Methodenartikel

Methoden voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogels op macroschaal

DOI:

10.3791/65500

⸱

23 juni 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we twee protocollen voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogelmatrices op macroschaal zonder dat er een externe vloeibare fase nodig is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synthetische gennetwerken bieden een platform voor wetenschappers en ingenieurs om nieuwe systemen te ontwerpen en te bouwen met functionaliteit gecodeerd op genetisch niveau. Hoewel het dominante paradigma voor de inzet van gennetwerken zich binnen een cellulair chassis bevindt, kunnen synthetische gennetwerken ook worden ingezet in celvrije omgevingen. Veelbelovende toepassingen van celvrije gennetwerken omvatten biosensoren, omdat deze apparaten zijn aangetoond tegen biotische (Ebola, Zika en SARS-CoV-2-virussen) en abiotische (zware metalen, sulfiden, pesticiden en andere organische verontreinigingen) doelen. Celvrije systemen worden meestal in vloeibare vorm ingezet in een reactievat. Het kunnen inbedden van dergelijke reacties in een fysieke matrix kan echter hun bredere toepassing in een bredere reeks omgevingen vergemakkelijken. Hiertoe zijn methoden ontwikkeld voor het inbedden van celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in een verscheidenheid aan hydrogelmatrices. Een van de belangrijkste eigenschappen van hydrogels die bevorderlijk zijn voor dit werk is de hoogwaterreconstitutiecapaciteit van hydrogelmaterialen. Bovendien bezitten hydrogels fysische en chemische eigenschappen die functioneel gunstig zijn. Hydrogels kunnen worden gevriesdroogd voor opslag en gerehydrateerd voor later gebruik. Twee stapsgewijze protocollen voor de inclusie en bepaling van CFPS-reacties in hydrogels worden gepresenteerd. Ten eerste kan een CFPS-systeem via rehydratie met een cellysaat in een hydrogel worden opgenomen. Het systeem in de hydrogel kan vervolgens worden geïnduceerd of constitutief worden uitgedrukt voor volledige eiwitexpressie via de hydrogel. Ten tweede kan cellysaat worden geïntroduceerd in een hydrogel op het punt van polymerisatie en kan het hele systeem worden gevriesdroogd en op een later punt worden gerehydrateerd met een waterige oplossing die de inductor bevat voor het expressiesysteem gecodeerd in de hydrogel. Deze methoden hebben het potentieel om celvrije gennetwerken mogelijk te maken die sensorische mogelijkheden verlenen aan hydrogelmaterialen, met het potentieel voor inzet buiten het laboratorium.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synthetische biologie integreert verschillende technische disciplines om biologisch gebaseerde onderdelen, apparaten en systemen te ontwerpen en te engineeren die functies kunnen uitvoeren die niet in de natuur voorkomen. De meeste synthetische biologische benaderingen zijn nog steeds gebonden aan levende cellen. Celvrije synthetische biologiesystemen daarentegen vergemakkelijken ongekende niveaus van controle en vrijheid in ontwerp, waardoor meer flexibiliteit en een kortere tijd voor het ontwerpen van biologische systemen mogelijk zijn, terwijl veel van de beperkingen van traditionele op cellen gebaseerde genexpressiemethoden worden geëlimineerd 1,2,3. CFPS wordt gebruikt in een toenemend aantal toepassingen in tal van disciplines, waaronder het bouwen van kunstmatige cellen, het prototypen van genetische circuits, het ontwikkelen van biosensoren en het produceren van metabolieten 4,5,6. CFPS is ook bijzonder nuttig geweest voor het produceren van recombinante eiwitten die niet gemakkelijk tot expressie kunnen worden gebracht in levende cellen, zoals aggregatiegevoelige eiwitten, transmembraaneiwitten en toxische eiwitten 6,7,8.

