Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65515

⸱

22 september 2023

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat snelle, robuuste en goedkope fabricage van tumorsferoïden mogelijk maakt, gevolgd door hydrogel-inkapseling. Het is breed toepasbaar omdat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is. Het zou met name nuttig zijn voor het onderzoeken van sferoïde-matrixinteracties en het bouwen van in vitro weefselfysiologische of pathologiemodellen.

Samenvatting

Driedimensionale (3D) inkapseling van sferoïden is cruciaal om de micro-omgeving van de tumor adequaat na te bootsen voor optimale celgroei. Hier ontwierpen we een in vitro 3D-glioblastoommodel voor sferoïde inkapseling om de extracellulaire micro-omgeving van de tumor na te bootsen. Eerst vormden we vierkante piramidale microtimidale microtiolmallen met behulp van polydimethylsiloxaan. Deze microtitermallen werden vervolgens gebruikt om tumorsferoïden te fabriceren met streng gecontroleerde groottes van 50-500 μm. Zodra sferoïden waren gevormd, werden ze geoogst en ingekapseld in hydrogels op basis van polyethyleenglycol (PEG). PEG-hydrogels zijn een veelzijdig platform voor sferoïde inkapseling, omdat hydrogeleigenschappen zoals stijfheid, afbreekbaarheid en celkleefkracht onafhankelijk kunnen worden afgestemd. Hier gebruikten we een representatieve zachte (~8 kPa) hydrogel om glioblastoomsferoïden in te kapselen. Ten slotte werd een methode ontwikkeld om sferoïden te kleuren en af te beelden om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen via confocale microscopie. Vanwege de dichte sferoïde kern en de relatief schaarse periferie kan beeldvorming moeilijk zijn, maar het gebruik van een klaringsoplossing en confocale optische doorsnede helpt deze beeldvormingsproblemen te verlichten. Samenvattend tonen we een methode om uniforme sferoïden te fabriceren, ze in te kapselen in PEG-hydrogels en confocale microscopie uit te voeren op de ingekapselde sferoïden om sferoïde groei en verschillende cel-matrixinteracties te bestuderen.

Inleiding

Tumorsferoïden zijn naar voren gekomen als nuttige in vitro-hulpmiddelen bij het bestuderen van de etiologie, pathologie enresponsiviteit van kanker1. Traditioneel worden sferoïden gekweekt in omstandigheden zoals platen met lage adhesie of bioreactoren, waar cel-cel adhesie de voorkeur heeft boven cel-oppervlak adhesie2. Het wordt nu echter erkend dat om de micro-omgeving van de tumor getrouwer te recapituleren, in vitro sferoïde modellen zowel cel-cel- als cel-matrixinteracties moeten vastleggen. Dit heeft meerdere groepen ertoe aangezet om steigers te ontwerpen, zoals hydrogels, waar sferoïden kunnen worden ingekapseld 3,4. Dergelijke op hydrogel gebaseerde sferoïde modellen maken het mogelijk om cel-cel- en celmatrixinteracties op verschillende celgedragingen op te helderen, zoals levensvatbaarheid, proliferatie, stamheid of therapieresponsiviteit.

Hier beschrijven we een protocol voor het inkapselen van glioblastoomsferoïden in polyethyleenglycol (PEG) hydrogels. Er zijn meerdere literatuurrapporten over inkapseling van glioblastoomcellen in hydrogels. Sferoïden werden bijvoorbeeld gevormd door U87-cellen in te kapselen in PEG-hydrogels versierd met een RGDS-kleefligand en verknoopt met een enzymatisch splitsbaar peptide om het effect van hydrogelstijfheid op celgedrag te bepalen. U87-cellen zijn ook gevormd in andere op PEG gebaseerde of op hyaluronzuur gebaseerde hydrogels om de kankerstamcelpopulatie uit te breiden6 of om matrix-gemedieerde mechanismen van chemotherapieresistentie te onderzoeken 7,8,9. Glioblastoom-sferoïden zijn ook ingekapseld in gelatinehydrogels om de overspraak tussen microglia en kankercellen en het effect ervan op celinvasie te bestuderen10. Over het algemeen hebben dergelijke onderzoeken het nut aangetoond van op hydrogel gebaseerde in vitro modellen bij het begrijpen van glioblastoompathologie en het bedenken van behandelingen.

Verder zijn er verschillende methoden voor de fabricage van tumorsferoïden en hydrogel-inkapseling11. Gedispergeerde cellen kunnen bijvoorbeeld in hydrogels worden gezaaid en in de loop van de tijd sferoïden kunnen vormen 5,12. Een nadeel van een dergelijke methode is de polydispersiteit van de gevormde sferoïden, wat kan leiden tot differentiële celreacties. Om uniforme sferoïden te produceren, kunnen cellen worden ingekapseld in microgels en gedurende langere perioden worden gekweekt totdat ze de gel binnendringen en hermodelleren13, of cellen kunnen worden afgezet in sjabloongels met bolvormige 'gaten' en14 kunnen aggregeren. Het nadeel van deze methoden is hun relatieve complexiteit, de noodzaak van een druppelgenerator of andere middelen om microgels of de 'gaten' in de gel te vormen, en de tijd die sferoïden nodig hebben om te groeien en te rijpen. Als alternatief kunnen sferoïden worden voorgevormd in microwells 9,15,16 of in hangende druppelplaten17,18 en vervolgens worden ingekapseld in een hydrogel, vergelijkbaar met de hier beschreven techniek. Deze methoden zijn eenvoudiger en kunnen met een hogere doorvoer worden uitgevoerd. Interessant is dat is aangetoond dat de methode van sferoïde vorming het gedrag van sferoïde cellen kan beïnvloeden, zoals genexpressie, celproliferatie of responsiviteit vangeneesmiddelen19,20.

