Methodenartikel

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie voor lange niet-coderende RNA-lokalisatie in menselijke osteosarcoomcellen

DOI:

10.3791/65545

⸱

16 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een methode van RNA-fluorescentie in situ hybridisatie om de lncRNA's te lokaliseren in menselijke osteosarcoomcellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De belangrijke rol van lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) bij kanker is bestudeerd, zoals het reguleren van de proliferatie, epitheliale-mesenchymale overgang (EMT), migratie, infiltratie en autofagie van kankercellen. Lokalisatiedetectie van lncRNA's in cellen kan inzicht geven in hun functies. Door het ontwerpen van de lncRNA-specifieke antisense-ketensequentie gevolgd door labeling met fluorescerende kleurstoffen, kan RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) worden toegepast om de cellulaire lokalisatie van lncRNA's te detecteren. Samen met de ontwikkeling van microscopie maken de RNA FISH-technieken het nu zelfs mogelijk om de slecht tot expressie gebrachte lncRNA's te visualiseren. Deze methode kan niet alleen de lokalisatie van lncRNA's alleen detecteren, maar ook de colokalisatie van andere RNA's, DNA of eiwitten detecteren door gebruik te maken van tweekleurige of meerkleurige immunofluorescentie. Hier hebben we de gedetailleerde experimentele werkingsprocedure en voorzorgsmaatregelen van RNA FISH opgenomen door lncRNA small nucleolar RNA host gen 6 (SNHG6) in menselijke osteosarcoomcellen (143B) als voorbeeld te gebruiken, om een referentie te bieden voor onderzoekers die RNA FISH-experimenten willen uitvoeren, met name lncRNA FISH.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ons begrip van het menselijk genoom is sterk uitgebreid door recente ontwikkelingen in de technologie van het hele genoom. Ongeveer 93% van het menselijk genoom kan worden getranscribeerd in RNA's, maar slechts 2% van de RNA's kan worden vertaald in eiwitten; de overige 98% van de RNA's die geen eiwittranslatiefunctie hebben, worden niet-coderend RNA (ncRNA) genoemd1. Als klasse van niet-coderende RNA's (ncRNA's) hebben lange ncRNA's (lncRNA's), die meer dan 200 nucleotiden bevatten, steeds meer aandacht getrokken vanwege hun betrokkenheid bij vele fysiologische en pathologische processen van de cellen, zoals differentiatie, cycluscontrole, apoptose, migratie en invasie 3,4,5. LncRNA's spelen hun rol via verschillende mechanismen, zoals het reguleren van de chromatinestructuur en nucleaire genexpressie, het beheersen van het mRNA-splitsingsproces en posttranscriptionele modificatie6. LncRNA's reguleren het optreden, de ontwikkeling en de metastase van maligniteiten op zowel transcriptioneel als posttranscriptioneel niveau. Transcriptionele regulatie wordt gerealiseerd in de kern door RNA-transcriptie te beïnvloeden via binding aan de chromosomale structuren, terwijl posttranscriptionele regulatie wordt gerealiseerd in het cytoplasma door de doelgenen te controleren via een endogene competitieve RNA (ceRNA) -mechanisme 5,7,8. CeRNA heeft een nieuw mechanisme van RNA-interactie onthuld, namelijk dat lncRNA's kunnen fungeren als een spons om miRNA's te adsorberen en de miRNA-gemedieerde afbraak van verwante doelgenen teremmen. Daarom is de informatie over de subcellulaire lokalisatie van lncRNA's, of een specifiek lncRNA zich nu in het cytoplasma of de kern bevindt, belangrijk om hun biologische functies te helpen identificeren.

