Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de alvleesklier van muizen

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65498

⸱

6 oktober 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol voor de chirurgische implantatie van een gestabiliseerd inwonend optisch venster voor subcellulaire beeldvorming van de alvleesklier van muizen, waardoor seriële en longitudinale studies van de gezonde en zieke alvleesklier mogelijk zijn.

Samenvatting

De fysiologie en pathofysiologie van de alvleesklier zijn complex. Ziekten van de alvleesklier, zoals pancreatitis en adenocarcinoom van de alvleesklier (PDAC) hebben een hoge morbiditeit en mortaliteit. Intravitale beeldvorming (IVI) is een krachtige techniek die het mogelijk maakt om weefsels in zowel gezonde als zieke toestand met hoge resolutie in beeld te brengen, waardoor de celdynamiek in realtime kan worden waargenomen. IVI van de alvleesklier van muizen vormt een aanzienlijke uitdaging vanwege de diepe viscerale en meegaande aard van het orgaan, waardoor het zeer vatbaar is voor beschadiging en bewegingsartefacten.

Hier wordt het proces beschreven van implantatie van de S-getabiliseerde Window voor Intravitale beeldvorming van de muizen Pancreas (SWIP). Het SWIP maakt IVI van de alvleesklier van muizen mogelijk in normale gezonde toestanden, tijdens de transformatie van de gezonde alvleesklier naar acute pancreatitis geïnduceerd door ceruleïne, en in kwaadaardige toestanden zoals pancreastumoren. In combinatie met genetisch gelabelde cellen of de toediening van fluorescerende kleurstoffen, maakt de SWIP het mogelijk om de dynamiek van eencellige en subcellulaire (inclusief eencellige en collectieve migratie) te meten, evenals seriële beeldvorming van hetzelfde interessegebied gedurende meerdere dagen.

Het vermogen om tumorcelmigratie vast te leggen is van bijzonder belang, aangezien de primaire oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij PDAC de overweldigende metastatische belasting is. Het begrijpen van de fysiologische dynamiek van metastase bij PDAC is een kritieke onvervulde behoefte en cruciaal voor het verbeteren van de prognose van de patiënt. Over het algemeen biedt de SWIP verbeterde beeldvormingsstabiliteit en breidt het de toepassing van IVI uit bij de gezonde alvleesklier en kwaadaardige alvleesklierziekten.

Inleiding

Goedaardige en kwaadaardige pancreasaandoeningen zijn potentieel levensbedreigend, met aanzienlijke hiaten in het begrip van hun pathofysiologie. Pancreatitis - ontsteking van de alvleesklier - is de derde belangrijke oorzaak van gastro-intestinale ziektegerelateerde ziekenhuisopnames en heropnames in de VS en wordt in verband gebracht met aanzienlijke morbiditeit, mortaliteit en sociaaleconomische lasten. Gerangschikt als de derde belangrijkste doodsoorzaak door kanker 2, is ductaal adenocarcinoom (PDAC) van de pancreas verantwoordelijk voor de meeste maligniteiten van de alvleesklier3 en voorspelt het een slechte 5-jaarsoverleving van slechts 11%2. De belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij PDAC is een overweldigende metastatische belasting. Helaas vertonen de meeste patiënten gemetastaseerde ziekte. Daarom is het begrijpen van de dynamiek van metastase in PDAC een kritieke onvervulde behoefte op het gebied van kankeronderzoek.

De mechanismen die ten grondslag liggen aan ontstekingen en de metastatische cascade van de alvleesklier zijn slecht begrepen. Een belangrijke oorzaak van deze lacune in kennis is het onvermogen om de cellulaire dynamiek van de alvleesklier in vivo te observeren. Directe observatie van deze cellulaire dynamiek belooft kritieke doelen te onthullen om de diagnose en behandeling van mensen met pancreasaandoeningen te benutten en te verbeteren.