Hier richten we ons op glioblastoom, omdat het een solide tumor is waarvan de oorspronkelijke omgeving de zachte, nanoporeuze hersenmatrix21 is, die kan worden nagebootst door een zachte, nanoporeuze hydrogel. Glioblastoom is ook de dodelijkste hersenkanker waarvoor geen remedie beschikbaar is. Het hier beschreven protocol kan echter worden gebruikt voor het inkapselen van sferoïden die een solide tumor vertegenwoordigen. We hebben ervoor gekozen om PEG-hydrogels te gebruiken die worden gevormd door een additiereactie van het Michael-type23. PEG is een synthetische, niet-afbreekbare en biocompatibele hydrogel die inert is en dient als steiger en fysieke celondersteuning, maar geen celhechting ondersteunt23. Celadhesie kan afzonderlijk worden toegevoegd via tethering van hele eiwitten of adhesieve liganden24, en afbreekbaarheid kan worden toegevoegd via chemische modificaties van de PEG-polymeerketen of hydrolytisch of enzymatisch afbreekbare crosslinkers 25,26. Hierdoor kunnen biochemische eigenschappen onafhankelijk van mechanische of fysische hydrogeleigenschappen worden afgestemd, wat voordelig zou kunnen zijn bij het bestuderen van cel-matrixinteracties. De geleringschemie van het Michael-type is selectief en vindt plaats onder fysiologische omstandigheden; Daarom maakt het sferoïde inkapseling mogelijk door de sferoïden eenvoudig te mengen met de hydrogel-precursoroplossing.

Over het algemeen heeft de hier gepresenteerde methodologie een aantal opvallende kenmerken. Ten eerste is het vervaardigen van tumorsferoïden in een multiwell-assemblage efficiënt, snel en zijn de kosten van de benodigde materialen laag. Ten tweede worden de sferoïden in grote batches geproduceerd in verschillende maten met een lage polydispersiteit. Ten slotte zijn alleen in de handel verkrijgbare materialen nodig. Het nut van de methodologie wordt geïllustreerd door het effect van substraateigenschappen op de levensvatbaarheid, circulariteit en celstamheid van sferoïde cellen te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van oplossingen

