Verticale immobilisatiemethode voor time-lapse microscopieanalyse in filamenteuze cyanobacteriën

Summary

We presenteren een eenvoudige en toegankelijke methode voor filamenteuze cyanobacteriële visualisatie in het XY-vlak. Er werd een agarosematrix met een laag smeltpunt gebruikt, waardoor beelden van eiwitten die betrokken zijn bij de deling, in een verticale oriëntatie konden worden verkregen. Daarom kan deze methodologie worden toegepast op elk filamenteus organisme en verschillende soorten eiwitten.

Abstract

Een belangrijke gebeurtenis bij bacteriële celdeling is het septatieproces, waarbij het eiwit FtsZ het belangrijkste element is. FtsZ polymeriseert en vormt een ringachtige structuur (Z-ring) in het midden van de cel die dient als steiger voor andere delingseiwitten. Superresolutiemicroscopie in bacteriële modellen Escherichia coli en Bacillus subtilis toonden aan dat de Z-ring discontinu is, terwijl live cell imaging-studies aantoonden dat FtsZ langs de ring beweegt door een mechanisme dat bekend staat als loopband. Om de dynamica van FtsZ in vivo te bestuderen, is een speciale celplaatsing in een verticale positie nodig om de volledige structuur van de ring in het XY-vlak in beeld te brengen. In het geval van FtsZ-beeldvorming in meercellige cyanobacteriën, zoals Anabaena sp. PCC7120, is het een uitdaging om de filamenten in een verticale positie te houden vanwege de grootte van de cellen en de lengte van de filamenten. In dit artikel beschrijven we een methode die de verticale immobilisatie van Anabaena sp. PCC 7120-filamenten mogelijk maakt met behulp van agarose met een laag smeltpunt en spuiten, om de Z-ring vast te leggen in een mutant die een FtsZ-sfGFP-fusie-eiwit tot expressie brengt. Deze methode is een snelle en goedkope manier om eiwitdynamica op de delingsplaats te registreren met behulp van confocale microscopie.

Introduction

Bacteriële celdeling is het proces waarbij een moedercel twee dochtercellen genereert, in de meeste gevallen door het mechanisme dat bekend staat als binaire splijting. Een van de vroegste gebeurtenissen in het septatieproces is de lokalisatie van FtsZ in het midden van de cel¹. Dit eiwit, dat structureel homoloog is aan tubuline², is geconserveerd en wijd verspreid in de meeste bacteriën, en de polymerisatie ervan genereert een contractiele structuur die bekend staat als de Z-ring³. Deze ring dient als een steiger voor andere delingseiwitten en samen vormen ze een moleculaire machinerie die een divisoom wordt genoemd. Verschillende studies hebben aangetoond dat de Z-ring zeer dynamisch is en dat FtsZ-protofilamenten bewegen door loopband ^4,5,6. Om de Z-ring in time-lapse-experimenten te bestuderen, is het raadzaam om de delingsplaats in het XY-vlak vast te leggen voor een betere resolutie en snelle bemonstering. Om dit te bereiken, is het noodzakelijk om verticale celimmobilisatiemethoden te ontwikkelen die gewoonlijk de nanofabricage van microgatcelvallen en complexe microfluïdische apparaten omvatten⁷.

Cyanobacteriën zijn fotosynthetische micro-organismen die door hun cellulaire morfologie als gramnegatief worden geclassificeerd. Fylogenetisch staan ze echter dichter bij grampositieve bacteriën⁸. Deze organismen hebben celdelingsgenen die veel voorkomen in grampositieve en gramnegatieve bacteriën, maar hun divisoom bevat ook unieke elementen⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (hierna Anabaena sp.) is filamenteuze cyanobacteriën met één delingsvlak en is een model voor de studie van celdeling in meercellige cyanobacteriën. In deze stam is het mogelijk geweest om de positionering van FtsZ in het midden van de cellen^{te bepalen 10}. Toch zijn er geen studies die de in vivo dynamiek van FtsZ in dit model aantonen. In ons laboratorium verkregen we door triparentale paring en homologe recombinatie een volledig gescheiden mutant van Anabaena sp. die het FtsZ-eiwit tot expressie brengt dat is gefuseerd met sfGFP, dat het volledige endogene ftsZ-gen verving. We ontwikkelden een snelle en eenvoudige celimmobilisatiemethode die de verticale oriëntatie van de mutante stamfilamenten bevordert voor time-lapse-experimenten om de delingseiwitten in filamenteuze cyanobacteriën te visualiseren. Deze methode heeft geen microfluïdische apparaten nodig die duur en moeilijk te ontwikkelen kunnen zijn. Als voorbeeld gebruikten we dit protocol om de Z-ring in de FtsZ-sfGFP-mutant te visualiseren door confocale microscopie.

