Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Profilering van de bacteriële gemeenschap van fermenterende Traminette-druiven tijdens de wijnproductie met behulp van metagenomische amplicon-sequencing

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65598

⸱

1 december 2023

 ,  ,  ,  , 
1A.R. Smith Department of Chemistry and Fermentation Sciences, Appalachian State University, 2Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om amplicon metagenomic te beschrijven voor het bepalen van de bacteriële gemeenschap van Traminette-druiven, fermenterende druiven en uiteindelijke wijn.

Samenvatting

Vooruitgang in sequencingtechnologie en de relatief gemakkelijke toegang tot het gebruik van bio-informatica-instrumenten om microbiële gemeenschapsstructuren te profileren, hebben een beter begrip mogelijk gemaakt van zowel kweekbare als niet-kweekbare microben in druiven en wijn. Tijdens industriële fermentatie zijn microben, bekend en onbekend, vaak verantwoordelijk voor productontwikkeling en bijsmaak. Daarom kan het profileren van de bacteriën van druif tot wijn een gemakkelijk begrip van de in situ microbiële dynamiek mogelijk maken. In deze studie moeten de bacteriën van Traminette-druiven fermentatie ondergaan en werd de uiteindelijke wijn onderworpen aan DNA-extractie die 15 ng/μL tot 87 ng/μL opleverde. Het 16S-amplicon van het hypervariabele gebied van het V4-gebied werd gesequenced, relatief overvloedige bacteriën bestaande uit phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota en gevolgd door de Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota en Acidobacteriota. Een analyse van het Venn-diagram van de gedeelde unieke operationele taxonomische eenheden (OTU) onthulde dat 15 bacteriephyla gemeenschappelijk waren voor zowel druivenmost, gistingsfase als uiteindelijke wijn. Phyla die niet eerder werden gerapporteerd, werden gedetecteerd met behulp van de 16S-ampliconsequencing, evenals geslachten zoals Enterobacteriaceae en Lactobacillaceae. Variatie in het gebruik van organische voedingsstoffen in wijn en de impact ervan op bacteriën werd getest; Traminette R-tank met Fermaid O en Traminette L gestimuleerd met Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Alfa-diversiteit met behulp van de Kruskal-Wallis-test bepaalde de mate van gelijkmatigheid. De bètadiversiteit duidde op een verschuiving in de bacteriën in de fermentatiefase voor de twee behandelingen, en de uiteindelijke wijnbacteriën leken op elkaar. De studie bevestigde dat 16S-ampliconsequencing kan worden gebruikt om bacterieveranderingen tijdens de wijnproductie te volgen om de kwaliteit en een beter gebruik van druivenbacteriën tijdens de wijnproductie te ondersteunen.

Inleiding

Traminette-druif wordt gekenmerkt door productie van superieure wijnkwaliteit, naast een aanzienlijke opbrengst en gedeeltelijke resistentie tegen verschillende schimmelinfecties 1,2,3. De natuurlijke fermentatie van druiven is afhankelijk van bijbehorende micro-organismen, de wijnproductieomgeving en fermentatievaten 4,5. Vaak vertrouwen veel wijnmakerijen op wilde gist en bacteriën voor fermentatie, productie van alcohol, esters, aroma en smaakontwikkeling6.

Het doel van deze studie is om de bacteriële samenstelling van druiven te onderzoeken en hun dynamiek tijdens de fermentatie te volgen. Hoewel het moderne gebruik van starterculturen zoals Saccharomyces cerevisiae voor primaire gisting, waar alcohol wordt geproduceerd, gebruikelijk is voor verschillende wijnstijlen7. Bovendien verbetert de nagisting, waarbij appelzuur door Oenococcus oeni wordt gedecarboxyleerd tot melkzuur, het organoleptische en smaakprofiel van de wijn en vermindert het de zuurgraad van wijn 8,9. Met de recente vooruitgang in het gebruik van cultuuronafhankelijke methoden is het nu mogelijk om verschillende microben te bepalen die verband houden met de wijndruif en de soorten die worden overgebracht naar most en die op verschillende tijdstippen tot aan het eindproduct aan de gisting deelnemen10.

