  5. Plaats de gesteriliseerde zaden op filtreerpapier verzadigd met 5 ml kiem- en co-cultivatie (GC) medium (autoclaaf halfsterkte vloeibare Murashige en Skoog [MS] medium met 1% sucrose [pH = 5,8] en voeg vervolgens 2,5 ml / L vitamines toe) in steriele petrischaaltjes.
  6. Plaats de platen gedurende 3 dagen in het donker bij RT (25 °C) voordat u de platen gedurende 4 dagen bij 22 °C onder 16 h koelwitte T5-fluorescentielampen (100 μE m-2·s-1) overbrengt om de zaden te laten ontkiemen.
    OPMERKING: Gooi zaden weg die gerimpeld of gebarsten zijn. De beste zaden zijn die welke groot en uniform geel zijn. Steriliseer ten minste het dubbele van het aantal zaden dat nodig is voor het experiment om zaden van goede kwaliteit te selecteren, omdat sommige zaden mogelijk niet optimaal zijn vanwege schade, ziekten of het niet ontkiemen.

2. Infectie van zaadlobben met K599

OPMERKING: Gebruik vectoren uit de pGWB-serie, omdat hun dubbele selectie zorgt voor genomische integratie van de gehele T-DNA-cassette. Elektroporatie werd gebruikt om een binaire vector met het gen van belang om te zetten in A. rhizogenes pRi265918.

  1. Ontwerp op basis van de sequentie van het A. rhizogenes pRi2659 plasmide18 primers om het Ti plasmide gen VirD2 (VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3' te detecteren; VirD2 omgekeerd: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; verwachte versterkingsgrootte: 221 bp). Test na transformatie de Agrobacterium-kolonies op het behoud van VirD2 door polymerasekettingreactie (PCR) met behulp van een PCR-kit (zie materiaaltabel). PCR-cyclus: 94 °C gedurende 3 minuten; 35 cycli (94 °C gedurende 1 min, 58 °C gedurende 30 sec, 72 °C gedurende 1 min); en 72 °C gedurende 10 min.
  2. Na de selectie van de A. rhizogenes-kolonie die zowel VirD2 als het gen van belang (GOI) bevat, streept u wat uit op Luria-Bertani (LB) mediumplaten met de juiste antibiotica (50 mg / L) voor het plasmide van belang en incubeert u 's nachts bij 30 °C. Als u spectinomycine gebruikt, voeg dan een concentratie van 100 mg / L toe.
  3. Gebruik een P200-pipetpunt om een lengte van ~ 1,5 cm van de K599 Agrobacterium van de LB-platen af te schrapen en de cellen te resuspenderen in 1 ml fosfaatbuffer (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
  4. Verdun de Agrobacterium in gesteriliseerde, ultrazuivere H2O (v/v = 1:1) en acetosyringon (AS; 100 mM voorraad in dimethylsulfoxide [DMSO], v/v = 1:1000). Meet de absorptie met behulp van een cuvettebuis met een optische dichtheid van 600 nm (OD600). Het verwachte optimale bereik ligt tussen 0,5 en 0,8.
  5. Dompel in een bioveiligheidskast een gesteriliseerd scalpel in de K599 Agrobacterium-oplossing en maak verschillende 1 mm diepe sneden langs het binnenoppervlak (adaxiale, platte kant) van de zaadlob. Gebruik tijdens de inenting een gesteriliseerde tang om de zaadlob te stabiliseren.
  6. Leg ongeveer 6-8 zaadlobben die met de zijkant zijn gesneden op een petrischaaltje met filterpapier verzadigd met GC-medium met AS.
    OPMERKING: Om 6 platen te bereiden, is 50 ml GC-medium en 50 μL 100 mM AS om een eindconcentratie van 100 μM te bereiken voldoende.
  7. Incubeer de platen bij RT (25 °C) gedurende 3 dagen onder een fotoperiode van 16 uur (~65 μE).
  8. Breng de geïnfecteerde zaadlobben over op harige wortelgroeiplaten (HRG) (autoclaaf halfsterkte MS met 3% sucrose [pH = 5,8] en 2,6 g / L Gelzan, voeg vervolgens 2,5 ml / L vitaminemengsel en 500 mg / L timentine toe).
    OPMERKING: Er waren enkele problemen met timentin van sommige alternatieve leveranciers, waarvan de K599 niet werd geëlimineerd. Het wordt aanbevolen om hogere petrischaalplaten (100 mm x 25 mm) te gebruiken voor HRG-medium.
  9. Incubeer de HRG-platen bij 22 °C in een groeikamer met de parameters ingesteld op 100 μE licht op een fotoperiode van 16 uur totdat primaire wortels met secundaire wortels van 2-3 cm lang worden waargenomen (~ 3-4 weken).