CFPS wordt meestal uitgevoerd in vloeibare reacties. Dit kan echter in sommige situaties de inzet ervan beperken, omdat elk vloeistofcelvrij apparaat zich in een reactievat moet bevinden. De reden voor de ontwikkeling van de hier gepresenteerde methoden was om robuuste protocollen te bieden voor het inbedden van celvrije synthetische biologie-apparaten in hydrogels, niet als een eiwitproductieplatform op zich, maar in plaats daarvan om het gebruik van hydrogels mogelijk te maken als een fysiek chassis voor de inzet van celvrije apparaten buiten het laboratorium. Het gebruik van hydrogels als CFPS-chassis heeft verschillende voordelen. Hydrogels zijn polymere materialen die, ondanks een hoog watergehalte (soms meer dan 98%), vaste eigenschappen bezitten 9,10,11. Ze hebben toepassingen als pasta's, smeermiddelen en lijmen en zijn aanwezig in producten zo divers als contactlenzen, wondverbanden, mariene kleefbanden, bodemverbeteraars en babyluiers 9,11,12,13,14. Hydrogels worden ook actief onderzocht als drug delivery vehicles 9,15,16,17. Hydrogels kunnen ook biocompatibel zijn, biologisch afbreekbaar en beschikken over een aantal stimulireacties van huneigen 9,18,19,20. Daarom is het doel hier om een synergie te creëren tussen van moleculaire biologie afgeleide functionaliteit en materiaalkunde. Hiertoe zijn inspanningen geleverd om celvrije synthetische biologie te integreren met een reeks materialen, waaronder collageen, laponiet, polyacrylamide, fibrine, PEG-peptide en agarose 11,21,22, evenals om oppervlakken van glas, papier en doek te coaten 11,23,24 met CFPS-apparaten. De hier gepresenteerde protocollen demonstreren twee methoden voor het inbedden van CFPS-reacties in hydrogelmatrices op macroschaal (d.w.z. >1 mm), met agarose als voorbeeldmateriaal. Agarose werd gekozen vanwege zijn hoge waterabsorptiecapaciteit, gecontroleerde zelf-gelenerende eigenschappen en instelbare mechanische eigenschappen 11,24,25,26. Agarose ondersteunt ook functionele CFPS, is goedkoper dan veel andere hydrogel-alternatieven en is biologisch afbreekbaar, waardoor het een aantrekkelijke keuze is als experimenteel modelsysteem. Deze methoden zijn echter eerder aangetoond als geschikt voor het inbedden van CFPS in een reeks alternatieve hydrogels11. Gezien het brede scala aan toepassingen van hydrogels en de functionaliteit van CFPS, kunnen de hier gedemonstreerde methoden een basis vormen van waaruit onderzoekers biologisch verbeterde hydrogelmaterialen kunnen ontwikkelen die geschikt zijn voor hun eigen doeleinden.

In eerdere studies zijn microgelsystemen met een groottebereik van 1 μm tot 400 μm gebruikt om CFPS uit te voeren in hydrogels ondergedompeld in reactiebuffer 23,27,28,29,30,31. De eis om hydrogels onder te dompelen in CFPS-reactiebuffers beperkt echter de mogelijkheden voor hun inzet als materiaal op zich. De hier gepresenteerde protocollen maken het mogelijk om CFPS-reacties op te treden in hydrogels zonder de gels onder te dompelen in reactiebuffers. Ten tweede maakt het gebruik van macroscale gels (tussen 2 mm en 10 mm groot) de studie van de fysieke interactie tussen hydrogels en celvrije genexpressie mogelijk. Met deze techniek is het bijvoorbeeld mogelijk om te bestuderen hoe de hydrogelmatrix CFPS-reacties11 beïnvloedt en hoe CFPS-reacties de hydrogelmatrix31 kunnen beïnvloeden. Grotere maten hydrogels maken ook de ontwikkeling van nieuwe, bio-programmeerbare materialen mogelijk32. Ten slotte is er, door CFPS-reacties in hydrogels in te bedden, ook een potentiële vermindering van de behoefte aan plastic reactievaten. Voor de inzet van celvrije sensoren heeft dit duidelijke voordelen ten opzichte van apparaten die afhankelijk zijn van plasticware. Al met al biedt het inbedden van CFPS-reacties in hydrogels verschillende voordelen voor de inzet van celvrije apparaten buiten het laboratorium.