  1. Bereiding van polydimethylsiloxaan (PDMS)-precursoroplossing
    1. Bereid de negatieve PDMS-precursoroplossing (ook gebruikt voor de lijmprecursoroplossing). Schep het elastomeer met een spatel in een weegboot en weeg het. Voeg het uithardingsmiddel toe aan de elastomeerbasis in een verhouding van 1:10. Meng het PDMS en het uithardingsmiddel voorzichtig en grondig met behulp van de spatel in de kunststof weegboot.
      NOTITIE: Deze PDMS-precursoroplossing wordt in de vierkante piramidale microtimidale microtiradeplaat met 6 putjes gegoten om de negatieve mal te vormen. Dit is dezelfde oplossing die wordt gebruikt voor de lijmvoorloperoplossing.
    2. Bereid de positieve PDMS-precursoroplossing voor. Schep de elastomeerbasis met een spatel in de weegboot en weeg deze. Voeg het uithardingsmiddel toe aan de elastomeerbasis in een verhouding van 1:9. Meng het PDMS en het uithardingsmiddel voorzichtig en grondig met behulp van de spatel in de kunststof weegboot.
      NOTITIE: Deze PDMS-precursoroplossing wordt later op de negatieve mal gegoten om de positieve mal te vormen.
  2. Bereiding van 0,3 M triethanolamine (TEA)-buffer met pH 8
    1. Pipetteer 1 ml TEA en 9 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een pipethulpmiddel op een conische lijn van 50 ml om een 0,75 M TEA-oplossing te creëren. Titreer de oplossing tot een pH van 8 met behulp van 1 N HCl of 1 N NaOH. Voeg vervolgens voldoende 1x PBS toe om een eindvolume van 25 ml te bereiken om een uiteindelijke TEA-concentratie van 0,3 M met een pH van 8 te bereiken.
      LET OP: Bewaar HCl- en NaOH-oplossingen in een brandbare kast bij kamertemperatuur (RT). Draag persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren.
  3. Voorbereiding van complete media
    1. Om het volledige medium te bereiden, voegt u 10% (w/v) of 56 ml foetaal runderserum en 1% (w/v) of 5,6 ml penicilline en streptomycine toe aan 500 ml RPMI-medium.
    2. Breng de oplossing voor gebruik aan op 37 °C gedurende 10-20 minuten of tot de oplossing warm is.
    3. Bewaar de oplossing maximaal 6 maanden bij 0-4 °C.
  4. Bereiding van 20% (m/v) polyethyleenglycol (PEG) voorraadoplossingen
    OPMERKING: De berekening is gebaseerd op oplossingen van 100 μL die naar behoefte kunnen worden op- of afgeschaald.
    1. Om een 100 μL stockoplossing van 20% w/v 4-armig PEG-Acrylaat (4-armig PEG-Ac) te bereiden, weegt u 20 mg 4-armig PEG-Ac-poeder af in een microfugebuis. Voeg 70 μL 0,3 M TEA-buffer toe en draai de oplossing vervolgens ongeveer 30 s of totdat deze volledig is opgelost. Houd rekening met volumeverandering als gevolg van het oplossen van poeder door voldoende TEA-buffer (~27 μL) toe te voegen om een eindoplossingsvolume van 100 μL te bereiken.
    2. Om een 100 μL stockoplossing van 20% w/v PEG-diSH te bereiden, weegt u 20 mg PEG-diSH-poeder af in een microfugebuis. Voeg 70 μL TEA-buffer toe en draai de oplossing vervolgens ongeveer 30 seconden of totdat deze volledig is opgelost. Houd rekening met volumeverandering als gevolg van het oplossen van poeder door voldoende TEA-buffer (~27 μL) toe te voegen om een eindoplossingsvolume van 100 μL te bereiken.
      OPMERKING: Het PEG-poeder is zeer hygroscopisch en moet worden bewaard in een gedroogde container bij -20 °C. Als je het uit de vriezer haalt, laat het PEG-poeder dan 10 minuten ontdooien voordat je de fles opent om het poeder te wegen. Ontlucht de fles met een inert gas zoals stikstof of argon om de vochtige lucht te verdringen voordat u deze terugplaatst in de vriezer. De stockoplossing van 4-armig PEG-Ac kan tot 2 weken voor gebruik bij 4 °C worden bewaard. De stockoplossing van PEG-diSH moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid en kan niet worden opgeslagen omdat de thiolgroepen met elkaar reageren om disulfidebindingen te vormen.
  5. Bereiding van 2% v/v basaalmembraanmatrixoplossing
    1. Om een werkoplossing van 2% v/v basaalmembraanmatrix te bereiden, voegt u 20 μL van de basaalmembraanmatrix (LDEV-vrij) toe aan 9,98 ml volledige media en mengt u grondig door ~10 keer op en neer te pipetteren. Bereid de oplossing op 4 °C (op ijs), verwarm deze tot 37 °C (in een oven of incubator) en gebruik onmiddellijk.
      OPMERKING: De basaalmembraanmatrix begint een gel te vormen bij >10 °C, dus zorg ervoor dat u de basaalmembraanmatrixoplossing mengt met volledige media bij 2-6 °C. De volledige mediasamenstelling wordt beschreven in stap 1.3.
  6. Bereiding van de celfixeeroplossing
    1. Om 1 ml celfixerende oplossing te bereiden die 4% g/v paraformaldehyde en 0,1% v/v niet-ionische oppervlakteactieve stof bevat, mengt u eerst 891 μl 1x PBS en 108 μl paraformaldehyde (concentratie van 37% g/v) en voegt u vervolgens 1 μl niet-ionogene oppervlakteactieve stof (concentratie van 100%) toe. Meng de oplossing grondig.
      OPMERKING: De fixeeroplossing moet elke keer dat fixatie wordt uitgevoerd, opnieuw worden gemaakt.
      LET OP: Paraformaldehyde is ontvlambaar en kan brandbare stofconcentraties in de lucht vormen. Het veroorzaakt huidirritatie en ernstig oogletsel. Vermijd inademing, omdat dit irritatie van de luchtwegen kan veroorzaken. Hanteer paraformaldehyde in een chemische zuurkast en draag persoonlijke beschermingsmiddelen. Was de handen grondig na het hanteren. De niet-ionogene oppervlakteactieve stof veroorzaakt huidirritatie en ernstig oogletsel. Draag beschermende handschoenen en oogbescherming of gelaatsbescherming bij het hanteren. Om lozing in het milieu te voorkomen, opent u de fles in een chemische zuurkast. Was de handen grondig na het hanteren.
  7. Bereiding van de kleuroplossingen
    1. Om 3 mM 3,3'-dihexyloxacarbocyaninejodide (DiOC) te bereiden, mengt u 2,65 mg DiOC in 1 ml DMSO.
    2. Om 1,5 mM propidiumjodideoplossing (PI) te bereiden, mengt u 1 mg PI in 1 ml gedeïoniseerd water.
  8. Bereiding van de oplossing voor het opruimen van sferoïden
    1. Bereid klaringsoplossingen van 20%, 40% en 80% v/v formamide in 1x PBS voor sferoïde klaring.
      1. Om 10 ml 20% v/v formamide te maken, meng je 8 ml 1x PBS gevolgd door 2 ml formamide. Om 10 ml 40% v/v formamide te maken, meng je 6 ml 1x PBS gevolgd door 4 ml formamide. Om 10 ml 80% v/v formamide te maken, meng je 2 ml 1x PBS gevolgd door 8 ml formamide.
      2. Na het combineren van formamide en 1x PBS, meng je de oplossing door ongeveer 30 s te vortexen.