Op dit moment wordt lncRNA-lokalisatie voornamelijk gedetecteerd door twee methoden, de ene is door middel van een nucleus/cytoplasmafractie-isolatietest en de andere is door RNA FISH. In het eerste geval worden RNA's in respectievelijk de cytoplasmatische en de nucleaire fracties geëxtraheerd, en vervolgens wordt PCR-amplificatie uitgevoerd met specifieke lncRNA-primers om de verhouding van lncRNA's in het cytoplasma en de kern te detecteren. Het voordeel van deze methode is tijdsefficiëntie, terwijl het nadeel is dat de werkelijke lncRNA-lokalisatie niet direct wordt weerspiegeld door het relatieve aandeel lncRNA's in het cytoplasma en de kern. RNA FISH kan lncRNA-lokalisatie in cellen detecteren door het ontwerp van lncRNA-specifieke antisense-ketensequenties, gevolgd door labeling met fluorescerende kleurstoffen10. De RNA FISH-methoden zijn verbeterd met vooruitgang in sondetechnieken en detectiemethoden, waaronder fluorofoor-gelabelde meervoudige oligo-sondesets11, LNA-sondes12 en vertakte DNA-sondes (bDNA)13. RNA FISH kan niet alleen de lokalisatie van lncRNA detecteren, maar ook de colokalisatie van andere RNA's, DNA of eiwitten detecteren door gebruik te maken van tweekleurige of meerkleurige immunofluorescentie14.

In dit werk hebben we het gedetailleerde intracellulaire lokalisatiedetectieprotocol van lncRNA klein nucleolair RNA-gastheergen 6 (SNHG6) in osteosarcoomcellen (143B) door RNA FISH als voorbeeld opgenomen. SNHG6 is een 600-730 nucleotide lncRNA in zijn volwassen gesplitste vorm en geïdentificeerd als een nieuw oncogen bij diverse menselijke kankers, waaronder colorectale kanker, maagkanker, ovariumcarcinoom, osteosarcoom en hepatocellulair carcinoom15,16,17,18. Studies hebben de betrokkenheid van SNHG6 bij biologisch gedrag van kankercellen bevestigd, zoals proliferatie, EMT en autofagie, en hebben de cytoplasmatische lokalisatie van SNHG6 aangetoond waar het de doelgenen kan beïnvloeden door de miRNA's te binden (sponsen)15,16,17. Dit gedetailleerde detectieprotocol van SNHG6 intracellulaire lokalisatie door RNA FISH wordt hierin gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt. Figuur 1 toont het algemene protocol voor RNA FISH; Tabel 1 bevat de samenstelling van alle oplossingen en tabel 2 bevat de primersequenties die in dit protocol worden gebruikt.

1. Voorbereiding van de sonde

  1. Identificeer en verkrijg de FASTA-sequentie van een doel-lncRNA van belang, bijvoorbeeld van GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Ontwerp volgens de aanwijzingen op de website de ISH-sondes online19 en bekijk de suggesties van het ontwerpalgoritme om de sondes op te sommen die met het Cy3-label moeten worden besteld.
  2. Incubeer de hybridisatiebuffer bij 37 °C gedurende 2 uur van tevoren.
  3. Los 4 sondes met optische dichtheid (OD) op in 160 μl met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld ddH2O in een concentratie van 1 mg/ml uit de buurt van licht.
    OPMERKING: Optische dichtheid (OD) vertegenwoordigt de meeteenheid van DNA en RNA. Gewoonlijk is 1 OD-eenheid = 33 μg/ml DNA.
  4. Bereid 200 μl van het sondemengsel voor elk putje (1,2 μl-10 μl sonde, 70 μl hybridisatiebuffer, vul het volume aan met DEPC-behandelde ddH2O tot 200 μl) en stel een reeks op van 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12,5 μg/ml en 6 μg/ml.
    OPMERKING: De sondeconcentratie moet vooraf experimenteel worden onderzocht. Een hoge sondeconcentratie zal leiden tot niet-specifieke binding van lncRNA's, terwijl een lage sondeconcentratie zal leiden tot ongevoelige of mislukte detectie van lncRNA's.
  5. Denatureer het sondemengsel bij 73 °C gedurende 5 min.
    NOTITIE: Als de Cy3-gelabelde DNA-sonde dubbelstrengs is, denatureer de sonde dan tot enkelstrengs DNA bij 95 °C gedurende 5 minuten en laat vervolgens snel afkoelen gedurende 2 minuten op ijs.