Intravitale beeldvorming (IVI) is een microscopietechniek waarmee onderzoekers biologische processen in levende dieren in realtime kunnen visualiseren en bestuderen. IVI maakt directe visualisatie met hoge resolutie mogelijk van intracellulaire en micro-omgevingsdynamiek in vivo en binnen de oorspronkelijke omgeving van het biologische proces in kwestie. Daarom maakt IVI in vivo observatie van gezonde en pathologische processen mogelijk.

Hedendaagse beeldvormingsmodaliteiten voor het hele lichaam, zoals MRI, PET en CT, bieden een uitstekend beeld van hele organen en kunnen pathologieën onthullen, zelfs vóór het begin van klinische symptomen. Ze zijn echter niet in staat om eencellige resolutie te bereiken of de vroegste stadia van ziekte - pancreatitis of maligniteit - te onthullen.

Eerder onderzoek heeft eencellige resolutie IVI gebruikt om goedaardige en kwaadaardige ziekten van huid5,6, borst7, long8, lever9, hersenen 10 en pancreastumoren 11 te observeren, wat leidde tot inzichten in mechanismen van ziekteprogressie 12. De alvleesklier van muizen vormt echter aanzienlijke obstakels voor het bereiken van eencellige resolutie met behulp van IVI, voornamelijk vanwege de diepe viscerale locatie en hoge compliantie. Bovendien is het een vertakt, diffuus verdeeld orgaan in het mesenterium dat verbinding maakt met de milt, dunne darm en maag, waardoor het moeilijk toegankelijk is. Het weefsel is ook zeer gevoelig voor beweging veroorzaakt door aangrenzende peristaltiek en ademhaling. Het minimaliseren van de beweging van de alvleesklier is essentieel voor microscopie met eencellige resolutie, omdat bewegingsartefacten van zelfs een paar micron beelden kunnen vervagen en vervormen, waardoorhet onmogelijk wordt om de dynamiek van individuele cellen te volgen.

Om IVI uit te voeren, moet een abdominaal beeldvormingsvenster (AIW) chirurgisch worden geïmplanteerd 9,11. Om de AIW operatief te implanteren, wordt een metalen raamkozijn in de buikwand gehecht. Daarna wordt het orgaan van belang met cyanoacrylaatlijm aan het frame bevestigd. Hoewel dit voldoende is voor sommige stijve inwendige organen (bijv. lever, milt, stijve tumoren), worden pogingen om de gezonde alvleesklier van muizen in beeld te brengen gecompromitteerd door suboptimale laterale en axiale stabiliteit als gevolg van de conforme textuur en complexe architectuur van het weefsel14. Om deze beperking aan te pakken, ontwikkelden Park et al.14 een beeldvormingsvenster dat speciaal is ontworpen voor de gezonde alvleesklier. Dit Pancreas Imaging Window (PIW) minimaliseert de invloed van darmbeweging en ademhaling door een horizontale metalen plank in het raamkozijn op te nemen, net onder het dekglaasje, waardoor het weefsel wordt gestabiliseerd en het contact met het dekglas behouden blijft. Hoewel de PIW een verhoogde laterale stabiliteit biedt, ontdekten we dat dit venster nog steeds axiale drift vertoont en bovendien de beeldvorming van grote solide tumoren verhindert vanwege de smalle opening tussen de metalen plank en het dekglaasje15.

Om deze beperkingen aan te pakken, ontwikkelden we de Sgetabiliseerde Window for Intravital beeldvorming van de muizen Pancreas (SWIP), een implanteerbaar beeldvormingsvenster dat in staat is om stabiele langetermijnbeeldvorming van zowel de gezonde als de zieke alvleesklier te bereiken (Figuur 1)15. Hier bieden we een uitgebreid protocol voor de chirurgische ingreep die wordt gebruikt om de SWIP te implanteren. Hoewel het primaire doel was om de dynamische mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij metastase, kan deze methode ook worden gebruikt om verschillende aspecten van de biologie en pathologie van de alvleesklier te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, inclusief voorafgaande goedkeuring door het Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Passiveren van ramen

OPMERKING: Passiveren van roestvrij staal reinigt het metaal van verontreinigingen en creëert een dunne oxidelaag die de biocompatibiliteit van het metaal met zachte weefsels aanzienlijk verhoogt, zelfs buiten die van titanium16.