De rol en dynamiek van wilde bacteriën van verschillende druiven die tijdens de wijngisting in de most worden overgebracht, worden slecht begrepen. De taxonomie van veel van deze bacteriën is niet eens bekend, of hun fenotypische eigenschappen zijn niet gekarakteriseerd. Dit maakt hun toepassing in cocultuurfermentatie nog steeds slecht onderbenut. Er is echter gebruik gemaakt van microbiologische kweekanalyse om de bacteriepopulatie te bepalen die verband houdt met druiven en wijn10. Het is algemeen bekend dat selectieve kweekbeplating vervelend is, vatbaar voor contaminatie, een lage reproduceerbaarheid heeft en dat de output twijfelachtig kan zijn; Het mist ook bacteriesoorten waarvan de groeibehoefte onbekend is. Eerdere studies geven aan dat cultuuronafhankelijke, op 16S rRNA-genen gebaseerde methodologieën een betrouwbaardere en kosteneffectievere benadering bieden voor het karakteriseren van complexe microbiële gemeenschappen11. Het sequencen van de hypervariabele regio's van het 16S rRNA-gen is bijvoorbeeld met succes gebruikt om bacteriën in druivenbladeren, bessen en wijn te bestuderen 12,13,14. Studies hebben aangetoond dat het gebruik van 16S rRNA-metabarcoding of volledige metagenomische sequencing geschikt is voor microbioomstudies15. Er is steeds meer informatie beschikbaar over het mogelijke verband tussen bacteriële diversiteit en hun metabolische eigenschappen tijdens de wijnproductie, wat zou kunnen helpen bij het bepalen van de oenologische eigenschappen en het terroir16.

De noodzaak om de voordelen van de metagenomische instrumenten te maximaliseren met behulp van next-generation sequencing (NGS) om de microbiële ecologie van druiven en wijn te bestuderen, is benadrukt16,17. Ook het gebruik van cultuuronafhankelijke methoden op basis van high-throughput sequencing om de microbiële diversiteit van het voedsel- en fermentatie-ecosysteem te profileren, is voor veel laboratoria zeer relevant en waardevol geworden en wordt aanbevolen voor industrieel gebruik18,19. Het biedt een voordeel van detectie en taxonomische profilering van de huidige microbiële populaties en de bijdrage van omgevingsmicroben, hun relatieve abundantie en alfa- en bètadiversiteit20. De sequentiebepaling van het variabele gebied van het 16S-gebied is een belangrijk gen bij uitstek geworden en is gebruikt tijdens verschillende microbiële ecologische studies.

Hoewel veel studies zich richten op schimmels, met name gist, tijdens wijnfermentatie21, rapporteerde deze studie de 16S-ampliconsequencing en bio-informaticatools die worden gebruikt om de bacteriën te bestuderen tijdens de fermentatie van Traminette-druiven voor wijnproductie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Experimentele wijnproductie

