Methodenartikel

Snelle in-vitrocytotoxiciteitsevaluatie van Jurkat die chimere antigeenreceptor tot expressie brengt met behulp van fluorescerende beeldvorming

DOI:

10.3791/65560

⸱

27 oktober 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, 2Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, 3BioEngineering Program, University of Kansas, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, 5University of Kansas Cancer Center, 6Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een protocol om kwantitatieve tumorceldoding te evalueren door Jurkat-cellen die chimere antigeenreceptor (CAR) tot expressie brengen die gericht zijn op een enkel tumorantigeen. Dit protocol kan worden gebruikt als een screeningsplatform voor snelle optimalisatie van CAR-scharnierconstructies voorafgaand aan bevestiging in perifere bloed-afgeleide T-cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen lopen voorop in de oncologie. Een CAR is opgebouwd uit een targetingdomein (meestal een variabel fragment met één keten, scFv), met een bijbehorende intra-chain linker, gevolgd door een scharnier-, transmembraan- en costimulatoirdomein. Modificatie van het intra-chain linker- en scharnierdomein kan een significant effect hebben op CAR-gemedieerde doding. Gezien de vele verschillende opties voor elk onderdeel van een CAR-constructie, zijn er grote aantallen permutaties. Het maken van CAR-T-cellen is een tijdrovend en duur proces, en het maken en testen van veel constructies is een zware investering in tijd en materiaal. Dit protocol beschrijft een platform om snel scharnier-geoptimaliseerde CAR-constructies in Jurkat-cellen (CAR-J) te evalueren. Jurkat-cellen zijn een onsterfelijke T-cellijn met een hoge lentivirusopname, waardoor efficiënte CAR-transductie mogelijk is. Hier presenteren we een platform om CAR-J snel te evalueren met behulp van een fluorescerende imager, gevolgd door bevestiging van cytolyse in PBMC-afgeleide T-cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR-T-celtherapie is veelbelovend gebleken bij hematologische maligniteiten, zoals blijkt uit de 6 door de FDA goedgekeurde CAR-T-producten sinds 2017, zoals gerapporteerd door het National Cancer Institute1. Er zijn talloze CAR-T-cellen in klinische onderzoeken voor het aanpakken van solide tumoren. Het ontwikkelen van nieuwe CAR-doelen en het optimaliseren van het CAR-construct is van vitaal belang voor de werkzaamheid van een CAR-T-cel. Het kiezen van de ideale CAR-constructie voor elke toepassing is essentieel voor het nauwkeurig richten van tumorgeassocieerde antigenen (TAA) en het vermijden van lage niveaus van TAA-expressie in normale weefsels.

Een CAR-construct bestaat voornamelijk uit vijf compartimenten: (1) extracellulair enkelvoudig variabel fragment (scFv)-domein gericht op tumorantigeen; (2) scharnier domein; (3) transmembraan domein; (4) intracellulair cytoplasmatisch T-cel costimulatoir domein; en (5) signaleringsdomein. Het wijzigen van elk van deze domeinen beïnvloedt de precisie van de CAR-T-cel die in contact komt met zijn doelcel3. Daarom is het van cruciaal belang om de cytotoxiciteit en kruisreactiviteit van deze CAR-constructen in vitro te evalueren om het juiste construct te kiezen om door te gaan naar in vivo experimenten. De huidige methoden voor het evalueren van cytolyse door T-cellen omvatten 51Cr-afgiftetest, lactaatdehydrogenase-afgiftetest, bioluminescente beeldvormingstest, real-time impedantie-gebaseerde celanalyse en celgebaseerde flowcytometrie-assay 4,5. Het fluorescerende beeldvormingsplatform dat hier wordt beschreven, identificeert het aantal levende versus dode cellen, wat een directe kwantificering is van de cytolyse van T-cellen, in tegenstelling tot een indirecte methode om de cytolyse door T-cellen te evalueren.