2. Fabricage van vierkante piramidale microwells

  1. Fabriceer een negatieve PDMS-mal van vierkante piramidale microwells zoals weergegeven in figuur 1.
    1. Bereid 2 g (~1 ml) negatieve PDMS-precursoroplossing en giet deze op een kuiltje van een vierkante piramidale hoofdvorm met 6 putjes. Merk op dat 1 ml een putje van de plaat volledig bedekt. Nadat u de hoofdmal met PDMS hebt bedekt, ontgast u de PDMS-precursoroplossing gedurende 30 minuten door de vierkante piramidale plaat met 6 putjes in een vacuümexsiccator te plaatsen. Laat het PDMS vervolgens uitharden door de plaat gedurende 24 uur in een oven van 60 °C te plaatsen.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat het deksel van de plaat is verwijderd om te ontgassen en er weer op is geplaatst om uit te harden. Ontgas de oplossing in een vacuümexsiccator of door te spoelen met een inert gas zoals stikstof of argon. Als de negatieve schimmelprecursoroplossing na 30 minuten nog steeds luchtbellen bevat, wat wijst op onvoldoende ontgassing, plaats deze dan nog eens 30 minuten in een vacuümexsiccator . Gebruik een of meerdere plaatputjes tegelijk om een of meer PDMS-negatieve mallen voor te bereiden. Er kunnen vierkante piramidale microwells van verschillende afmetingen worden gebruikt, zoals zijlengtes van 400 en 800 μm, zoals weergegeven in tabel 1. Dezelfde hoeveelheid PDMS wordt gebruikt, ongeacht de vierkante piramidale afmetingen.
    2. Zodra PDMS is uitgehard terwijl het nog warm is, verwijdert u voorzichtig de negatieve PDMS-mal uit de hoofdmal met een spatel en snijdt u de negatieve mal in een plaat met een diameter van 35 mm met behulp van een biopsiepons. Plaats in een petrischaal, dek af met het deksel en laat RT nog 24 uur verder uitharden.
      NOTITIE: Om negatieve mallen te verwijderen, gebruikt u een spatel om tussen de putplaat en de PDMS-mal te komen en trekt u de negatieve mal voorzichtig uit de hoofdmal. De mal wordt in platen van 35 mm gesneden om in een petrischaal van 35 mm te passen. Mallen kunnen in andere maten worden gemaakt om op platen met verschillende diameters te passen. De 35 mm negatieve matrijzen kunnen bij RT worden opgeslagen, beschermd tegen stof en gedurende 6 maanden worden hergebruikt.
  2. Bereid een positieve PDMS-mal voor van vierkante piramidale microwells.
    1. Plaats de 35 mm platen van de negatieve PDMS-mal in een petrischaal van 35 mm met de getextureerde microbuisjes naar boven gericht.
    2. Bereid 2,5 g (~1,2 ml) positieve PDMS-precursoroplossing zoals hierboven en giet deze op de negatieve mal in de petrischaal van 35 mm om de negatieve mal volledig te bedekken. Ontgas vervolgens de precursoroplossing gedurende 30 minuten zoals hierboven en plaats deze gedurende 3-4 uur in een oven van 60 °C.
      OPMERKING: Omdat PDMS stroperig is, kan zich een luchtbel vormen door lucht die onder de negatieve mal zit. Als zich een luchtbel vormt onder de negatieve mal, duw de mal dan voorzichtig naar beneden met een spatel om de bubbel los te laten. Als er luchtbellen achterblijven, ga dan door met ontgassen gedurende 30 minuten, of neem een spatel en roer de positieve vormoplossing voorzichtig totdat de belletjes knappen.
    3. Zodra de positieve PDMS-mal is uitgehard, verwijdert u de mallen uit de petrischaal van 35 mm en pelt u de positieve mal onmiddellijk uit de negatieve mal.
      OPMERKING: Timing is belangrijk voor een succesvolle peeling van de positieve mal. Verwijdering kan het beste worden gedaan door lichtjes in de positieve mal te snijden met een scheermes om het grensvlak tussen de positieve en negatieve mal bloot te leggen en de mallen van elkaar af te pellen. Trek vervolgens de randen van de ronde vorm weg. Trek voorzichtig de negatieve mal van de positieve mal.
  3. Lijm de vormpjes op de bodem van de putjes van een bord met 48 putjes.
    OPMERKING: Hier wordt een plaat met 48 putjes gebruikt, maar andere platen kunnen worden gebruikt zolang de vormplaten in de juiste diameters worden gesneden (bijvoorbeeld een diameter van 6 mm voor een plaat met 96 putjes).
    1. Snijd de positieve mallen in plakken met behulp van een biopsiepons van 10 mm.
      OPMERKING: Er kunnen ongeveer 4 mallen (elk met een diameter van 10 mm) worden gesneden uit één positieve mal met een diameter van 35 mm.
    2. Om de mallen op de bodem van een plaat met 48 putjes te lijmen, bereidt u de PDMS-lijmprecursoroplossing (~0,5 ml of 1 g) zoals eerder beschreven27. Gebruik een pincet om de platte kant (niet de kant met het patroon van microtiels) van de positieve mal van 10 mm voorzichtig in de PDMS-precursoroplossing te dopen. Plaats voorzichtig één vorm per putje van een bord met 48 putjes en druk elke vorm voorzichtig op de bodem van het putje met behulp van het pincet. Plaats de gemonteerde plaat 4-24 uur in een oven van 60 °C om de PDMS-lijm te laten uitharden.
      OPMERKING: Als PDMS-lijmprecursoroplossing op de positieve malmicrotiterbuisjes terechtkomt, kan deze worden afgeveegd met zacht tissuepapier en kan de stap worden herhaald. Zorg er bij het lijmen voor dat de lijm de microotjes niet bedekt.
    3. Steriliseer mallen door 300 μL 70% ethanol toe te voegen aan elk putje van de 48-wells plaat met behulp van een pipet van 1000 μL. Zuig de 70% ethanol op en plaats de plaat met 48 putjes onafgedekt in een weefselkweekkap onder UV (302 nm) gedurende 2 uur.
      OPMERKING: Mallen kunnen 6 maanden worden gebruikt en indien nodig opnieuw worden gesteriliseerd.