Het algemene doel van de hier gepresenteerde methoden is om de werking van CFPS-reacties binnen hydrogelmatrices mogelijk te maken. Er worden twee verschillende methoden gedemonstreerd voor het inbedden van celvrije eiwitproductiereacties in hydrogelmaterialen op macroschaal (figuur 1). In methode A worden CFPS-componenten geïntroduceerd in gelyofiliseerde agarose-hydrogels om een actief systeem te vormen. In methode B wordt gesmolten agarose gemengd met CFPS-reactiecomponenten om een compleet CFPS-hydrogelsysteem te vormen, dat vervolgens wordt gelyofiliseerd en opgeslagen totdat het nodig is. Deze systemen kunnen worden gerehydrateerd met een volume water of buffer en analyt om de reactie te starten.

Deze studie maakt gebruik van op Escherichia coli cellysaat gebaseerde systemen. Dit zijn enkele van de meest populaire experimentele CFPS-systemen, omdat E. coli-cellysaatpreparaat eenvoudig en goedkoop is en hoge eiwitopbrengsten bereikt. Het cellysaat wordt aangevuld met de macromoleculaire componenten die nodig zijn om transcriptie en translatie uit te voeren, waaronder ribosomen, tRNA's, aminoacyl-tRNA-synthetasen en initiatie-, rek- en beëindigingsfactoren. In het bijzonder demonstreert dit artikel de productie van eGFP en mCherry in agarose hydrogels met behulp van E. coli-cellysaten en controleert het het uiterlijk van fluorescentie met behulp van een plaatlezer en confocale microscopie. Representatieve resultaten voor de microtiterplaatlezer zijn te zien in Whitfield et al.31, en de onderliggende gegevens zijn openbaar beschikbaar33. Verder wordt de expressie van fluorescerende eiwitten in de gels bevestigd met behulp van confocale microscopie. De twee protocollen die in dit artikel worden gedemonstreerd, maken de assemblage en opslag van op CFPS gebaseerde genetische apparaten in materia mogelijk met als uiteindelijk doel een geschikte fysieke omgeving te creëren voor de distributie van celvrije gencircuits op een manier die de inzet in het veld ondersteunt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cellysaatbuffer en mediabereiding

  1. Bereiding van 2x YT+P agar en medium
    1. Bereid 2x YT+P agar door 16 g/L trypton, 10 g/L gistextract, 5 g/L NaCl, 40 ml/l 1 M K 2 HPO 4, 22 ml/l 1M KH2PO4 en 15 g/L agar uit te meten. Volg voor de 2x YT+P bouillon de vorige samenstelling maar laat de agar weg.
    2. Steriliseer door de 2x YT+P te autoclaveren.
  2. Voorbereiding van de S30A-buffer
    1. Bereid de S30A-buffer voor met 5,88 g/L Mg-glutamaat, 12,195 g/L K-glutamaat en 25 ml/L 2 M Tris, aangepast tot pH 7,7 met azijnzuur.
    2. Bewaar de S30A-buffer maximaal 1 week bij 4 °C.
  3. Voorbereiding van de S30B-buffer
    1. Bereid de S30B-buffer voor met 5,88 g/L Mg-glutamaat en 12,195 g/L K-glutamaat, aangepast tot pH 8,2 met 2 M Tris.
    2. Bewaar de S30B-buffer maximaal 1 week bij 4 °C.