  1. Verkrijg Traminnette-druiven van Dynamis Estate-wijn in de wijngaard van Jonesville, North Carolina, ontsteel en plet om most vrij te geven in twee afzonderlijke open fermentoren van 600 liter en laat ze ongeveer 4 dagen op de schil zitten met de deksels erop.
  2. Pons de doppen eenmaal per dag naar beneden om de huid nat te houden en de productie van vluchtige zuren (VA) te beperken.
    OPMERKING: Het idee is dat veel van de aromatische precursoren (monoterpenen) zich in de schillen bevinden en het sap in contact laten komen met de schil om het aromatische potentieel van de wijn te vergroten.
  3. Pitch na 4 dagen Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Deze gist is geselecteerd omdat het een sterke gister is en wordt geassocieerd met het versterken van het raskarakter in de wijn van de druiven.
  4. Voeg in de ene tank, Traminette R, 20 g/hL Fermaid O toe wanneer de brix 17,7 is en 20 g/hL Fermaid O en 12,5 g/hL Fermaid K bij 13,1 g/hL om de gistingszekerheid te bereiken, terwijl de andere tank Traminette L, 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc toevoegt wanneer de brix 17,1 is. Voeg ook 20 g/hL Fermaid O toe wanneer de brix 13,4 is om het raskarakter van de wijn te versterken.
  5. Neem duplicaatmonsters van most (dag 1), toegevoegde gist (dag 4), gefermenteerde most (dag 15) en afgewerkte wijnmonsters (dag 30) en bewaar deze bij -20 °C vóór DNA-extractie en metagenomische analyse.

2. DNA-extractie voor metagenomica

  1. Bewaar alle hierboven verkregen duplicaatmonsters op ijs tot de eerste centrifugatie.
  2. Breng 20 ml van het gefermenteerde monster over in een steriele buis met schroefdop van 50 ml.
  3. Voeg 10 ml koud water toe en homogeniseer (vortex). Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 800 x g bij 4 °C en breng het supernatans over in een nieuw buisje van 50 ml.
    NOTITIE: Bij deze stap worden de vaste stoffen van het monster verwijderd.
  4. Herhaal stap 2.3 twee keer en doe de supernatanten samen in dezelfde buis.
  5. Centrifugeer supernatans bij 3.000 x g bij 4 °C gedurende 20 minuten om de cellen te pelleteren. Gooi de supernatant weg.
  6. Resuspendeer de pellet in 1 ml PBS, breng over naar een buis met schroefdop van 2 ml en centrifugeer gedurende 2 minuten op 14.000 x g . Voer nog twee wasbeurten uit met PBS.
  7. Vries de pellets bij -20°C in bij -20°C of volg stap 2.8. Het is belangrijk dat alle monsters op dezelfde manier worden behandeld.
  8. Voeg 978 μL natriumfosfaatbuffer toe. Bereid natriumfosfaatbuffer voor, voeg 3,1 g NaH2PO4· H2O en 10,9 g Na2HPO4 (watervrij) tot gedistilleerd H2O om een volume van 1 L te maken en de pH aan te passen tot 7,4.
  9. Voeg 122 μL DNA-buffer (DNA-spinkit) en vortex toe.
  10. Laat het 45 min-1 uur in de koelkast (4 °C) staan. Draai de monsters elke 15 minuten vortex. Deze stap kan een nacht (o/n) worden gelaten of totdat u klaar bent om de DNA-spinkit te blijven gebruiken.
