Het huidige protocol beschrijft een methode van RNA-fluorescentie in situ hybridisatie om de lncRNA's te lokaliseren in menselijke osteosarcoomcellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
RNA-fluorescentie in situ hybridisatie voor lange niet-coderende RNA-lokalisatie in menselijke osteosarcoomcellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De belangrijke rol van lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) bij kanker is bestudeerd, zoals het reguleren van de proliferatie, epitheliale-mesenchymale overgang (EMT), migratie, infiltratie en autofagie van kankercellen. Lokalisatiedetectie van lncRNA's in cellen kan inzicht geven in hun functies. Door het ontwerpen van de lncRNA-specifieke antisense-ketensequentie gevolgd door labeling met fluorescerende kleurstoffen, kan RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) worden toegepast om de cellulaire lokalisatie van lncRNA's te detecteren. Samen met de ontwikkeling van microscopie maken de RNA FISH-technieken het nu zelfs mogelijk om de slecht tot expressie gebrachte lncRNA's te visualiseren. Deze methode kan niet alleen de lokalisatie van lncRNA's alleen detecteren, maar ook de colokalisatie van andere RNA's, DNA of eiwitten detecteren door gebruik te maken van tweekleurige of meerkleurige immunofluorescentie. Hier hebben we de gedetailleerde experimentele werkingsprocedure en voorzorgsmaatregelen van RNA FISH opgenomen door lncRNA small nucleolar RNA host gen 6 (SNHG6) in menselijke osteosarcoomcellen (143B) als voorbeeld te gebruiken, om een referentie te bieden voor onderzoekers die RNA FISH-experimenten willen uitvoeren, met name lncRNA FISH.
Inleiding
Ons begrip van het menselijk genoom is sterk uitgebreid door recente ontwikkelingen in de technologie van het hele genoom. Ongeveer 93% van het menselijk genoom kan worden getranscribeerd in RNA's, maar slechts 2% van de RNA's kan worden vertaald in eiwitten; de overige 98% van de RNA's die geen eiwittranslatiefunctie hebben, worden niet-coderend RNA (ncRNA) genoemd1. Als klasse van niet-coderende RNA's (ncRNA's) hebben lange ncRNA's (lncRNA's), die meer dan 200 nucleotiden bevatten, steeds meer aandacht getrokken vanwege hun betrokkenheid bij vele fysiologische en pathologische processen van de cellen, zoals differentia....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt. Figuur 1 toont het algemene protocol voor RNA FISH; Tabel 1 bevat de samenstelling van alle oplossingen en tabel 2 bevat de primersequenties die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorbereiding van de sonde
- Identificeer en verkrijg de FASTA-sequentie van een doel-lncRNA van belang, bijvoorbeeld van GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Ontwerp volgens de aanwijzingen op de website de ISH-sondes on....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Representatieve beelden van SNHG6 FISH in menselijke osteosarcoomcellen worden getoond (Figuur 2). De negatieve controle wordt behandeld met de negatieve Ctrl-sonde; positieve controle wordt behandeld met U6-sonde 20. SNHG6-sonde en U6-sonde zijn gelabeld met Cy3, dat rode fluorescentie uitzendt. DAPI is een kleurstof die het DNA kleurt, dat blauwe fluorescentie afgeeft. Dit resultaat toont aan dat SNHG6 voornamelijk gelokaliseerd is in het cytoplasma, en deze informa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit RNA FISH-protocol kan niet alleen de lokalisatie van lncRNA's in cellen detecteren, maar ook de colokalisatie van andere RNA's, DNA of eiwitten in cellen, die ook kunnen worden gebruikt om de locatie van lncRNA's in in paraffine ingebedde weefsels te detecteren. Het specifieke protocol in dergelijke gevallen is echter anders omdat de in paraffine ingebedde weefsels van was moeten worden ontdaan21. Deze experimentele procedure kan worden toegepast in platen met 48 of 96 putjes, maar platen met .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van (1) het National Key R&D-programma van China (2020YFE0201600); (2) de National Nature Science Foundation (81973877 en 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Onderzoeksprojecten binnen het budget van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).
....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Automatische celteller | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Tellen van cellen |
| Celcultuurplaat-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513, corning | Plaats de dekglasjes in de plaat |
| Cellijn (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoom kankercellijn |
| Centrifugebuis (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifugeer de cellen |
| Dekglasjes | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | De cellen worden op de dekglasjes gezaaid |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detecteer SNHG6 locatie |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Celcultuurmedium |
| Drogeruimte incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubatie bij verschillende hoge temperaturen |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | uitdroging |
| Fluorescentiemicroscoop | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 uitgerust met een camera van Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719), olympus | Observatie en positionering |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | De monsters werden geïncubeerd bij 37 °C. |
| Montagemedium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Bevestig de dekglasjes aan de plaat |
| Schakelaar | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Wasmonster |
| Glijmiddel | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | De dekglasjes worden op het glijmiddel geplaatst |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Doorlaatbare membraan en kernmembraan |
| Trypsine (0,25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | Trypsine behandeling van cellen |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
Referenties
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular B....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