  1. Start het passiveringsproces door de optische raamkozijnen te wassen met een enzymatisch actieve reinigingsmiddeloplossing van 1% (g/v).
  2. Dompel de frames gedurende 30 minuten onder in een natriumhydroxideoplossing van 5% (m/v) bij 70 °C in een glazen pot.
  3. Haal de frames eruit en spoel ze af met gedeïoniseerd water.
  4. Dompel de frames gedurende 10 minuten onder in een citroenzuuroplossing van 7% (g/v) bij 55 °C in een nieuwe glazen pot.
  5. Verwijder de frames en spoel ze opnieuw af met gedeïoniseerd water.
  6. Herhaal stap 1.2 en spoel tot slot de kozijnen nog een laatste keer af met gedeïoniseerd water.

2. Voorbereiding op tumorimplantatie of raamchirurgie

OPMERKING: Voor onderzoeken naar pancreastumoren moeten tumorcellen worden geïmplanteerd en mogen uitgroeien tot openlijke tumoren. Om de tumorcellen in vivo te visualiseren, wordt aanbevolen om cellen te gebruiken die genetisch zijn veranderd om fluorescerende eiwitten zoals Dendra2 tot expressie te brengen. Het gebruik van fluorescerende eiwitlabels die helder zijn, vermindert mogelijke problemen met autofluorescentie van weefsels. Andere potentiële fluorescerende eiwitten, kleurstoffen en genetisch gecodeerde fluorescerende muismodellen die kunnen worden gebruikt, zijn elders besproken17,18. Om besmetting van het operatieveld te voorkomen, voert u de chirurgische ingreep uit in een kap of laminaire stroomkast en zorgt u ervoor dat verschillende gebieden worden gebruikt voor voorbereiding, chirurgie en herstel.

  1. Steriliseer voorafgaand aan de operatie alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf en gebruik indien nodig een sterilisator met hete kralen voor volgende procedures. Zorg ervoor dat de operatie een techniek met alleen tips gebruikt.
  2. Schakel het verwarmde operatiekussen en de hielsterilisator in en wacht tot deze de juiste bedrijfstemperatuur hebben bereikt. De temperatuur van het verwarmingskussen moet worden gecontroleerd met een oppervlaktethermometer om mogelijke brandwonden te voorkomen. Leg een steriele doek over het verwarmingskussen als de temperatuur niet voldoende kan worden geregeld.
    OPMERKING: De lichaamstemperatuur tijdens korte procedures (≤20 min), zoals tumor- en raamimplantatie, wordt minimaal beïnvloed bij gebruik van een verwarmd chirurgisch kussen. Voor langere perioden van anesthesie, zoals tijdens uitgebreide timelapse-beeldvorming, moet de muis echter in een verwarmde kamer worden geplaatst om de lichaamstemperatuur op peil te houden.
  3. Verdoof de muis met 5% isofluraan in een anesthesiekamer.
  4. Kritieke stap: Verlaag de anesthesie tot 2% zodra de muis bewusteloos is. Houd het anesthesieniveau en de vitale functies van de muis zorgvuldig in de gaten (bijv. met behulp van een pulsoximeter)19.
  5. Breng een kleine druppel oogglijmiddel aan op elk oog van de muis om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  6. Breng voorafgaand aan de operatie royaal ontharingscrème aan op de linker bovenbuik om haar te verwijderen. Gebruik na 20 seconden vochtig tissuepapier om het haar stevig weg te vegen en ontharingscrème. Herhaal het proces indien nodig totdat al het haar uit het operatiegebied is verwijderd.
  7. Injecteer subcutaan 10 μl buprenorfine (0,1 mg/kg) verdund in 90 μl PBS om preoperatieve analgesie te garanderen.