  11. Breng 1 ml monster over in een buisje met lysisoplossing 1 (DNA-spinkit) en draai de dop vast (schrijf het monsternummer op de zijkant van het buisje en niet op de dop; de reagentia van de kit verwijderen alles wat op de dop staat).
  12. Homogeniseer het monster driemaal in een parelklopmolen (6,5 m/s, CY: 24 x 2) gedurende 60 s. Als de kralenmolen het apparaat heeft om ijs te doen, doe dan 50 g droogijs onder de buizen. Als dit niet het geval is, bewaar de monsters dan 5 minuten op nat ijs tussen elke homogenisatiestap.
  13. Centrifugeer Lysing Matrix E-buisjes (DNA-spinkit) gedurende 1 minuut bij 16800 x g (of maximale snelheid).
  14. Breng het supernatans over in een schone microbuis. Voeg daarna 250 μL eiwitprecipitatieoplossing (PPS) reagens (DNA-spinkit) toe en meng door de buis 10 keer met de hand te schudden.
  15. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 16800 x g om het neerslag te pelleteren.
  16. Breng het supernatans over in een steriele buis van 15 ml. Voeg 1 ml binding matrix suspensie (DNA spin kit) toe aan de supernatant.
    NOTITIE: Resuspendeer de bindingsmatrixsuspensie voor gebruik totdat deze homogeen is.
  17. Keer de buizen 2 minuten met de hand om en laat de buizen vervolgens 3 minuten in een rek staan (om de silicamatrix te laten bezinken).
  18. Verwijder voorzichtig 1 ml van het supernatant. Resuspendeer de matrix in de resterende supernatant.
  19. Breng 600 μl van het mengsel over in een spinfilterbuis (DNA-spinkit) en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14500 x g.
  20. Voeg het resterende mengsel toe en centrifugeer.
  21. Decanteer de doorstroming en voeg 500 μL wasoplossing (DNA-spinkit) toe aan de centrifugefilterbuis en centrifugeer gedurende 1 minuut op 14500 x g (zorg ervoor dat u EtOH toevoegt aan de wasoplossing; zie het producthandboek). Decanteer de doorstroming en herhaal de was nog twee keer (3 wasbeurten in totaal).
  22. Decanteer de doorstroming en centrifugeer nog eens 2 minuten op 14.500 x g om de matrix van de resterende wasoplossing te drogen.
  23. Verwijder het spinfilter en plaats het in een nieuwe opvangbuis (DNA-spinkit). Laat het centrifugefilter 5 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur (RT).
  24. Verwarm het DNAse-vrije water (DNA spin kit) gedurende 5 minuten op 55 °C. Voeg 50 μL DNAse-vrij water toe en roer de matrix voorzichtig op het filtermembraan met een pipetpunt voor een efficiënte elutie van het DNA. Laat de monsters 1 minuut op RT staan en centrifugeer vervolgens 1 minuut op 14500 x g om DNA te elueren.
  25. Leg de monsters op ijs. Vul het monstermengsel (2 μL monster + 2 μL water + 1 μL laadbuffer) in een gel. Meet de DNA-concentratie.
  26. Bewaar de monsters bij -20 °C.
  27. Gebruik een spectrofotometer om het geëxtraheerde DNA te kwantificeren.
    OPMERKING: Een volume van 1 μL DNA werd gedropt en gekwantificeerd, en de kwaliteit van het DNA werd genoteerd in een A260/A280-verhouding.