3. Selectie en oogsten van HRs

  1. Oogst primaire wortels (5-7 cm lang) die uit het eelt groeien en secundaire wortels bevatten (2-3 cm lang) met behulp van een steriel scalpel en een tang. Breng HRG-platen met de juiste antibiotica over op selectie. Laat de HRs nog 5 dagen groeien op de selectie HRG-platen.
    OPMERKING: Kanamycine (50 mg / L), hygromycine (50 mg / L), of fosfinothricine (10 mg / L) worden meestal gebruikt voor selectie. Voor expressievectoren wordt pGWB2 gebruikt voor overexpressie, pANDA35HK wordt gebruikt voor RNAi-uitschakeling, pGWB6 wordt gebruikt voor subcellulaire lokalisatie en pMDC7 wordt gebruikt voor induceerbare expressie.
  2. Oogst op dag 5 transgene HRs met secundaire wortels van 3-6 cm lang. Bij het waarnemen van fluorescerende eiwitten hebben de secundaire wortels weinig autofluorescentie. Als u elicitor- of chemische behandelingen uitvoert, snijdt u de secundaire wortels in stukken van 1 cm en plaatst u ~ 100 mg op HRG-agar op een stapel. Verzadig vervolgens de palen met 80 μL van de juiste behandeling en laat de platen incuberen bij RT (25 °C).
  3. Ga na de gewenste behandelingstijd verder met RNA- of metabolietextracties.
  4. Voor RNA, dep de wortels snel droog op een gesteriliseerde papieren handdoek en oogst ze rechtstreeks in een microcentrifugebuis van 2 ml.
  5. Sluit onmiddellijk de bovenkant van de buis af met parafilm, maak twee kleine gaatjes met een puntige tang en dompel de buizen onder in vloeibare stikstof. Lyofileer gedurende 3 dagen en bewaar de monsters vervolgens bij -80 °C.
    OPMERKING: Het is essentieel om HRs te selecteren die wit zijn. Na 5 dagen groei op de selectieve plaat blijven transgene HRs wit, maar niet-transgene wortels worden bruin.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De representatieve resultaten zijn afkomstig van de gepubliceerde gegevens19,20. De kolonie PCR (cPCR) resultaten van de getransformeerde K599 Agrobacterium zijn weergegeven in figuur 1. Zoals aangegeven door de positieve kolonies in figuur 1, werd het gen van belang gedetecteerd door cPCR (figuur 1A). Een derde tot de helft van de kolonies was echter negatief voor ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In het afgelopen decennium is de HR-methode van sojabonen ontwikkeld als een krachtig hulpmiddel om genen te bestuderen die betrokken zijn bij stikstoffixatie 22,23, biotische en abiotische stresstolerantie 24,25 en metaboliet biosynthetische routes 26,27. De kennis van hoe planten metabolieten produceren, heeft een overvloed aan voordelen voor de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) subsidienummer RGPIN-2020-06111 en door een genereuze donatie van Brad Lace. We willen Wayne Parrott (University of Georgia) bedanken voor de K599 Agrobacterium en het voorlopige protocol, en het Nakagawa & Hachiya lab (Shimane University) voor de lege vectoren pGWB2, pGWB6 en pANDA35HK.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetosyringoneCayman23224
Bleachlavo21124
DMSOFisher bioreagents195679
GelzanPhytotechHYY3251089A
HygromycinPhytotechHHA0397050B
Isopropyl alcoholFisher chemical206462
KanamycinPhytotechSQS0378007G
LB powderFisher bioreagents200318
MS powderCaisson labs2210001
Na2HPO4Fisher bioreagents194171
NaClFisher chemical192946
Petri dishesFisherbrand08-757-11100 mm x 25 mm
PhosphinothricinCedarlaneP034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR KitSigmaR4775
SucroseBioshop2D76475
TimentinCaisson labs12222002
VitaminsCaisson labs2211010

Referenties

  1. Li, S., et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean. Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).
  2. Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner. Scientific Reports. 10, 1619(2020).
  3. Huang, X. -F., et al. Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities. Botany. 92 (4), 267-275 (2014).
  4. Ma, H., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus. Frontiers in Plant Science. 13, 1039094(2022).
  5. Hwang, H. -H., Yu, M., Lai, E. -M. Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications. The Arabidopsis Book. 15, e0186(2017).
  6. Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).
  7. Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
  8. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
  9. Chen, L., et al. Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).
  10. Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method. Current Protocols. 1 (7), e195(2021).
  11. Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures. Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).
  12. Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I. Molecules. 22 (8), 1261(2017).
  13. Cheng, Y., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean. Plant Methods. 17 (1), 73(2021).
  14. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).
  15. Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation. Frontiers in Plant Science. 10, 1427(2019).
  16. Ahmed, S., Kovinich, N. Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health. Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).
  17. Walker, R. R., et al. Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887(2022).
  18. Tong, X., et al. The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots. International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).
  19. Lin, J., et al. RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1. Plants. 12 (3), 545(2023).
  20. Jahan, M. A., et al. Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).
  21. Jahan, M. A., et al. The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean. BMC Genomics. 20, 149(2019).
  22. Nguyen, C. X., et al. Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development. The Plant Genome. , e20171(2021).
  23. Brear, E. M., et al. GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation. New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).
  24. Chen, Z., et al. Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants. Agronomy. 11 (1), 170(2021).
  25. Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode. Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).
  26. Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).
  27. Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.). Molecules. 27 (18), 6118(2022).
  28. Lozovaya, V. V., et al. Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani. Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).
  29. Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Sojaboon haarwortelsgenfunctieanalyseAgrobacterium rhizogenesTi plasmidscreeningRNA interferentieCRISPR Cas9 editingtranscriptiefactorgenenfluorescentiemicroscopieRNA extractie
Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.