Hier is een eenvoudige, kostenefficiënte, snelle en hoge doorvoertechniek met minimale interventie om de cytotoxiciteit te evalueren van Jurkat-cellen die epidermale groeifactorreceptor (EGFR) CAR tot expressie brengen tegen MDA-MB-231 triple-negatieve borstkankercellen (TNBC) en EGFR CRISPR knock-out MDA-MB-231-cellen. Jurkat-cellen zijn onsterfelijke menselijke T-lymfocytcellen6 die op grote schaal zijn gebruikt voor het bestuderen van T-celactiverings- en signaleringsmechanismen7. Bovendien zijn Jurkat-cellen gebruikt voor in vitro CAR-testen in meerdere onderzoeken 8,9,10,11. Jurkat-cellen worden gemakkelijk getransduceerd door lentivirus en hebben aanhoudende proliferatie, en dit systeem werd gebruikt om het scharnierdomein van verschillende EGFR CAR-constructies te optimaliseren.

Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van meerdere CAR-constructen gericht op verschillende tumorantigenen en kan worden gebruikt tegen meerdere aanhangende tumorcellijnen en in verschillende effector-tot-tumor (E:T)-verhoudingen. Bovendien kunnen meerdere tijdstippen worden geëvalueerd en kan het aantal replicaten worden aangepast om de beste moord onder de verschillende CAR-constructies te identificeren. De beste constructen moeten worden bevestigd met behulp van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) die afkomstig zijn van CD3 T-cellen. Het algemene doel achter de ontwikkeling van deze methode is om de CAR-scharniergeometrie snel te optimaliseren op een manier met een hoge doorvoer, waarbij barrières zoals een lage transductie-efficiëntie worden overwonnen, gevolgd door bevestiging in PBMC-afgeleide T-cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Al het celkweekwerk wordt gedaan in een bioveiligheidskast met een laboratoriumjas, handschoenen en volgens standaard aseptische technieken.

1. Het genereren van CAR die Jurkats uitdrukt (CAR-J)

  1. Koop Jurkat-cellen, kloon E6-1 van ATCC. Ontdooi 1 x 106 cellen in een T-75 kolf en kweek ze in T-75 kolven. Houd ze in suspensie op 0,6 x 106 cellen per ml met behulp van media van het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) aangevuld met 10% FBS in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  2. Plaat 1 x 105 Jurkat-cellen per putje van een weefselkweek behandeld 24 putjes plaat in 500 μL RPMI-groeimedia met 4 μg/ml polybreen, wat de lentivirale efficiëntie verbetert. Tel cellen met behulp van een op laser gebaseerde fluorescerende detectie-tafelcelanalysator. Het aantal putten is afhankelijk van het aantal te evalueren constructies. In dit voorbeeld worden 4 constructen en een niet-getransduceerde besturing gebruikt. Het ontwerp van de CAR-constructie is weergegeven in tabel 1.
  3. Voeg 10 μL lentivirus/putje van elk CAR-construct toe. Het ontwerp van de CAR-constructie en de productie van het lentivirus werd uitgevoerd zoals eerder beschreven12.
  4. Voeg de volgende dag 1 ml groei-RPMI-media toe aan elk putje en ga verder met kweken in de incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  5. Verzamel cellen 2 dagen later (totaal 72 uur na Jurkat-transductie) en tel ze.
  6. Neem 1 x 104 cellen voor het uitvoeren van de stroom om de CAR-expressie op de Jurkat-cellen te bevestigen. Was de cellen in het kort 2x met FACS-kleuroplossing (FSS) voordat u de CAR-J labelt met antilichamen die gericht zijn op de Flag-tag die wordt gebruikt om CAR-positiviteit te detecteren gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C. Was opnieuw 2x met FSS en laat de cellen door een flowcytometer lopen zoals eerder beschreven12. Gebruik de antilichaamconcentratie zoals aanbevolen door de fabrikant.
  7. Jurkat-cellen worden gemakkelijk getransduceerd en vertonen bijna altijd >90% CAR-expressie. Produceer CAR-J lang voor de co-cultuur cytotoxiciteitstest en vries het in voor later gebruik.

2. Plateren van CFSE-gelabelde tumorcellen

OPMERKING: MDA-MB-231 (van ATCC, HTB-26) cellen waren een geschenk van een medewerker en EGFR KO MDA-MB-231 zijn gemaakt zoals eerder beschreven12.