3. DNA-elektroforese

  1. Bereid 1% agarosegel in 0,5 Tris/Boraat/EDTA (TBE) buffer (20 ml voor een minigel, 70-100 ml voor een medium gel). Weeg agarose + buffer, kook in de magnetron om agarose te smelten, weeg opnieuw en voeg dH2O toe aan het oorspronkelijke gewicht. Koel de agarose-oplossing af tot 55-60 °C en giet in de gelvormer met kam. Laat de gel stollen.
  2. Voeg 1 μL 10x gellaadbuffer toe aan het monster (10 μL) en laad op de gel naast een molecuulgewichtmarker. Loop van negatief (zwart) naar positief (rood) bij 100-115 V (grote gel) of 90 V (minigel) totdat de blauwe kleurstof bijna onderaan zit.
  3. Vlekgel gedurende 30 minuten in 1 μL/ml ethidiumbromide of SYBR groen (nitrilhandschoenen en veiligheidsbril nodig), spoelen in water en bekijken onder een ultraviolette (UV) lichtbron. Selecteer uit de gedupliceerde monsters de hoogste opbrengst voor verdere verwerking.

4. Sequencing met hoge doorvoer

  1. Amplificeer het V4 hypervariabele gebied van het 16S rRNA-gen met behulp van specifieke primers 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') en 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Stel de omstandigheden van de polymerasekettingreactie (PCR) in op 94 °C gedurende 2 min, 30 cycli van 94 °C gedurende 20 s, 58 °C gedurende 20 s, 65 °C gedurende 1 minuut en 65 °C gedurende 10 min (laatste verlenging).
  2. Voer PCR-reacties uit met een high-fidelity PCR-mastermix (Materiaaltabel).
  3. Genereer bibliotheken met een DNA-bibliotheekvoorbereidingskit en sequentie vervolgens met behulp van paired-end sequencing op een sequencingplatform.
    OPMERKING: Hier werden de bibliotheken die zijn gegenereerd met NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit gesequenced met behulp van paired-end Illumina-sequencing (2 × 250 bp) op het novaseq6000-platform.
  4. Volg de stappen voor het rangschikken:
    1. Stap 1: Scheer het DNA af met een enzym, meestal door een methode die selecteert voor een algemene grootte.
      1. Voeg 3,5 μL sequentiebuffer en 1,5 μL enzymmix toe aan 25 μL DNA (ca. 1 μg), meng 10 keer met een pipet en draai snel.
      2. Plaats in een thermocycler met de volgende voorwaarden: verwarm het deksel voor op 75°C, (1) 30 min voor 20 °C (2) 30 min voor 65 °C (3) houd op 4°C.
    2. Stap 2: Adapters toevoegen via ligatie
      1. Voeg 15 μL ligatiemastermix, 1,25 μL adapter, 0,5 μL ligatieversterker en 30 μL endprep DNA-mix toe met een pipet.
      2. Incubeer bij 20 °C gedurende 15 minuten in een thermocycler en voeg vervolgens het uracil-specifieke excisiereagens (USER)-enzym (1,5 μl) toe aan het ligatiemengsel om een totaal van 48,26 μl te verkrijgen. Incubeer 37 °C gedurende 15 min.
      3. Voeg 43,5 μL magnetische kralen toe aan het DNA van de adapterligatie, meng 20 keer met een pipet en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Scheid de kralen met een magnetisch rek, incubeer vervolgens gedurende 5-10 minuten en gooi het supernatant weg.
      4. Was de pellet met 100 μL 80% ethanol, droog gedurende 30 s en was opnieuw. Eluteer korrels en pellets in 8,5 μL 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, meng met een pipet en incubeer gedurende 2 minuten bij RT.
      5. Incubeer in het magnetische rek en verwijder 7,5 μL geëlueerd DNA als supernatant. Plaats de elute in een nieuw buisje en voer een PCR-stap uit.
      6. Voeg eerst 12,5 μL mastermix, 2,5 μL indexprimer i7-primer en 2,5 μL universele PCR-primer/i5-primer toe aan 7,5 μL adapter-geligeerd DNA om 25 μL PCR-reactiemix te verkrijgen. Gebruik de volgende PCR-voorwaarde: verwarm het deksel voor op 103 °C. 98 °C gedurende 30 s, 98 °C gedurende 10 s, 65 °C gedurende 75 s, 65 °C gedurende 5 minuten en houd op 4 °C na 10 cycli.
      7. Reinig het 25 μL geamplificeerde DNA. Voeg 22,5 μL magneetkralen toe en meng 20 keer. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en verwijder 50 μL van het supernatant. Was de kralen met 100 μL 80% ethanol en verwijder alle ethanol door de kralen 30 s voorzichtig te drogen.
      8. Resuspendeer de donkerbruine kralen in 16 μL water, meng 20 keer met een pipet en plaats ze 30-60 s in het magnetische rek. Breng 15 μL over naar een nieuwe buis.
      9. Bepaal de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer. Meng 90 μL buffer + 1 μL kleurstof + 2 μL DNA-bibliotheekmonster en lees de concentratie af. Verdun het DNA tot 2 nM, laad 27-30 μL in de flowcel en plaats het in de sequencer.
    3. Stap 3: Sequentie van de adapters, hybridiseer de hierboven gegenereerde bibliotheken met de matrix van de patroonstroomcel en leg DNA vast volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik het als sjabloon voor de tweede synthese.
      1. Amplificeer vervolgens de tweede streng tot een klonale cluster. Lineariseer het cluster en blokkeer de actieve sites. Voeg sequencingprimer toe om een plaats te bieden voor sequencing door synthese in de sequentie volgens het protocol van de fabrikant.
        OPMERKING: Chemisch gezien binden de gemodificeerde nucleotiden zich aan de DNA-sjabloonstreng met behulp van natuurlijke complementariteit. Elk nucleotide heeft een fluorescerende tag en een omkeerbare terminator die de opname van de volgende base blokkeert. Daarom geeft de aanwezigheid van een fluorescerend signaal aan welk nucleotide wordt ingebracht en wordt de terminator gesplitst zodat de volgende base kan binden.
    4. Stap 4: Versterk de enkelvoudig gebonden streng om clusters van sequenties te krijgen die door synthese in tandem worden gesequenced.
      OPMERKING: De clusters geven een helderder signaal dan een enkele streng door bidirectioneel scannen en tweekanaals sequencing-chemie. De sequencing-software brengt automatisch basisoproepbestanden (*.cbcl) over naar de opgegeven locatie van de uitvoermap voor gegevensanalyse.