Protocol

1. Overwegingen en selectie van het cellulaire model

OPMERKING: Cyanobacteriën hebben een sterke autofluorescentie als gevolg van de aanwezigheid van fotosynthetische pigmenten. Dit signaal bevindt zich in het rode deel van het spectrum, daarom zijn de fluorescerende eiwitten die geschikt zijn voor beeldvorming in cyanobacteriën degenen die ver van de rode emissie verwijderd zijn. Bijvoorbeeld GFP, YFP, Venus, Turquoise en BFP.

1. Selecteer een divisoomcomponent die aanwezig is in de doelfilamenteuze cyanobacteriestam. Voor de experimenten is het noodzakelijk om een filamenteuze cyanobacteriële mutant te construeren die de geselecteerde divisoomcomponent tot expressie brengt die is gefuseerd tot een fluorescerend eiwit. In dit protocol staat een Anabaena sp. mutant die FstZ-sfGFP uitdrukt, als voorbeeld. Deze stam werd verkregen door triparentale paring met E. coli¹¹.
2. Controleer het segregatieniveau van de mutant die zal worden gebruikt. In het voorbeeld werd de segregatie bepaald door PCR-amplificatie van het doelgen. De FtsZ-sfGFP-mutant die in dit protocol wordt gebruikt, is een volledig gescheiden stam die het wild-type ftsZ-gen mist.

2. Groeicondities

1. Maak een verse subcultuur van de mutant met behulp van 10 ml cultuur in stationaire fase (gekweekt gedurende ongeveer 14 dagen in constant licht, bij 25 ° C , voor Anabaena sp.) en voeg toe aan 90 ml BG11 medium aangevuld met antibiotica (Spectinomycine en Streptomycine 10 μl ml-1 voor de FtsZ-sfGFP-mutant).
2. Kweek de nieuwe celcultuur in constant licht en op de optimale temperatuur totdat de exponentiële fase is bereikt. De FtsZ-sfGFP mutant van Anabaena sp. wordt gedurende 7 dagen vóór de monstervoorbereiding bij 25 °C gekweekt.

3. Monstervoorbereiding in een agarosematrix

1. Neem 2 ml van de gehomogeniseerde groeicultuur.
2. Centrifugeer op 2.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
3. Verwarm ondertussen in een kolf van 50 ml 30 ml agarose met een laag smeltpunt van 3% in vloeibaar BG11-medium. Gebruik een magnetron die is ingesteld op het gemiddelde vermogensniveau en controleer de oplossing elke 15 s totdat deze volledig is opgelost. Zet apart om af te koelen tot 37 °C.
   OPMERKING: Autoclaaf de oplossing van agarose om besmetting te voorkomen.
4. Zodra de centrifugatie is voltooid, gooit u 1,9 ml van het supernatant weg en resuspenseert u de cellen in het resterende volume door ten minste drie keer op en neer te pipetteren.
5. Meng de geresuspendeerde cellen met 900 μL van de 3% agarose-oplossing door minstens drie keer op en neer te pipetteren.
   OPMERKING: De agarose-oplossing moet vloeibaar zijn, maar niet te heet om celbeschadiging te voorkomen. De volgende stap moet snel worden uitgevoerd en voordat de agarose-oplossing een gelachtige consistentie vormt =.
6. Zuig de agarosematrix voorzichtig op in een spuit van 1 ml. Het is belangrijk om het ontstaan van bubbels te voorkomen terwijl het monster met de spuit wordt aangezogen.
   OPMERKING: Zorg er voor deze stap voor dat de punt van de spuit is gesneden om het smalle toegangsgat te elimineren.
7. Laat het monster-agarosemengsel stollen door de spuit gedurende 2 uur in de horizontale positie bij kamertemperatuur te plaatsen.
8. Verwijder de agarosematrix voorzichtig met behulp van de zuiger en leg deze op een schoon en vlak oppervlak.
9. Snijd het gestolde monster in plakjes, in een diktebereik van 0,5 - 1 mm, met behoud van de integriteit van de matrix.
   OPMERKING: Voor betere resultaten, snijd de agarose matrix met behulp van een scalpel of dunne scheermesjes.
10. Leg de plakjes naast elkaar op een coverslip. Het aantal schijven op een coverslip is afhankelijk van de afmetingen.
    OPMERKING: Voor time-lapse microscopie wordt aanbevolen om een celkamer te gebruiken die is gemaakt voor microscopie-analyse (bijv. Attofluor- of Chamlide-magnetische kamers). Deze kamers maken het mogelijk om het monster te verkrijgen en uitdroging te voorkomen. In dit voorbeeld worden de monsters geprepareerd op afgeronde dekstroken (25 mm) met behulp van de Attofluor-kamer.
11. Voeg 2 ml gesmolten 3% agarose-oplossing toe aan het monster dat in de kamer is geplaatst om uitdroging te voorkomen.
12. Wacht tot de agarose-oplossing volledig is gestold om een gel te vormen.