2. Cellysaatpreparaat (4-daags protocol)

  1. Dag 1
    1. Giet de 2x YT+P in agarplaatjes aangevuld met 100 μg/ml ampicilline.
    2. Streep E. coli van −80 °C glycerol en incubeer 's nachts bij 37 °C.
  2. Dag 2
    1. Ent een enkele kolonie van de 2x YT+P plaat in 400 ml 2x YT+P bouillon (aangevuld met ampicilline) in een 1 L verbijsterde kolf.
    2. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C bij 220 tpm schudden.
  3. Dag 3
    1. Meet en registreer de OD600 van de 24-uursculturen; groei is voldoende bij een OD600 van 3-4.
      OPMERKING: Neem een aliquot van 1 ml bacteriecultuur en voer een seriële verdunning uit met medium (2x YT + P-bouillon) voordat u de OD600 nm meet. Houd rekening met het verdunningseffect bij het berekenen van OD600.
    2. Breng de cultuur gelijkmatig over tussen voorgekoelde centrifuerflessen van 500 ml.
    3. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4.500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant vervolgens weg.
    4. Voltooi tijdens het centrifugeren de S30A-buffervoorbereiding door 2 ml / L 1 M DTT toe te voegen aan de eerder voorbereide S30A-buffer, te mengen en de buffer op ijs te houden.
    5. Resuspendeerde de celpellets in 200 ml S30A-buffer.
    6. Draai de flessen krachtig totdat de hele pellet volledig is opgelost, waardoor de cellen zoveel mogelijk op ijs blijven.
    7. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4.500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant vervolgens weg.
    8. Herhaal stap 2.3.5-2.3.7 (inclusief).
    9. Voeg 40 ml S30A-buffer toe aan elke centrifuerfles, resuspensie van de pellets en breng over naar vooraf gewogen centrifugebuizen van 50 ml.
    10. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door decanteren en verwijder het resterende supernatant met een pipet, zodat het zoveel mogelijk op ijs blijft.
    11. Weeg de centrifugebuizen opnieuw, noteer de nieuwe massa en bereken de massa van de pellets.
    12. Flash-freeze pellets in vloeibare stikstof en bewaar ze bij −80 °C.
  4. Dag 4
    1. Ontdooi de pellets op ijs.
    2. Voeg per 1 g pellet het volgende toe: 1,2 ml S30A-buffer (DTT toegevoegd voor gebruik), 275 μL proteaseremmer (8 mM bouillon) en 25 μL lysozym (10 mg/ml bouillon).
    3. Vortex krachtig totdat de pellets volledig zijn opgelost zonder resterende klonten, houd ze zoveel mogelijk op ijs.
    4. In centrifugebuizen van 50 ml soniceert u de celsuspensies bij 120 W, 20 kHz, 30% amplitude en 20 s / 40 s aan / uit-pulsen gedurende 5 minuten ultrasoonapparaat.
    5. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C om het celafval te pelleteren.
    6. Breng het supernatant over in verse centrifugebuizen van 50 ml.
    7. Incubeer buizen bij 37 °C bij 220 tpm gedurende 80 min.
    8. Bereid dialysematerialen voor door 1 ml / L 1 M DTT toe te voegen aan de S30B-buffer. Meng en voeg 900 ml toe aan een steriele bekerglas van 1 l. Voeg een magneetroerder toe en houd deze op 4 °C.
    9. Breng na de afvloeiingsreactie het celextract van stap 2.4.7 over in microcentrifugebuizen van 2 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 20.000 x g .
    10. Consolideer het pelletvrije supernatant op ijs in een centrifugebuis van 50 ml.
    11. Bepaal het totale volume van het geproduceerde celextract en hydrateer het benodigde aantal 10K MWCO-dialysecassettes door ze gedurende 2 minuten onder te dompelen in S30B.
    12. Laad de cassettes via een spuit met maximaal 3 ml extract. Dialyseer tot drie cassettes per bekerglas van 1 liter, roerend bij 4 °C gedurende 3 uur.
    13. Nadat de dialyse is voltooid, die het extract verduidelijkt, brengt u het extract over naar 2 ml microcentrifugebuizen. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    14. Consolideer het geklaarde extract in een verse centrifugebuis op ijs en vortex kort om te mengen.
    15. Bepaal de eiwitconcentratie van het extract met behulp van een fluorometer.
    16. Verdun het extract tot een concentratie van 44,5 mg/ml met behulp van voorgekoeld ddH2O.
    17. Aliquot in aliquots van 200 μl, flash-freeze in vloeibare stikstof en bewaren bij −80 °C.