3. Implantatie van pancreastumoren

  1. Bereid aliquots van tumorcellen voor in de gewenste concentratie (op basis van de verdubbelingstijd van de tumorcellen). Plaats de celsuspensie in een insulinespuit en bewaar deze op ijs. Om dit protocol te volgen, gebruikt u 106 syngene KPC-tumorcellen 20 gesuspendeerd in maximaal 50 μL PBS, volgens het orthotope injectieprotocol aangepast van Erstad etal.21
    OPMERKING: Deze cellijn die in deze concentratie werd geïnjecteerd, produceerde routinematig voelbare of voldoende grote tumoren na 10-14 dagen. Subklonen van deze cellijn en andere pancreascellijnen zouden moeten worden geëvalueerd op geschikte concentraties en tijdlijnen om tumoren van de juiste grootte te produceren).
  2. Was de handen met antiseptische zeep.
  3. Trek voor elke nieuwe operatie nieuwe steriele handschoenen aan.
  4. Breng de muis over naar de steriele operatiekap en plaats deze in een gedeeltelijke rechter laterale decubituspositie.
  5. Zet de ledematen vast met plakband.
    NOTITIE: Correct gebruik van de instrumenten is belangrijk tijdens de hele procedure. Voorbeelden van het vasthouden van een pincet, een Castroviejo-schaar en het vacuümopnamegereedschap worden weergegeven in afbeelding 2A-C.
  6. Steriliseer de buik met een antisepticum (Figuur 2D).
  7. Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd is door een teenknijptest uit te voeren.
  8. Maak een incisie van 10-15 mm in de linker subcostale huid met behulp van een pincet en een Castroviejo-schaar (Figuur 2E).
  9. Controleer hemostase met wattenstaafjes of een cauterisatiepen wanneer/waar dit nodig wordt geacht.
  10. Verdeel de onderliggende spier voorzichtig met een tang en een Castroviejo-schaar om het buikvlies binnen te gaan (Figuur 2F).
  11. Gebruik steriele wattenstaafjes om de alvleesklier en milt atraumatisch naar buiten te brengen.
  12. Spreid de alvleesklier uit zodat er geen plooien zijn (Figuur 2G).
  13. Identificeer de gewenste tumorinjectieplaats in het lichaam of de staart van de alvleesklier (weg van bloedvaten).
  14. Kritieke stap: Gebruik na zorgvuldige positionering van de alvleesklier een pincet om het weefsel onder spanning te zetten en steek de punt van de insulinespuit, met de schuine kant naar boven gericht, op de gewenste plaats van de alvleesklier tot een diepte van 4-5 mm (Figuur 2H).
  15. Injecteer langzaam de tumorceloplossing. Zoek naar een kleine luchtbel die een succesvolle injectie bevestigt (Figuur 2I).
  16. Breng de alvleesklier voorzichtig terug naar de buik zonder de injectiebel van de tumorcel te verstoren (Figuur 2J).
  17. Gebruik resorbeerbare 5-0 polydioxanonhechtingen om eerst de spierlaag te sluiten en vervolgens de huid met onderbroken hechtingen (Figuur 2K-N).
  18. Bedek de incisie met cyanoacrylaatlijm (Figuur 2O) en plaats de muis vervolgens terug in een schone kooi onder een verwarmingslamp voor herstel. Dien antibiotica toe in drinkwater om infectie te voorkomen. Houd de muizen in de gaten en laat ze volledig herstellen van de operatie.
    OPMERKING: Antibiotica worden toegediend zoals vereist door het IACUC-protocol. Alle dieren worden individueel gehuisvest.
  19. Laat de tumor zich 10-14 dagen ontwikkelen totdat deze voelbaar is door de buikwand.