  1. Ontdooi 1 x 106 cellen in een T-75 kolf en kweek ze in T-75 kolven. Behoud MDA-MB-231 tumorcellen en CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 tumorcellen in 14 ml Dulbecco's gemodificeerde eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 en splits wanneer ongeveer 70% confluent.
  2. Observeer aanhangende tumorcellen onder een gewone helderveldmicroscoop om bijna 70% samenvloeiing te garanderen.
  3. Verwijder het groeimedium uit de kolf met behulp van een serologische pipet. Voeg 3 ml trypsine toe aan de T75-kolf en plaats deze gedurende 3-5 minuten in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 om de cellen los te maken van de kolf.
  4. Neutraliseer de trypsine met een gelijke hoeveelheid (3 ml) groeimedia. Vang de celsuspensie op in een centrifugebuis en draai de cellen gedurende 4 minuten rond bij 400 x g om de cellen te pelleteren.
  5. Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet en resuspendeer de cellen in 2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bepaal de celconcentratie met behulp van een celteller.
  6. Breng 8 x 105 cellen over in een andere buis van 15 ml en voeg PBS toe om een volume van 1 ml te bereiken.
  7. Voeg 2 μL carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE; 5 μM voorraadconcentratie) toe aan elk buisje en meng goed met een pipet van 1 ml.
  8. Incubeer de cellen met CFSE gedurende 20 minuten in de incubator bij 37 °C met 5% CO2. Haal de buisjes na 20 minuten uit de incubator en voeg 5 ml groeimedia toe aan het buisje.
  9. Centrifugeer de buisjes gedurende 4 minuten op 400 x g om de cellen met CFSE-label te pelleteren. Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet en voeg 1 ml vers medium toe om de cellen opnieuw te suspenderen.
  10. Herwaardeer de celconcentratie met behulp van een celteller. Breng 4 x 10,5 cellen over in een reagensreservoir van 25 ml en voeg media toe voor een totaal volume van 8 ml.
    1. Om voldoende volume te garanderen om 5000 tumorcellen/putje in 100 μL media te zaaien, moest het volume kunnen worden gepipetteerd met behulp van de meerkanaalspipet, en om het verlies van enkele cellen tijdens stap 1.7 te compenseren, 10%-20% extra cellen en mediavolume voorbereiden.
  11. Meng de celsuspensie grondig met een serologische pipet van 5 ml. Gebruik een meerkanaalspipet van 100 μl om 100 μl van de celsuspensie in elke rij van de doorzichtige zwarte plaat met platte bodem van 96 putjes op de linkerhelft te pipetteren. Een voorbeeld van een beplatingsstrategie is te vinden in tabel 2.
  12. Pipetteer EGFR KO-cellen op dezelfde manier op de rechterhelft van de plaat. Zodra de hele plaat is geplateerd, sleept u de plaat heen en weer en van links naar rechts op het platform van de weefselkweekkap om een uniforme verdeling van de tumorcellen in de putjes te garanderen.
  13. Incubeer de plaat gedurende 4 uur in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 zodat de tumorcellen zich kunnen hechten.

3. Co-culturing van CAR die Jurkats tot expressie brengt met CFSE-gelabelde tumorcellen

  1. Gebruik de tellingen van niet-getransduceerde en CAR-expressieve Jurkat-cellen, breng 4 x 105 cellen van elke CAR-J over in een reservoir van 25 ml. Voeg DMEM-groeimedia toe voor een totaal volume van 2 ml.
  2. Voor E:T van 4:1 werden 2 x 104 CAR-J per putje toegevoegd in 100 μL media met behulp van een meerkanaalspipet voorzichtig langs de zijkant van elk putje om de aangehechte tumorcellen niet te verstoren.
  3. Voeg nog eens 100 μL groeimedia toe met behulp van een meerkanaalspipet aan de zijkant van putjes met tumorcellen en Jurkat-cellen. De tumorgroepen krijgen alleen 200 μL media om het totaal van 300 μL media in alle putjes te maken.
  4. Sleep de plaat langs het platform heen en weer en van links naar rechts om een gelijkmatige verdeling van de Jurkat-cellen op de tumorcellen te garanderen.
  5. Laat co-cultuur in de incubator toe bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur.