3. Bereiding van gelyofiliseerde hydrogels (methode A)

  1. Weeg 0,75 g agarose af, voeg ddH2O toe aan een volume van 100 ml en magnetron in 30 s uitbarstingen bij hoge temperaturen om gesmolten agarose-bouillon te creëren.
  2. Breng met behulp van een pipet 50 μL gesmolten agarose over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en laat de gel gedurende 20-30 minuten polymeriseren (polymerisatie vindt sneller plaats als de gels naar een koelkast worden overgebracht).
  3. Vries de microcentrifugebuizen, die de gepolymeriseerde gels bevatten, in vloeibare stikstof in.
  4. Verwijder het deksel van de centrifugebuizen, bedek de openingen van de centrifugebuis met wasfilm en doorboor de film meerdere keren met een naald of pipetpunt.
  5. Breng de microcentrifugebuizen met de gepolymeriseerde gels over naar −80 °C opslag gedurende 1-2 uur.
  6. Haal de centrifugebuizen terug uit -80 °C opslag en plaats ze in een vriesdroger, zodat de buizen volledig droog zijn.
  7. Schakel de vriesdroger in met de volgende instellingen: temperatuur: −20 °C, druk: 0,1 mbar.
  8. Laat de gel een nacht inkoken.
  9. Haal de gels uit de vriesdroger en plaats ze in −80 °C opslag totdat ze nodig zijn.
    OPMERKING: Gels kunnen maximaal 1 jaar gevriesdroogd worden bewaard.

4. Voorbereiding van de voorraad van 14x energieoplossingen

  1. Combineer alle reactiecomponenten (tabel 1) in een centrifugebuis van 15 ml op ijs om een 14x energieoplossing te produceren.
  2. Aliquot de 14x energieoplossing in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij −80 °C (aliquots met een kleiner volume kunnen worden gebruikt).
    OPMERKING: De 14x energieoplossing kan enkele maanden worden bewaard bij −80 °C als herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van de buizen wordt vermeden.

5. Bereiding van de 4x aminozuurbouillon

  1. Ontdooi, op ijs, alle 20 aminozuurcomponenten van een RTS Amino Acid Sampler kit. Vortex de aminozuren om ervoor te zorgen dat ze volledig zijn opgelost.
  2. Combineer in een centrifugebuis van 50 ml alle 20 aminozuren en voeg 12 ml steriele ddH2O. Vortex toe totdat de oplossing helder wordt, met slechts een lichte waas van witte kleuring.
  3. Aliquot de 4x aminozuren in 1,5 ml microcentrifugebuizen (500 μL aliquots).
  4. Vries de 4x aminozuuroplossing aliquots in vloeibare stikstof in en verplaats de aliquots naar −80 °C opslag.

6. Celvrije bufferkalibratie

OPMERKING: De CFPS-buffer die werd gebruikt voor de hydrogelreacties werd gekalibreerd voor optimale DTT-, Mg-glutamaat- en K-glutamaatconcentraties volgens het protocol in Banks et al.34 gewijzigd van Sun et al.35. De kalibratiereactiesamenstellingen werden geselecteerd met behulp van de ontwerpmethode voor experimenten (DOE), waarbij zeven factorniveaus werden geselecteerd voor K-glutamaat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamaat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) en DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) voorraden. JMP Pro 15 werd gebruikt om een aangepast DOE-ontwerp te genereren (tabel 2) en de analyse uit te voeren om de optimale factorconcentraties te bepalen.

  1. Herstel het celvrije extract uit -80 °C opslag en ontdooi op ijs.
  2. Ontdooi de 4x aminozuren, 14x energieoplossing, 40% PEG-8000, plasmide DNA, 3 M K-glutamaat, 100 mM Mg-glutamaat en 100 mM DTT voorraden op ijs.
  3. Maak een kalibratiemastermix door 12,5 μL van de 4x aminozuren, 3,57 μL van de 14x energieoplossing, 2,5 μL van 40% PEG-8000, 3 μg plasmide-DNA en 10 μL celvrij extract (44,5 mg / ml) te combineren en maak tot 35 μL per reactie met ddH2O.
  4. Verdeel het 35 μL mastermengsel in de putjes van een zwarte microtiterplaat met 384 putten.
  5. Voeg volgens het DOE-ontwerp het juiste volume Mg-glutamaat, K-glutamaat en DTT toe aan elke reactie, samen met ddH2O om elke reactie tot 50 μL te maken.
  6. Breng de microtiterplaat over naar een plaatlezer voor fluorescentiedetectie en -analyse met behulp van de beschreven plaatlezerinstellingen (voor mCherry): excitatie: 587 nm, emissie: 610 nm, golflengtebandbreedte: 12 nm, optiek: boven, temperatuur: 37 °C, waarbij fluorescentiemetingen elke 5 minuten worden verzameld gedurende 4 uur totale leestijd. Incubeer de platen met schudden op een gepulseerde instelling bij 60 tpm.
  7. Upload de resultaten naar het JMP DOE-ontwerp en genereer een voorspellingsprofiel om de optimale concentratieniveaus voor K-glutamaat, Mg-glutamaat en DTT te bepalen op basis van gewenste responsvariabelen; In dit geval waren de maximale fluorescentie en reactiesnelheid de responsvariabelen.
  8. Combineer de reagentia zoals weergegeven in tabel 3 om de 2x CFPS-buffer te maken
  9. Aliquot en bewaren bij −80 °C