4. Raamoperatie van de alvleesklier

  1. Wanneer de dieren klaar zijn voor beeldvorming, begint u met de raamimplantatie-operatie. Was om te beginnen de handen met antiseptische zeep.
  2. Trek voor elke nieuwe operatie verse steriele handschoenen aan.
  3. Plaats de muis op de verwarmde chirurgische standaard in de rechter laterale decubituspositie om de linkerbuik bloot te leggen.
  4. Veranker de voor- en achterpoten van de muis craniaal en caudaal aan de verwarmde chirurgische fase met behulp van papieren tape. Zorg ervoor dat de milt (onder de huid) zichtbaar is in het operatieveld (Figuur 3A).
  5. Om de steriliteit te behouden, pakt u alle chirurgische instrumenten in de kap uit.
  6. Desinfecteer de operatieplaats door de huid van de muis af te vegen met een royale toepassing van een antisepticum.
  7. Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd is door een teenknijptest uit te voeren.
  8. Kritieke stap: Til de huid van het linker bovenkwadrant van de buik op met een pincet en maak een cirkelvormige incisie van ~10 mm in de huid en het spierstelsel met behulp van een Castroviejo-schaar (Figuur 3B,C).
  9. Houd het bloeden onder controle en handhaaf de hemostase met wattenstaafjes of de cauterisatiepen, waar nodig.
  10. Lokaliseer de alvleesklier, die aan de milt is bevestigd, en identificeer de richting waarin de alvleesklier in de incisie ligt om te beslissen waar de ondersteunende kruissteek moet worden geplaatst.
  11. Plaats met behulp van 5-0 zijden hechting de eerste steek op de gewenste plaats in de spierlaag. Knoop dit uiteinde vast met 3-5 knopen. (Figuur 3D,E)
  12. Blijf direct over de incisie hechten. Knip en laat een staart van ~5 cm over (Figuur 3F).
  13. Herhaal stap 4.11 en 4.12 loodrecht op de eerste steek (Figuur 3G,H).
  14. Kritieke stap: Til de alvleesklier voorzichtig op en plaats deze over de kruissteek (Figuur 3I,J). Zorg ervoor dat u de alvleesklier niet beschadigt tijdens de manipulatie.
  15. Cruciale stap: Gebruik de 5-0 zijden hechtdraad om een tas-touwtje ~1 mm van het gat uit te voeren, omtrek, waarbij de huid- en spierlaag in elkaar worden gevlochten (Figuur 3K).
  16. Plaats het raamkozijn zo dat de randen van de cirkelvormige incisie binnen de groef van het raam zitten (Figuur 3L).
  17. Maak het geïmplanteerde venster vast door de 5-0 zijde stevig vast te binden.
  18. Laad 100 μL vloeibare cyanoacrylaatlijm in de spuit van 1 ml.
  19. Droog het weefsel door een delicate stroom perslucht aan te brengen gedurende ~10 s.
  20. Klem het raamkozijn met een pincet aan de buitenrand vast en til het voorzichtig op om ervoor te zorgen dat de alvleesklier van de onderkant van het raamkozijn wordt gescheiden.
  21. Kritieke stap: Breng een dunne laag vloeibare cyanoacrylaatlijm aan langs de uitsparing van het raam (Figuur 3M). Zorg ervoor dat er geen lijm op het alvleesklierweefsel komt.
  22. Til met behulp van vacuümpickups het dekglaasje van 5 mm op.
  23. Plaats het dekglaasje voorzichtig in de uitsparing in het midden van het optische raamkozijn. Houd met lichte druk vast, zodat de cyanoacrylaatlijm kan uitharden (~25 s).
  24. Scheid het dekglaasje van de vacuümpickups met een pincet.
  25. Draai de kruissteekhechtingen vast om de alvleesklier goed vast te zetten aan het dekglaasje (Figuur 3N,O). Opmerking: Draai de kruissteek niet te strak aan, omdat dit schade en ischemie aan de alvleesklier kan veroorzaken.
  26. Knip de uiteinden van de hechting af.
  27. Verwijder de tape van de muis.
  28. Schakel de isofluraanverdamper uit.
  29. Verplaats de muis naar een schone kooi of rechtstreeks naar de intravitale microscoop.
  30. Huisvest de dieren individueel na een raamoperatie en volg ze op tot ze volledig hersteld zijn.
  31. Beeldvorming wordt vervolgens uitgevoerd op een multifotonenmicroscoop met twee lasers, zoals we eerder hebben beschreven 22,23,24 Voor lange beeldvormingssessies wordt de muis in een verwarmde kamer geplaatst om de lichaamstemperatuur op peil te houden en voorzien van ondersteunende vloeistoffen volgens de IACUC-normen.