5. Bio-informatica

  1. Genereer de sequentiegegevens als FASTQ-bestanden. Analyseer om de volgende onderdelen op te nemen.
    1. Deel I:
      1. Sla de FASTQ-bestanden op die zijn verkregen van de sequencer, klik om een spreadsheetbestand te openen en maak mapping-/metadatabestanden.
      2. Open de Nephele-website (https://nephele.niaid.nih.gov/), upload de FASTQ-bestanden, lees QC, filteren en trimmen in QIIME222. Deponeer de ruwe sequenties als sequentieleesarchief (SRA) en GenBank in NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
    2. Deel II: Ga naar de Nephele-website (https://nephele.niaid.nih.gov/), voer de gedemultiplexte paired-end reads, filtersubstitutie en chimaera-fouten uit en voeg samen met DADA223. Gebruik de Naive Bayes-classificator die is getraind op de Silva versie 132 99% OTU-database om bacteriële taxonomische toewijzing uit te voeren met 97% gelijkenis24.
    3. Deel III: Open de MicrobiomeDB-website, klik om bestanden te uploaden en genereer OTU-alfadiversiteit, bètadiversiteit, relatieve overvloed en verdunningscurven (https://microbiomedb.org/mbio/app).
    4. Deel IV: Open een spreadsheet en draag gegevens over om heatmaps, Venn-diagrammen en lineaire discriminantanalyse-effectgrootte (https://microbiomedb.org/mbio/app) te maken.

6. Statistische analyse

  1. Open QIIME222 en bepaal de significante verschillen in alfadiversiteit tussen groepen met behulp van het alfagroep-significantiescript. Hiermee wordt ook de Kruskal-Wallis-test uitgevoerd.
  2. Bepaal de verschillen in bètadiversiteit tussen groepen met behulp van PERMANOVA, inclusief een paarsgewijze test25.
  3. Verkrijg de significante verschillen in de bacteriële gemeenschapsstructuur tussen de groepen met behulp van MicrobiomeDB. Een p-waarde ≤0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De kwantiteit en kwaliteit van het DNA dat wordt geëxtraheerd uit druivenmost, gistende wijn en uiteindelijke wijn werden eerst bepaald; de hoeveelheidswaarde varieert van 15-87 ng/μL (tabel 1).