4. Voorbereiding van de plaat voor beeldvorming

  1. Maak een oplossing van propidiumjodide (PI) met 1 μg/ml in lage achtergrondfluorescentiemedia op basis van het aantal putjes en elk 100 μL media.
  2. Bereid voor 84 putjes 9 ml media die PI bevatten. Meng het medium grondig met behulp van een pipet.
  3. Maak 10 ml 20% Triton-X-oplossing door Triton-X te verdunnen met gedeïoniseerd water. Gooi na 48 uur cocultuur het supernatans met CAR-J weg door een enkele omkering van de plaat en klop op keukenpapier.
  4. Voeg nu voorzichtig 100 μL van de hierboven voorbereide media (stap 4.2) met PI toe aan elk putje met behulp van een meerkanaalspipet om de aangehechte tumorcellen niet te verstoren.
  5. Voeg 20 μL 20% Triton-X-oplossing toe aan het eerste putje van elk tumortype, dat functioneert als een totale dode controle.
  6. Laat het bord 20 minuten in de broedstoof staan. Breng de plaat in beeld met behulp van de fluorescerende beeldvormingscytometer. Gegevens worden opgeslagen op de computer en kunnen op een later tijdstip worden geanalyseerd.

5. Fluorescerende beelden analyseren

  1. Gebruik een van de tumoren alleen goed van cellen om het groene fluorescerende kanaal in te stellen.
  2. Verlaag het putmasker tot 98% om de cellen aan de rand van de put te verwijderen, aangezien het signaal aan de rand niet perfect is.
  3. Identificeer CFSE-gelabelde tumorcellen op het groene, fluorescerende CFSE-kanaal. Wijzig de drempelwaarde van de fluorescentie-intensiteit om alle cellen op de put op te pikken.
  4. Stel de minimale celdiameter in op 25 μm om vuil te verwijderen dat op het CFSE-kanaal is gedetecteerd. Dit varieert afhankelijk van het celtype dat wordt geanalyseerd.
  5. Schakel afzonderlijke aanraakobjecten in om individuele cellen te identificeren wanneer ze met elkaar in contact staan.
  6. Selecteer CFSE op de afbeeldingsweergave en kijk naar de grafische overlay om erachter te komen wat er door het systeem wordt gekozen.
  7. Zodra CFSE-gelabelde cellen op de juiste manier worden opgepikt, stelt u poorten in om de populatie levende versus dode cellen te definiëren.
  8. Door de CFSE-gelabelde cellen te selecteren, genereert u een histogram van tellingen op de y-as versus de gemiddelde PI-intensiteit op de x-as.
  9. Op basis van het putje waar we Triton-X hebben toegevoegd (stap 4.5), teken je een splitter om onderscheid te maken tussen cellen met een lage PI-kleuring en cellen met een hoge PI-kleuring. Deze put zou de meeste cellen in een hoog PI-gekleurd gebied moeten hebben.
    OPMERKING: PI toont basaal signaal op levende cellen. Daarom doodt het toevoegen van Triton-X alle cellen en kleuren ze helder in het rode fluorescerende kanaal. Dit vergemakkelijkt het tekenen van poorten om dode cellen van levende cellen te scheiden.
  10. Pas de waarde van de x-as aan om de cellen beter te kunnen bekijken. Label nu de lage PI-gekleurde cellen als levende cellen.
  11. Als u de levende cellen selecteert, stelt u een ander histogram in met een gebied op de x-as en tellingen op de y-as.
  12. Teken een andere splitter met behulp van de tumor alleen goed om cellen te vangen en geen puin. Met Jurkat behandelde putten zullen puin gaan ophopen dat CFSE-gekleurd zal zijn en uit de tellingen moet worden verwijderd. De resterende niet-puin worden gelabeld als "Big cells".
  13. Voer de analyse uit op de hele plaat en exporteer de spreadsheet met de cijfers.
  14. Zet de grote tellingen uit om het aantal levende CFSE-gelabelde tumorcellen te identificeren dat in de put achterblijft na blootstelling aan CAR-J. Bepaal statistieken met behulp van eenrichtings-ANOVA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een bereik van E:T-verhouding tussen 1:8 en 8:1 voor CAR-J1 werd geëvalueerd na 72 uur, gericht op EGFR op TNBC MDA-MB-231-cellen. Jurkat-cellen werden getransduceerd met CAR-lentivirus met polybreen om CAR-J-cellen te genereren zoals beschreven in stap 2. De cytotoxiciteit van CAR-J1 nam significant toe met een hogere E:T-verhouding zonder verschil in doding bij een verhouding van 1:8 (Figuur 1). Meer dan 50% doden werd waargenomen bij 4:1 E:T gedurende 72 uur. Deze E:T werd