5. Ceruleine-behandeling voor de inductie van pancreatitis

  1. Om het begin van pancreatitis te onderzoeken, behandelt u gezonde muizen met ceruleïne na implantatie van de SWIP. Zorg ervoor dat de muizen 14-18 uur nuchter zijn en ad libitum water krijgen voordat ze ceruleïne toedienen.
  2. Injecteer 50 μg/kg ceruleïne in 100 μL steriele 1x DPBS intraperitoneaal met tussenpozen van 1 uur voor maximaal acht injecties. Dien een equivalent volume van 1x DPBS alleen, intraperitoneaal geïnjecteerd, toe aan de controlemuizen.
  3. Offer de muizen na beeldvorming 24 uur na de eerste injectie op door cervicale dislocatie volgens de IACUC-normen.
  4. Voer beeldvorming uit op een multifotonenmicroscoop met twee lasers zoals eerder beschreven22,23,24. Plaats de muis voor lange beeldvormingssessies in een verwarmde kamer om de lichaamstemperatuur op peil te houden en hem te voorzien van ondersteunende vloeistoffen volgens de IACUC-normen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1, een bewerking van Du et al.15, toont beeldstills uit een time-lapse IVI-film van de alvleesklier van muizen. Enige weefselbeweging kan worden waargenomen binnen de initiële bezinkingsperiode (eerste uur van beeldvorming, figuur 1A). Bij voortgezette beeldvorming na deze bezinkingsperiode (>75 min) zagen we echter een toename van de laterale en axiale stabiliteit (Figuur 1B). Uit de vergelijking van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven SWIP-protocol biedt een verbeterde methode voor stabilisatie van het alvleesklierweefsel door gebruik te maken van een kruissteekmandtechniek. Vroege abdominale beeldvormingsvensters (AIW's) maakten intravitale beeldvorming (IVI) van inwendige organen van de buik mogelijk, maar beperkten de beweging van zachte weefsels zoals de alvleesklier niet voldoende. Als reactie hierop ontwikkelden Park et al. een pancreas imaging window (PIW) dat een horizontale metalen plank bevat en een betere stabilisatie va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