3. Meercellige tumorsferoïde vorming, oogst en inkapseling in hydrogels

OPMERKING: Het protocol dat in deze sectie wordt beschreven, is voor de U87-cellijn van menselijke glioblastoom (zie afbeelding 1 en afbeelding 2), maar een soortgelijk protocol kan worden gebruikt met andere kankerceltypen.

  1. Meercellige tumorsferoïde vorming
    1. Was de microtitervormen eerst met een antikleefspoeloplossing door 300 μL van de oplossing aan elk putje toe te voegen met behulp van een pipet van 1000 μL. Centrifugeer vervolgens gedurende 3 minuten bij 1620 x g en zuig de oplossing op met behulp van een vacuümpomp en een pasteurpipet.
      OPMERKING: Voer deze stap uit vlak voor het zaaien van cellen.
    2. Stel de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C bloot aan ~80 μl 0,25% trypsine/EDTA percm2 van het oppervlak van de kweekkolf. 1 ml trypsine/EDTA is bijvoorbeeld geschikt voor een T-25-celkweekkolf. Neutraliseer de trypsine door hetzelfde volume compleet celkweekmedium toe te voegen. Voeg bijvoorbeeld 1 ml compleet medium toe aan de trypsinebevattende T-25 celkweekkolf. Verzamel de cellen uit de weefselkweekkolf.
    3. Breng 10 μL van de celsuspensie over in elke poort van een hemocytometer voor het tellen van cellen. Gebruik een omgekeerde microscoop om het totale aantal cellen te tellen en het gemiddelde te nemen van dat aantal cellen uit ten minste 8 kwadranten, waarbij u ervoor zorgt dat het aantal cellen in elk hemocytometerkwadrant 20-50 is voor goede resultaten van het celgetal. Vermenigvuldig het berekende getal met 104 om de uiteindelijke celconcentratie te bepalen.
    4. Resuspendeer de verzamelde cellen in het volledige RPMI-celkweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine in een gewenste eindcelconcentratie, afhankelijk van de gewenste sferoïde grootte, zoals weergegeven in tabel 1.
      OPMERKING: De microwells van 800 μm leveren ~75 sferoïden op in één putje van een plaat met 48 putjes, en de microwells van 400 μm leveren ~300 sferoïden op in één putje van een plaat met 48 putjes.
    5. Plaats 500 μL celsuspensie in de gewenste concentratie in microwells en centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 1620 x g . Plaats de plaat gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 om sferoïden te laten vormen.
      OPMERKING: Als er geen sferoïden worden gevormd, kan 2% v/v van de basale membraanmatrix in combinatie met volledige media worden gebruikt om cellen te resuspenderen (meer details in stap 1.5).
  2. Sferoïden oogsten
    1. Gebruik een pipet van 1000 μl om 500 μl compleet medium stevig in het putje te pipetteren. Gebruik 500 μL medium uit de put om de vier kwadranten van de put (met name de bovenste, onderste, linker- en rechterkwadranten) door drie tot vier keer op en neer te pipetteren bij de kwadranten om de sferoïden los te maken. Zuig het medium met de sferoïden (~1000 μL totaal) voorzichtig op in een microcentrifugebuis met behulp van een pipet van 1000 μL en laat de sferoïden naar de bodem zakken.
    2. Verwijder het supernatans en resuspendeer de sferoïden tot de gewenste eindconcentratie. Om bijvoorbeeld ~8 sferoïden in een gel van 20 μL na inkapseling te verkrijgen, resuspendeert u de sferoïden in 100 μL media, wat een sferoïde concentratie oplevert van ~75 sferoïden/100 μL in de sferoïde suspensie.
  3. Inkapseling van sferoïden in hydrogels, zoals weergegeven in figuur 2.
    1. Om 100 μl van een 10% w/v PEG-hydrogel-precursoroplossing te maken, combineert u 50 μl van de sferoïde suspensie, gevolgd door 30 μl 20% w/v 4-armige PEG-Ac en ten slotte 20 μl 20% w/v PEG-diSH in een microcentrifugebuisje. Dit geeft een stochiometrische molaire verhouding van acrylaat (Ac) tot thiol (SH) groepen, wat zorgt voor een optimale verknoping. Meng de gel-precursoroplossing door ~10 keer op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: De samenstelling, het volume en de polymeerafstemming van hydrogel kunnen naar behoefte worden gewijzigd. De resulterende hydrogels zullen langzaam afbreken en niet-celklevend zijn. Om de hydrogelcellijm te maken, kan een adhesieve ligand zoals RGDS worden toegevoegd. Om de hydrogel enzymatisch afbreekbaar te maken, kon een enzymatisch afbreekbare peptide-crosslinker worden toegevoegd die cysteïneresiduen aan beide uiteinden bevat. Bij het overbrengen van sferoïden moet u de oplossing twee keer voorzichtig pipetteren om sferoïden los te maken en in suspensie te brengen om een gelijkmatige verdeling van sferoïden te garanderen.
    2. Pipetteer 20 μl van de gelprecursoroplossing tussen twee met parafilm beklede glasglaasjes gescheiden met afstandhouders van 1 mm silicium en plaats de objectglaasjes met de gelprecursoroplossing gedurende 15 minuten in een incubator van 37 °C, 5% CO2 om gelering mogelijk te maken.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de twee glasplaatjes bedekt zijn met parafilm om een hydrofoob oppervlak te creëren dat gemakkelijk kan worden gepeld bij gelering. In plaats van parafilm kan een hydrofobe coatingoplossing worden gebruikt. Een volume van 20 μL hydrogel-precursoroplossing resulteert in een hydrogelplaat met een diameter van ~6 mm en een hoogte van 1 mm voorafgaand aan de zwelling. Elk type afstandhouder en elke dikte kan worden gebruikt, maar het wordt aanbevolen om de geldikte op of onder 1 mm te houden (dikkere hydrogels kunnen de zuurstofdiffusie en het transport van voedingsstoffen naar de cellen beperken) maar groter dan de sferoïde diameter (zodat sferoïden volledig in de gel worden ingekapseld). Elk volume van de hydrogel-precursoroplossing kan worden gebruikt. De gels van 20-30 μL zijn geschikt voor een plaat met 24 putjes.
    3. Zodra de hydrogelering is voltooid, scheidt u de twee glasplaatjes en trekt u de gels voorzichtig van de glasplaat met een spatel. Plaats de gels in een plaat met 24 putjes, één per putje, en zorg ervoor dat het oppervlak met de sferoïden naar boven wijst.
      OPMERKING: Sferoïden vallen tijdens het geleren naar de bodem van de gel, dus als u ze omkeert voor kweek, zorgt u ervoor dat de sferoïden zich in de buurt van het oppervlak van de hydrogel bevinden voor een betere toegang tot voedingsstoffen en zuurstof. De gelering kan worden gecontroleerd door te observeren of er hydrogel-precursoroplossing in de microcentrifugebuis achterblijft en niet wordt gebruikt om platen te maken door de buis om te keren en het tijdstip te noteren waarop de gel stopt met stromen.
    4. Voeg een compleet medium (~500 μL) toe aan elk putje en zorg ervoor dat de hydrogel volledig is ondergedompeld. Plaats de multiwell-plaat in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 en kweek de cellen met mediumwisselingen om de 2-3 dagen.
      OPMERKING: Hydrogels kunnen tot 4 weken worden gekweekt of totdat de hydrogels zijn afgebroken, waarbij de media om de dag worden vervangen.