Sequencing en bio-informatica
De Illumina high throughput sequencer genereerde een FASTQ-bestand dat werd geïmporteerd in de Nephele en bekeken op QIIME 2-platform26. Ten eerste werd FastQC-software gebruikt om de sequentiekw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol van metagenomica begint bij de bemonstering van de druivenmost en wanneer gist aan de most werd toegevoegd, de gistende wijn en de uiteindelijke wijnmonsters. Dit werd gevolgd door dubbele DNA-extractie die met succes uit deze monsters werd geëxtraheerd. De verkregen hoeveelheden varieerden in concentratie van 15 ng/μL tot 87 ng/μL. Dit toont aan dat het DNA-extractieprotocol effectief is voor metagenomische studies van wijn. Hoewel de kwaliteit van het DNA bij A260/A280 varieert, kan dit worden toegeschreve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Financiering van de Appalachian State University Research Council (URC) subsidie en CAPES Print Travel fellowship die het bezoek van de FAO aan de Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brazilië, ondersteunden, worden dankbaar erkend. Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. ECPDM is dankbaar voor de CAPES Print Travel-beurs die haar bezoek aan de Appalachian State University ondersteunde. ECPDM is een research fellow 2 van de Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazilië (CNPq).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose gel Promega, Madison, WI USAV3121Elektroforese 
FastPrep DNA spinKit for soil MP Biomedicals, Solon, OH USA116560-200DNA-extractie 
FastQC softwareBabraham Institute, Verenigd KoninkrijkBioinformatica 
Fermaid OScott Laboratory, Petaluma, CA USA Fermentatie 
High-Fidelity PCR Master Mix New England Biolabs, USAF630SPolymerasekettingreactie voor sequencing 
NEBNext UltraNew England Biolabs, USANEB #E7103DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit Illumina, San Diego, CA  USADNA-sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS)Illumina, San Diego, CA  USADNA-sequencing 
Novaseq6000 platform Illumina, San Diego, CA  USADNA-sequencing 
QuiBitThermoscientific, Waltham, MA, USADNA-kwantificering 
Quickdrop-spectrofotometer Molecular device, San Jose, CA, USADNA-kwantificering 
Natriumfosfaat Sigma Aldrich342483DNA-extractiebuffer
Stimula Sauvignon BlancScott Laboratory, Petaluma, CA USA Fermentatie 

Referenties

  1. Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
  2. Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).
  3. Reisch, B. I., et al. Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).
  4. Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).
  5. Attila, K. Ã, Kluz, M. Natural microflora of wine grape berries. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).
  6. Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).
  7. Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization. Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).
  8. Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role. Frontiers in Microbiology. 11, 3192(2021).
  9. Burns, T. R., Osborne, J. P. Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine. American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).
  10. Piao, H., et al. Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes. Frontier of Microbiology. 6, 809(2015).
  11. Figdor, D., Gukabivale, K. Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics. 18, 62-77 (2011).
  12. Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos ONE. 7 (5), e36357(2012).
  13. Berbegal, C., et al. A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine. International Journal of Molecular Science. 20, 3980(2019).
  14. Leveau, J. H., Tech, J. J. Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons. International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).
  15. Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies. Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).
  16. Bokulich, N. A., et al. Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics. Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).
  17. Siren, K., et al. Multi-omics and potential applications in wine production. Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).
  18. Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines. Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).
  19. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).
  20. Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).
  21. Stefanini, I., Cavalier, D. Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties. Frontiers in Microbiology. 9, 991(2018).
  22. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 5, 335-336 (2010).
  23. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  24. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  25. Anderson, M. J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).
  26. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  27. Fadiji, A. E., Babalola, O. O. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 170, 105860(2020).
  28. van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations. Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).
  29. Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research. Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).
  30. Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu,, Morozov, I. V., Bukin, S. V., Zakharenko, A. S., Zemskaya, T. I. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6, 190007(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Profilering van bacteri le gemeenschappenfermentatie van Traminette druiven16S ampliconsequencinganalyse van microbi le diversiteitmicrobioom van wijnfermentatieDNA extractieprotocolalfadiversiteitb tadiversiteitQIIME 2 analyse
Profilering van de bacteriële gemeenschap van fermenterende Traminette-druiven tijdens de wijnproductie met behulp van metagenomische amplicon-sequencing
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.