De Evelyn Lipper Charitable Foundation, het Gruss-Lipper Biophotonics Center, het Integrated Imaging Program for Cancer Research, een NIH T-32 Fellowship (CA200561) en een subsidie van het Department of Defense Pancreatic Cancer Research Program (PCARP) PA210223P1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1% (w/v) oplossing van enzym-actief detergentAlconox IncNAGeconcentreerd, anionisch detergent met protease-enzymen voor handmatige en ultrasone reiniging
5% (w/v) oplossing van natriumhydroxideSigma-AldrichS8045Passivatiereagens
5 mm dekglasElectron Microscopy Sciences72296-05Ronde glazen dekglazen 
7% (w/v) oplossing van citroenzuurSigma-Aldrich 251275Passivatiereagens
28G 1 mL BD Insuline SyringeBD329410Spuit voor celinjectie
Baytril 100 (enrofloxacine)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxAntibioticum
Bench Mount Heat LampMcMaster-Carr3349K51Warmtelamp
Buprenorfine 0,3 mg/mLCovetrus North America059122Buprenorfine Analgesie
Castroviejo gebogen schaarWorld Precision InstrumentsWP2220Schaar voor het snijden van weefsel
C57BL/6J MuisJackson Laboratory000664 C57BL/6J Muis
Chlorhexidine oplossingDurvet7-45801-10258-3Chlorhexidine Desinfectieoplossing
Gecomprimeerde luchttankFalconDPSJB-12Gecomprimeerde lucht voor het drogen van weefsel
Cyano acrylaat - Gel SuperlijmStaples234790-6Huidlijm
Cyano acrylaat - Vloeibare SuperlijmStaplesLOC1647358Dekglazenlijm
DPBS 1xCorning21-031-CVDPBS voor ceruleine/celinjecties
Gemini Cauterization KitHarvard Apparatus726067Cauterisatiepen
Germinator 500CellPoint ScientificGER 5287-120VParelsterilisator
Graefe Micro Dissectietang; Gekarteld; Lichte Curve; 0,8 mm Tip Breedte; 4" LengteRoboz SurgicalRS-5135 Graefe Micro Dissectietang
BeeldvormingsmicroscoopNANAZie Entenberg et al. 2011 [27]
BeeldvormingssoftwareNANAZie Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isofluraan)Henry Schein Animal Health50033Isofluraan Anesthesie
Kim WipesFisher Scientific06-666-A Kim Wipes
LaboratoriumtapeFisher Scientific159015RLaboratoriumtape
Muis DissectiekitWorld Precision InstrumentsMOUSEKITChirurgische Instrumenten
Muispoot Pulse Oximeter SensorKent Scientific CorpoMSTAT Sensor-MSEPulse Oximeter
Muis SurgisuiteKent ScientificSURGI-M04Verwarmd platform
Nair HaarverwijderingslotionAmazonB001RVMR7KOntharingslotion
ZuurstofTechAirOX TMZuurstof
PERMA-HAND Zwarte gevlochten zijden hechtdraad, ETHICON Maat 5-0VWR95056-872Zijdehechting
Fosfaat Buffered Saline 1xLife Technologies10010-023PBS
PhysioSuite SysteemKent ScientificPhysioSuiteVerwarmd Platform Controller
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Oogsmeer
Puritan Niet-Steriele Katoenen Swabs Fisher Scientific867WCNOGLUEKatoenen Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, Voor P-100, 100 µLDenville Scientific Inc.P1125100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–DextranSigma-AldrichT1287-500MGVasculair Label
Venster-bevestigingsplaatNANAOp maat gemaakte plaat voor vensterplaatsing op microscooptafel. Plaat is gemaakt van 0,008 inch roestvrijstalen schuif. Voor afmetingen van de plaat zie Entenberg et al., 2018 [8].
VensterframeNANAHet venster bestaat uit een stalen frame met een centrale opening die een 5 mm dekglaasje accepteert. Een groef van 1,75 mm rond de omtrek van het frame biedt ruimte voor de peritoneale spier en huidlagen om aan te hechten. Zie Entenberg et al., 2018 [8].

Referenties

  1. Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
  3. Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338(2017).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
  5. Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
  6. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  7. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  9. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).
  10. Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
  11. Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773(2016).
  12. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  13. Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  14. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  15. Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273(2022).
  16. DeBold, T. A. M., James, W. How To Passivate Stainless Steel Parts. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563(2011).
  20. Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
  21. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793(2018).
  22. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  23. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
  24. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  25. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603(2016).
  26. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115(2018).
  27. Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
  28. Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
  29. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
  30. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  31. Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Stabilisatie van de pancreaspancreasadenocarcinoompancreatitismodelmigratie van tumorcellensingle-cell imagingwindow-implantatiesubcellulaire dynamiekseriële beeldvorming
Gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de alvleesklier van muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.