gebruikt voor l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we een snelle methode voorgesteld om de doelspecifieke cytolytische activiteit geïnduceerd door CAR-expressie in Jurkat-cellen efficiënt te evalueren. Alle CAR-constructen hebben dezelfde scFv, maar verschillende scharnier- en transmembraandomeinen waarvan is aangetoond dat ze de potentie van CAR-T-cellen beïnvloeden13. Verdere evaluatie van niet-specifieke doding door deze CAR-J werd gedaan door ze te kweken met antigeen knock-out (KO) cellen. Dit toont aan dat het doden tumorantigeen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MDA-MB-231 was een vriendelijk geschenk van Dr. Shane Stecklein. De auteurs erkennen financiering van het University of Kansas Cancer Center om dit onderzoek uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Conical Tube (Steriel)Midwest Scientific#C15BElk soortgelijk product werkt
50 mL Conical Tube (Steriel)Thermo Scientific339652Elk soortgelijk product werkt
Zwarte/heldere 96-wel plateFalcon353219Celligo heeft een lijst van compatibele platen
Celigo 4 kanaals Imaging CytometerNexcelcom Bioscience200-BFFL-5CElk soortgelijk product werkt
Celigo SoftwareNexcelcom BioscienceVersie 5.3.0.0Elk soortgelijk product werkt
Cel Cultuur IncubatorThermo ScientificHeraCell 160iElk soortgelijk product werkt
Cel Cultuur Behandelde Flessen (T75, verschillende maten, Sterieel)TPP90076Elk soortgelijk product werkt
CFSETonbo13-0850-U500Elk soortgelijk product werkt
Cytek Muse Cell AnalyzerCytek0500-3115Elk soortgelijk product werkt
DMEMGibco11995-040Elk soortgelijk product werkt
FBSGemini bio-products900-108Elk soortgelijk product werkt
Flow CytometerCytek, BD, enzAurora, LSR II, enzElk soortgelijk product werkt
FlowJo SortwareBecton Dickinson & Company Versie 10.7.1Elk soortgelijk product werkt
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01Elk soortgelijk product werkt
GraphPad SoftwareGraphPadVersie 9.3.1 (471)Elk soortgelijk product werkt
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2Elk soortgelijk product werkt
PBSGibco10010-031Elk soortgelijk product werkt
PenStrepGibco15070-063Elk soortgelijk product werkt
Pipette tips (Sterieel, gefilterd, 1 mL, Verschillende maten)Pr1maPR-1250RK-FL, enzElk soortgelijk product werkt
Pipettors Thermo ScientificFinnpipette F2Elk soortgelijk product werkt
Propidium JodideInvitrogenP1304MPElk soortgelijk product werkt
RPMICorning10-041-cvElk soortgelijk product werkt
Serological Pipette AidDrummond Scientific4-000-105Elk soortgelijk product werkt
Serological Pipettes (Sterieel, verschillende maten)Pr1maPR-SERO-25, enzElk soortgelijk product werkt
Sodium PyruvaatCorning25-000-CIElk soortgelijk product werkt
Steriele ReservoirsMidwest ScientificRESE-2000Elk soortgelijk product werkt
Centrifuge voor op tafelEppendorf5810RElk soortgelijk product werkt

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  4. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
  5. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  6. Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
  7. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
  8. Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
  9. Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
  10. Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93(2013).
  11. Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384(2023).
  12. Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
  13. Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
  14. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  15. Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
  16. Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
  17. Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048(2018).
  18. Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
  19. Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
  20. Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
  21. Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CAR T cellenJurkat cellenhigh throughputscreeningEGFR targetingmodificatie van het scharnierdomeinuit PBMC afgeleide T cellen96 wells plaatpropidiumjodide kleuring

Gerelateerde artikelen