4. Fluorescerende kleuring

  1. Levensvatbaarheid van de cel
    1. Gebruik de kleurstof 3,3'-dihexyloxacarbocyaninejodide (DiOC), die de mitochondriën en het endoplasmatisch reticulum van alle cellen kleurt, om de levensvatbaarheid van de cel te bepalen. Gebruik DiOC (3 mM) in een concentratie van 0,02 μg/ml. Gebruik met name een pipet van 20 μl om 2 μL DiOC per 1000 μl media toe te voegen aan de kolf die de gedissocieerde cellen kweekt (ten minste 24 uur voorafgaand aan het vormingsproces van sferoïden in sectie 3). Wacht 24 uur totdat de DiOC de cellen kleurt.
    2. Gebruik de nucleaire en chromosoomkleuring, propidiumjodide, PI (1,50 mM), die alleen dode cellen binnendringt. Om de cellen te kleuren, zuigt u eerst alle media op en spoelt u de gel af met een pipet van 1000 μL om 500 μL 1x PBS toe te voegen, zodat de gel volledig is ondergedompeld.
    3. Zuig de PBS op en voeg 500 μL verse media toe, gevolgd door 30 μL van de PI-oplossing aan elk putje (d.w.z. 6 μL per 100 μL media). Bedek de putplaat met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen. Plaats de putplaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 en laat de PI 30 minuten de dode cellen kleuren.
    4. Verwijder de folie en zuig het medium uit de putjes op. Gebruik een pipet van 1000 μl om 500 μl 1x PBS toe te voegen om de hydrogel onder te dompelen. Zuig de 1x PBS op en herhaal de spoeling nog twee keer. Voeg 500 μL media toe aan elk putje en beeld onder een fluorescerende omgekeerde of confocale microscoop.
    5. Bereken de levensvatbaarheid van de cel door het gebied van DiOC (alle cellen) te vergelijken met PI (dode cellen), zoals weergegeven in vergelijking 1, met behulp van z-stack-afbeeldingen van een confocale microscoop of een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
      figure-protocol-1 Eq. 1.