7. CFPS in gerehydrateerde gelyofiliseerde hydrogels (methode A)

OPMERKING: De plasmiden die in de CFPS-reacties worden gebruikt, zijn gemaakt met behulp van componenten uit de modulaire EcoFlex-toolkit voor E. coli36 en beschreven in Whitfield et al.11 De mCherry en eGFP stonden onder controle van de constitutieve JM23100 promotor. Deze componenten zijn verkrijgbaar bij Addgene.

  1. Haal het celvrije extract terug uit -80 °C opslag en ontdooi op ijs gedurende ongeveer 20 minuten.
  2. Verzamel de 2x CFPS-buffer en plasmide-DNA en ontdooi op ijs.
  3. Verzamel de gevriesdroogde hydrogels en laat ze 15 minuten op kamertemperatuur komen door de gels op de bank te laten staan.
  4. Breng de gels over in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en trim de gels indien nodig met een scalpel om ze in de putjes te laten passen.
  5. Combineer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 10 μL celvrij extract met 25 μL 2x CFPS-buffer en 4 μg plasmide-DNA; vul aan tot een totaal volume van 50 μL met ddH2O om de CFPS-oplossing te creëren.
  6. Pipetteer de CFPS-oplossing op de gevriesdroogde hydrogels.
  7. Laat de gels 5-10 minuten bij kamertemperatuur in het CFPS-systeem weken.
  8. Breng de gels over op een zwarte 384-well microtiterplaat met behulp van een spatel.
  9. Breng de microtiterplaat over naar een plaatlezer voor fluorescentiedetectie en -analyse met behulp van de plaatlezerinstellingen die worden beschreven in stap 6.6. Representatieve resultaten zijn beschikbaar in eerdere studies31,33.