2. Voorbereiding van de cel

  1. Zaai 50.000 cellen van 143B per putje op steriele glazen dekglaasjes in een celkweekplaat met 12 putjes en incubeer ze gedurende 24 uur (37 °C, 5% CO2) in DMEM.
    OPMERKING: Het specifieke aantal cellen dat hier wordt gezaaid, varieert met de celgrootte, wat geschikt is voor de gezaaide cellen om een samenvloeiing van 50% te bereiken na 24 uur te zijn geïncubeerd. De steriele glazen dekglaasjes zijn rond om geschikt te zijn voor de 12-wells plaat.
  2. Verwijder het medium en was gedurende 2 x 5 min met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    LET OP: Bereid 1x PBS met DEPC-behandelde ddH2O. PBS zonder DEPC-behandeling kan niet worden gebruikt omdat het RNase bevat. Voer alle volgende stappen uit in RNase-vrije omstandigheden.
  3. Verwijder 1x PBS en voeg 200 μL 100% ethanol toe in elk putje om gedurende 15 minuten op kamertemperatuur te fixeren.
  4. Verwijder de ethanol, voeg 200 μL 0,1% Triton X-100 (in 1x PBS) toe aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De tijd moet strikt worden gecontroleerd met Triton X-100 permeabilisatie en mag niet te lang zijn.
  5. Verwijder 0,1% Triton X-100 en was 2 x 5 min met 1x PBS.
    OPMERKING: Als het protocol hier moet worden gepauzeerd, vervang dan de PBS door 70% ethanol (verdunning van 100% ethanol met RNasevrije ddH2O) en bewaar het monster maximaal 3 maanden bij 4 °C.
  6. Verwijder 1x PBS, voeg 200 μL 2x natriumzoutcitraat (SSC)-buffer (verdunning van 20x SSC met RNase-vrij ddH2O) toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  7. Verwijder 2x SSC-buffer, voeg 200 μL 70% ethanol toe aan elk putje en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Gooi de 70% ethanol weg, voeg 200 μL 85% ethanol (verdunning van 100% ethanol met RNase-vrij ddH2O) toe aan elk putje en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Gooi de 85% ethanol weg, voeg 200 μL 100% ethanol toe aan elk putje en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Absorbeer en gooi 100% ethanol weg; Laat de putjes drogen.

3. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

  1. Voeg 200 μL sondemengsel (gedenatureerd zoals in stap 1.5) toe aan elk putje en incubeer bij 37 °C gedurende de nacht (16-18 uur).
    OPMERKING: Er is een sterke positieve correlatie tussen hybridisatietemperatuur en sondeconcentratie; Om de achtergrond te optimaliseren, moeten daarom zowel de hybridisatietemperatuur als de sondeconcentratie worden verlaagd.
  2. Neem de volgende dag monsters van 37 °C en gooi het sondemengsel weg. Voeg 200 μL 0,4x SSC/0,3% Tween-20 buffer toe aan elk putje (voorverwarmd op 65 °C) en was gedurende 2 minuten op kamertemperatuur.
  3. Verwijder de 0.4x SSC/0.3% Tween-20-buffer, voeg 200 μL 2x SSC/0.1% Tween-20-buffer toe aan elk putje en was gedurende 2 minuten op kamertemperatuur.
  4. Verwijder 2x SSC/0,1% Tween-20-buffer, voeg 200 μL 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-kleuringsoplossing (1 μg/ml) toe en kleuring gedurende 20 minuten uit de buurt van licht.
  5. Gooi de DAPI-kleurstofoplossing weg en was met 1x PBS gedurende 2 minuten op kamertemperatuur.
  6. Voeg 50 μL montagemedium met gom toe aan het objectglaasje en plaats het glazen dekglaasje op het objectglaasje om het te bevestigen.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat u het dekglaasje met de celzijde naar beneden op het glaasje plaatst.
  7. Observeer onder een fluorescentiemicroscoop.
    NOTITIE: Gebruik een fluorescentiemicroscoop of een confocale lasermicroscoop; Dit laatste zorgt voor een hogere gevoeligheid en helderheid beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve beelden van SNHG6 FISH in menselijke osteosarcoomcellen worden getoond (Figuur 2). De negatieve controle wordt behandeld met de negatieve Ctrl-sonde; positieve controle wordt behandeld met U6-sonde 20. SNHG6-sonde en U6-sonde zijn gelabeld met Cy3, dat rode fluorescentie uitzendt. DAPI is een kleurstof die het DNA kleurt, dat blauwe fluorescentie afgeeft. Dit resultaat toont aan dat SNHG6 voornamelijk gelokaliseerd is in het cytoplasma, en deze informa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit RNA FISH-protocol kan niet alleen de lokalisatie van lncRNA's in cellen detecteren, maar ook de colokalisatie van andere RNA's, DNA of eiwitten in cellen, die ook kunnen worden gebruikt om de locatie van lncRNA's in in paraffine ingebedde weefsels te detecteren. Het specifieke protocol in dergelijke gevallen is echter anders omdat de in paraffine ingebedde weefsels van was moeten worden ontdaan21. Deze experimentele procedure kan worden toegepast in platen met 48 of 96 putjes, maar platen met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van (1) het National Key R&D-programma van China (2020YFE0201600); (2) de National Nature Science Foundation (81973877 en 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Onderzoeksprojecten binnen het budget van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).

    

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Automatische celtellerShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Tellen van cellen
Celcultuurplaat-12Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd3513, corningPlaats de dekglasjes in de plaat
 Cellijn (143B)Cell Bank of Chinese Academy of SciencesCRL-8303osteosarcoom kankercellijn
Centrifugebuis (15 mL, 50 mL)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 430790, CorningCentrifugeer de cellen
DekglasjesShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltdabs7026De cellen worden op de dekglasjes gezaaid
Cy3 label-SNHG6 DNA probeShanghai GenePharma Co.,LtdA10005Detecteer SNHG6 locatie
DMEM mediaShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Celcultuurmedium
Drogeruimte incubatorHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.DKT200-2 Incubatie bij verschillende hoge temperaturen
Ethanol 100% Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218uitdroging
FluorescentiemicroscoopShanghai Waihai Biotechnology Co., LTDOlympus BX43 uitgerust met een camera van Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719), olympusObservatie en positionering
IncubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDDHP-9051De monsters werden geïncubeerd bij 37 °C.
MontagemediumSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E675004Bevestig de dekglasjes aan de plaat
SchakelaarHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.TS-8SWasmonster
GlijmiddelShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd188105De dekglasjes worden op het glijmiddel geplaatst
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600198Doorlaatbare membraan en kernmembraan
 Trypsine (0,25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, GibcoTrypsine behandeling van cellen
Tween-20Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600560detergent
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
  3. Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
  4. Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
  5. Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
  6. Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
  7. Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
  8. Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
  9. Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
  10. Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
  11. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  12. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
  13. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  14. Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261(2022).
  15. Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3(2019).
  16. Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
  17. Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82(2019).
  18. Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
  19. Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
  20. Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
  21. Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853(2018).
  22. Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA FISHlang niet coderend RNAlncRNA lokalisatieSNHG6 detectiefluorescentiehybridisatiecytoplasmatische lokalisatieDAPI kleuringprobe labelingcelkweek

Gerelateerde artikelen