4. Beeldacquisitie

1. Standaardiseer de parameters om het fluorescerende eiwit van belang in de mutante stam in een confocale microscoop te visualiseren. Zorg ervoor dat de microscoop zowel de autofluorescentie als de geselecteerde fluorescerende marker kan detecteren.
2. Visualiseer het monster in de heldere veldconformatie met maximale vergroting en zoek een verticaal georiënteerde gloeidraad zoals weergegeven in figuur 1.
3. Zoek de divisiesite van belang met een eerste scan met behulp van het autofluorescentiesignaal langs het Z-vlak.
4. Gebruik de parameters van de fluorescerende eiwitmarker om het signaal van het eiwit van belang op de delingslocatie te visualiseren.
5. Voer time-lapse-experimenten uit volgens het biologische model en het eiwit van belang. In dit geval werden bijvoorbeeld time-lapse-experimenten van 10 s in 50 s uitgevoerd om de dynamiek van FtsZ langs de Z-ring in Anabaena sp. vast te leggen (figuur 2).

Results

Visualisatie van de Z-ring in Anabaena sp. met behulp van de verticale immobilisatiemethode
Om de dynamiek van Z-ringcomponenten in bacteriën te bestuderen, is het noodzakelijk om afbeeldingen in verticaal georiënteerde cellen te verkrijgen. In deze positie is het mogelijk om de Z-ring en de belangrijkste eiwitten van het divisoom te visualiseren om de eiwitdynamiek te volgen door middel van time-lapse microscopie. De klassieke monstervoorbereiding voor bacteriën werkt niet voor filamenteuze ...

Discussion

De studie van de dynamiek van divisoomeiwitten is zonder twijfel een uitdaging. Met name bij filamenteuze cyanobacteriën is een van de uitdagingen de visualisatie van de Z-ring in het horizontale vlak, waarvoor de cellen verticaal georiënteerd moeten zijn. De methode die we hier hebben beschreven, maakt het mogelijk om de positie van de Z-ring in het XY-vlak uit te voeren van de verschillende analyses. Dit is de eerste eenvoudige methode voor filamenteuze cyanobacteriën die de volledige visualisatie van de Z-ring mogelij...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml spuit	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	De wegwerpspuit van medisch plastic met 1 ml naald wordt over het algemeen gebruikt om vloeistof of injectievloeistof te pompen, in dit experiment wordt deze gebruikt om de monster te zuigen en te polymeriseren.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	De Attofluor Cell Camera is een duurzame en praktische dekglashouder ontworpen voor het bekijken van monsters van levende cellen in rechtopstaande of omgekeerde microscopen.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler met 96-wellblok	CORNING	THERM-1001	De nieuwe MaxyGene II Thermal Cycler met verhoogde snelheid en geavanceerde functies, biedt de premium prestaties die u van Axygen merkproducten verwacht. Unieke flexibele programmering. Snelle uitvoeringstijden. Verbeterde workflow ten opzichte van traditionele gradiëntcycli. Oploopsnelheden tot 5°C/sec. Instelbare verwarmde deksel past strips, buisjes en microplates.
Fisherbrand Dekglazen: Cirkels	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Gemaakt van de beste optische borosilicaatglas, met uniforme dikte en maat. Ronde vorm. Corrosiebestendig.
Agarose met laag smeltpunt	Promega	V3841	Agarose, laag smeltpunt, analytische kwaliteit, is ideaal voor toepassingen die herstel van intacte DNA-fragmenten na gelelektroforese vereisen.
LSM 880 microscoop van Zeiss Airyscan	Zeiss	-	De Zeiss Airyscan LSM 880 microscoop is een laserscanning microscoop die beelden kan verkrijgen onder de resolutielimiet (zijdelingse resolutie ~ 120nm en axiale resolutie ~ 350nm). De detectoren zijn zeer gevoelig waardoor het mogelijk is om superresolutiebeelden te verkrijgen met hoge snelheid.
Microcentrifuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Versnel routineuze monstervoorbereidingsprocessen tot 17.000 × g met onze standaard microcentrifuge, verkrijgbaar met koeling. Deze microcentrifuges bieden productiviteit, veelzijdigheid, veiligheid en gemak in een gemakkelijk te gebruiken, compact ontwerp laboratoriuminstrument.
Nikon Timelapse Microscoop	Nikon	-	De Nikon C2 laser scanning confocale microscoop is een ideale microscoop voor lange termijn timelapse, omdat het dankzij de incubatiekamer mogelijk is om monsters in optimale omstandigheden te houden voor meer dan 8 uur.
Dunne scheermessen Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	De dunne scheermessen worden gebruikt om de agarose matrix te snijden, waardoor we de schijven met het monster kunnen verkrijgen terwijl de integriteit van de matrix wordt gehandhaafd.