5. Fixatie, kleuring, opruiming en beeldvorming van ingekapselde sferoïden

  1. Fixatie en kleuring
    1. Zuig de media op uit de putten waar de hydrogels worden gekweekt en spoel de hydrogels door 500 μL 1x PBS rechtstreeks op de hydrogels te pipetteren. Zuig de 1x PBS voorzichtig op.
    2. Fixeer de sferoïden in de plaat met 24 putjes met behulp van een pipet van 1000 μl om 500 μl volume fixeeroplossing per putje toe te voegen. Laat het fixeermiddel de gels 30 minuten weken bij RT. Verwijder de fixeeroplossing met een pipet van 1000 μl en gooi het weg in een daarvoor bestemde afvalcontainer.
    3. Spoel de hydrogels af door 500 μL 1x PBS aan elk putje toe te voegen. Zuig de 1x PBS op met een pipet van 1000 μl en herhaal de PBS-spoeling nog twee keer. Bewaar de putplaat maximaal 1 week in 500 μL 1x PBS per putje bij 4 °C of gebruik het onmiddellijk.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de hydrogels niet in de pipet trekt bij het opzuigen van PBS en fixeeroplossing. Doe dit door de plaat in een hoek van ~45 graden te kantelen, wat zal helpen bij het zien van de hydrogels en het voorkomen van onbedoelde aspiratie.
      LET OP: Formaldehyde is giftig bij inademing en contact. Hanteren met handschoenen in een chemische zuurkast.
    4. Om de cellen te kleuren, incubeert u de met hydrogel ingekapselde sferoïden met primaire antilichamen voor Nestin (200 μg/ml) en SOX2 (200 μg/ml) in een verdunning van 1:200 antilichaam: PBS. Gebruik een pipet van 1000 μL om de 1x PBS uit de putjes op te zuigen. Voeg 50 μL van het verdunde antilichaam toe aan elk putje. Wacht 24 uur om de kleuring te voltooien. Verwijder vervolgens de kleuroplossing met een pipet van 1000 μl en gooi het afval op de juiste manier weg.
    5. Gebruik een pipet van 1000 μL om 500 μL van 1xPBS toe te voegen, wat voldoende is om de hydrogel onder te dompelen. Zuig de PBS op en herhaal dit nog twee keer. Bewaar de gekleurde en ondergedompelde hydrogel in 1x PBS bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken voorafgaand aan de beeldvorming of afbeelding onmiddellijk.
      OPMERKING: Afhankelijk van het antilichaam kunnen kleine optimalisaties nodig zijn om een goede kleuring te garanderen. De concentratie (1:200) en tijd (24 uur) zijn aanzienlijk hoger dan in typische 2D-monolaagcelkweek, omdat 3D-kleuring diffusie door de hydrogel en de sferoïden vereist.
  2. Na het kleuren van de sferoïden, verwijdert u de sferoïde om de transparantie voor beeldvorming te verbeteren door PBS te vervangen door een sequentiële concentratieverhoging van formamide (optioneel).
    1. Aspireer de 1x PBS uit elk putje. Voeg 500 μL 20% (v/v) formamide toe aan elk putje en laat de hydrogel 90 minuten incuberen. Zuig de formamide op met een pipet van 1000 μL en vang het afval op in een afvalcontainer.
    2. Voeg 500 μL 40% (v/v) formamide toe aan het putje. Laat de hydrogel 90 minuten in de oplossing incuberen. Zuig de formamide op en vang het afval op in de afvalcontainer.
    3. Voeg 500 μL 80% v/v-formamide toe aan elk putje en incubeer gedurende 90 minuten. Zuig de formamide op en gooi het in de afvalcontainer. Voeg 500 μL 100% (v/v) formamide toe en laat 24 uur incuberen voordat de beeldvorming plaatsvindt. Wanneer het opruimen is voltooid, moet u formamideafval op de juiste manier afvoeren via de juiste diensten van een laboratoriumafvalbeheersysteem.
      OPMERKING: Clearing maakt confocale beeldvorming in de kern van het sferoïde mogelijk en is optioneel als alleen de periferie van het sferoïde wordt onderzocht.
  3. Beeldvorming van hydrogel-ingekapselde sferoïden met behulp van confocale microscopie.
    OPMERKING: Elke microscoop - omgekeerd, fluorescerend of confocaal - kan worden gebruikt voor celbeeldvorming; Confoon maakt het echter mogelijk om afzonderlijke vlakken te isoleren.
    1. Plaats de hydrogels in kamerputjes met glazen dekglaasjes en plaats de sferoïden zo dicht mogelijk bij het dekglaasje.
      NOTITIE: Glazen dekglaasjes of kamerputten met glazen dekglaasjes kunnen worden gebruikt. Het is van cruciaal belang om hydrogels gehydrateerd te houden, omdat gedehydrateerde monsters zullen resulteren in een slechte beeldkwaliteit.
    2. Beeldt de monsters af met een objectief met een lange werkafstand (10x-20x) om beeldvorming diep in het sferoïde mogelijk te maken met behulp van Z-stacks voor 3D-reconstructies.
      OPMERKING: Objectieven met een hogere vergroting maken een gedetailleerdere beeldvorming en optische doorsnede mogelijk, maar offeren de beelddiepte op.
    3. Kwantificeer de hoeveelheid signaal die aanwezig is in de optische doorsnede ten opzichte van de totale oppervlakte van de sferoïde voor zowel het gewiste als het niet-geclearde signaal met behulp van vergelijking 2.
      figure-protocol-2 Eq. 2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Op sferoïden gebaseerde platforms voor het screenen van geneesmiddelen om chemotherapeutische effecten te bestuderen, zijn steeds meer gewild vanwege de nadruk op het moduleren van de micro-omgeving van de tumor bij sferoïde inkapseling in biomaterialen die natief weefsel repliceren. Hier ontwikkelden we een methode voor meercellige tumorsferoïde voorbereiding en daaropvolgende inkapseling en beeldvorming in een 3D-hydrogel. De sferoïden worden bereid in microtitermallen (figuur 3A,B), wat r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Op hydrogel gebaseerde meercellige tumorsferoïde modellen worden in toenemende mate ontwikkeld om therapeutische ontdekkingen op het gebied van kanker te bevorderen 11,13,29. Ze zijn gunstig omdat ze de belangrijkste parameters van de micro-omgeving van de tumor op een gecontroleerde manier nabootsen en, ondanks hun complexiteit, eenvoudiger en goedkoper te gebruiken zijn dan in vivo modellen, en vele zijn compatibel met high-th...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door startfondsen die door de Saint Louis University aan Dr. Silviya P Zustiak werden verstrekt, evenals door een startsubsidie van het Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience aan de Saint Louis University, toegekend aan Dr. Silviya P Zustiak.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
70% EthanolFisher Scientific LC22210-4
15 mL ConicalsFALCON352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment platesFisher Scientific07-200-602
35 mm Petri DishAmazon706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL ConicalsFisher Scinetific3181345107
6-well AggreWell 400 StemCell Technologies, Vancouver, Canada34421Vierzijdig piramidale microputjes 
anti-adherence rinsing solutionStemCell Technologies, Vancouver, CanadaCat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptideGenic Bio, Shanghai, Chinan/aAangepaste synthese
Chemical Fume HoodKEWAUNEE99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free Corning356234Basale membraanmatrix
Detergent - Triton-XSigma AldrichT8787Niet-ionogene oppervlakteactieve stof
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Fisher Scinetific1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30073-03
Formaldehyde 37% SolutionSigma AldrichF1635
Glass PlatesSlumpysGBS4100SFSL
Glass Transfer PipettesFisher Scinetific5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptideGenic Bio, Shanghai, Chinan/aAangepaste synthese
HemacytometerBright-Line383684
Hydrophobic solution - Repel Silane GE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
IncubatorNUAIRENU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)Zeiss663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)Fisher Scientific D1125
Leica Confocal SP8Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)Zeiss3820005619
Micro centrifuge tubesFisher Scientific2 mL: 02681258
Microscope SoftwareZeissAxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594 Santa Cruz Biotechnologysc-23927
ParafilmPARAFILM PM992
PBS (1x), pH 7.4HyCloneSH30256.01
Penicillin StreptomycinMP Biomedicals1670046
Pipette AidDrummond Scientific Co.P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)Fisher Scinetific2707509
Plastic Standard Disposable Transfer PipettesFisher Scientific13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)Amazon mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)Laysan BioSH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]Elsworth Adhesives3097358-1004Polydimethylsiloxaan
Powder Free Examination GlovesQuest92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln. Fisher Scientific AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)HyCloneSH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cmGrace Bio-LabsJTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnologysc-365823
Tissue Culture HoodNUAIRENU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC) Sigma Aldrich90279
U-87 MG human glioblastoma cellsAmerican Type Culture Collection HTB-14