8. Celvrije eiwitsynthese in inzetbare hydrogels (methode B)

  1. Herstel celvrij extract uit -80 °C opslag en ontdooi op ijs gedurende ongeveer 20 minuten.
  2. Verzamel het plasmide-DNA en ontdooi op ijs.
  3. Combineer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs 10 μl celvrij extract met 3 μg plasmide-DNA en 25 μl 2x CFPS-buffer, wat neerkomt op een totaal volume van 37,5 μl.
  4. Meet 3 g agarose en voeg toe aan 100 ml ddH2O-buffer om 3% agarose te creëren.
  5. Magnetron de 3% agarose in 30 s uitbarstingen op hoog vermogen.
  6. Pipetteer 12,5 μl gesmolten agarose in microcentrifugebuizen van 1,5 ml met CFPS-mengsel tot een totaal volume van 50 μl.
  7. Laat de gesmolten agarose afkoelen, maar niet polymeriseren, laat de agarose in een warmteblok op 50 °C staan.
  8. Combineer de gesmolten agarose met de CFPS-oplossing; meng via pipetteren en roeren met de punt en zorg ervoor dat u snel beweegt om gelpolymerisatie te voorkomen voordat de CFPS-oplossing kan worden gemengd.
  9. Laat de gels afkoelen bij kamertemperatuur en polymeriseer gedurende ongeveer 2 minuten.
  10. Breng de gepolymeriseerde agarose over naar 1,5 ml microcentrifugebuizen met een spatel en vries in vloeibare stikstof.
  11. Plaats de flash-frozen hydrogels gedurende 1 uur in −80 °C opslag.
  12. Herstel de gels uit opslag; Verwijder de deksels van de microcentrifugebuis, bedek de buizen met wasfilm en doorboor de film om het vocht te laten drogen.
  13. Schakel de vriesdroger in met de volgende instellingen: temperatuur: −20 °C, druk: 0,1 mbar, vriesdrogen gedurende 18 uur ('s nachts).
  14. Bewaar de gevriesdroogde CFPS-apparaten in −80 °C opslag tot gebruik.
  15. De gevriesdroogde CFPS-apparaten, met een ongeveer nat volume van 50 μL, kunnen worden gerehydrateerd met 50 μL ddH2O zonder overtollige vloeistof. Rehydratatie duurt ongeveer 30 min.
  16. Breng de gels over op een zwarte 384-well microtiterplaat met behulp van een spatel.
  17. Breng de microtiterplaat over naar een plaatlezer voor fluorescentiedetectie en -analyse met behulp van de plaatlezerinstellingen die worden beschreven in stap 6.6. Representatieve resultaten zijn beschikbaar in eerdere publicaties31,33.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het inbedden van CFPS-reacties in hydrogelmatrices, waarbij figuur 1 een schematisch overzicht van de twee benaderingen geeft. Beide methoden zijn geschikt voor vriesdrogen en langdurige opslag. Methode A is om twee redenen de meest gebruikte methodologie. Ten eerste is aangetoond dat het de meest geschikte methode is voor het werken met een reeks hydrogelmaterialen11. Ten tweede maakt methode A het mogelijk om genetische con...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden twee protocollen beschreven voor de opname van op E. coli-cellysaat gebaseerde CFPS-reacties in agarose-hydrogels . Deze methoden maken gelijktijdige genexpressie in het hele materiaal mogelijk. Het protocol kan worden aangepast voor andere CFPS-systemen en is met succes uitgevoerd met in de handel verkrijgbare CFPS-kits naast de in het laboratorium bereide cellysaten die hier worden beschreven. Belangrijk is dat het protocol genexpressie mogelijk maakt in afwezigheid van een externe vloeibare fase. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de steun van de Biotechnology and Biological Sciences Research Council awards BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) en BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), en de Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Gegevens ter ondersteuning van deze publicatie zijn open beschikbaar op: 10.25405/data.ncl.22232452. Met het oog op open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY) licentie toegepast op elke Author Accepted Manuscript-versie die ontstaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
AzijnzuurSigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Aminozuur Sampler KitVWRBTRABR1401801
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Co-enzym A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Folinic acidSigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamaatSigma-AldrichG1149-100G
LysozymeSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamaatSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Kaliumhydroxide (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Dibasisch kaliumfosfaat (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Monobasisch kaliumfosfaat (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP2714-1BTL
Qubit EiwitconcentratiekitThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Natriumchloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidineSigma-Aldrich85558-1G
TryptoneThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
GistextractSigma-AldrichY1625-1KG
Apparatuur
1,5 mL microcentrifugebuisjesSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO dialysecassettesThermo Fisher Scientific66381
15 mL centrifugebuisSarstedt62.554.502
50 mL centrifugeflessenSarstedt62.547.254
500 mL centrifugeflessenThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus vriesdrogerChristpart no. 101521, 101522, 101527
Centrifuge op tafelThermo Fisher ScientificH-X3R
Zwarte 384 well microtiterplatenFischer Scientific66
CuvettesThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab ChorusElga#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425REppendorfEP00532
HogesnelheidscentrifugeBeckman CoulterB34183
JMP licentieSAS Institute15
Magnetische roerderFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Fotospectrometer (Biophotometer)Eppendorf16713
Pipetten en tipsGilson#####
PrecisieweegschaalSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866
Schudende incubatorThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Thermo Fisher Scientific12893543
Statische incubatorSanyoMIR-162
Spuit en naaldenThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Schudende Incubator)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Lux platereaderThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meterVWR662-1657

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853(2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248(2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958(2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702(2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580(2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429(2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261(2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188(2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357(2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7(2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050(2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64(2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407(2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105(2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785(2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150(2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165(2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163(2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hydrogel insluitingsynthetische gennetwerkeneiwitexpressie hydrogelscellysaatreactiesgevriesdroogde hydrogelsfluorescentiedetectieagarosegelsdiagnostische apparatenplaatlezeranalyse

Gerelateerde artikelen