Referenties

  1. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  2. Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417(2018).
  3. Li, Y., Kumacheva, E. Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening. Science Advances. 4 (4), eaas8998(2018).
  4. Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids. Polymers. 12 (11), 2506(2020).
  5. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  6. Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).
  7. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).
  8. Pedron, S., et al. Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens. Biomaterials. 219, 119371(2019).
  9. Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids. Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).
  10. Chen, J. -W. E., et al. Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346(2020).
  11. Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling. Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980(2018).
  12. Shin, S., et al. Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation. RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).
  13. Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
  14. Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture. Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).
  15. Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells. PLoS One. 14 (1), e0211078(2019).
  16. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665(2013).
  17. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).
  18. Zhao, L., et al. A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery. Scientific Reports. 9 (1), 19717(2019).
  19. Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).
  20. Gencoglu, M. F., et al. Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).
  21. Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. Mechanical properties of brain tissue based on microstructure. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924(2021).
  22. Alifieris, C., Trafalis, D. T. Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment. Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).
  23. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  24. Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).
  25. Kroger, S. M., et al. Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation. Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085(2020).
  26. Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration. Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).
  27. Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels. Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).
  28. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  29. Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics. MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).
  30. Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).
  31. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).
  32. Lee, K. -H., Kim, T. -H. Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening. Biosensors. 11 (11), 445(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Tumorsfero denPEG hydrogelensfero de inkapselingglioblastoommodelmicrowell mallenconfocale microscopiehydrogelkleuringbeoordeling van celviabiliteitstamcelmarkers
Fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.