Verticale immobilisatiemethode voor time-lapse microscopieanalyse in filamenteuze cyanobacteriën

Summary

We presenteren een eenvoudige en toegankelijke methode voor filamenteuze cyanobacteriële visualisatie in het XY-vlak. Er werd een agarosematrix met een laag smeltpunt gebruikt, waardoor beelden van eiwitten die betrokken zijn bij de deling, in een verticale oriëntatie konden worden verkregen. Daarom kan deze methodologie worden toegepast op elk filamenteus organisme en verschillende soorten eiwitten.

Abstract

Een belangrijke gebeurtenis bij bacteriële celdeling is het septatieproces, waarbij het eiwit FtsZ het belangrijkste element is. FtsZ polymeriseert en vormt een ringachtige structuur (Z-ring) in het midden van de cel die dient als steiger voor andere delingseiwitten. Superresolutiemicroscopie in bacteriële modellen Escherichia coli en Bacillus subtilis toonden aan dat de Z-ring discontinu is, terwijl live cell imaging-studies aantoonden dat FtsZ langs de ring beweegt door een mechanisme dat bekend staat als loopband. Om de dynamica van FtsZ in vivo te bestuderen, is een speciale celplaatsing in een verticale positie nodig om de volledige structuur van de ring in het XY-vlak in beeld te brengen. In het geval van FtsZ-beeldvorming in meercellige cyanobacteriën, zoals Anabaena sp. PCC7120, is het een uitdaging om de filamenten in een verticale positie te houden vanwege de grootte van de cellen en de lengte van de filamenten. In dit artikel beschrijven we een methode die de verticale immobilisatie van Anabaena sp. PCC 7120-filamenten mogelijk maakt met behulp van agarose met een laag smeltpunt en spuiten, om de Z-ring vast te leggen in een mutant die een FtsZ-sfGFP-fusie-eiwit tot expressie brengt. Deze methode is een snelle en goedkope manier om eiwitdynamica op de delingsplaats te registreren met behulp van confocale microscopie.

Introduction

Bacteriële celdeling is het proces waarbij een moedercel twee dochtercellen genereert, in de meeste gevallen door het mechanisme dat bekend staat als binaire splijting. Een van de vroegste gebeurtenissen in het septatieproces is de lokalisatie van FtsZ in het midden van de cel¹. Dit eiwit, dat structureel homoloog is aan tubuline², is geconserveerd en wijd verspreid in de meeste bacteriën, en de polymerisatie ervan genereert een contractiele structuur die bekend staat als de Z-ring³. Deze ring dient als een steiger voor andere delingseiwitten en samen vormen ze een moleculaire machinerie die een d....

Protocol

1. Overwegingen en selectie van het cellulaire model

OPMERKING: Cyanobacteriën hebben een sterke autofluorescentie als gevolg van de aanwezigheid van fotosynthetische pigmenten. Dit signaal bevindt zich in het rode deel van het spectrum, daarom zijn de fluorescerende eiwitten die geschikt zijn voor beeldvorming in cyanobacteriën degenen die ver van de rode emissie verwijderd zijn. Bijvoorbeeld GFP, YFP, Venus, Turquoise en BFP.

1. Selecteer een divisoomcomponent die aanwezig is in de doelfilamenteuze cyanobacteriestam. Voor de experimenten is het noodzakelijk om een filamenteuze cyanobacteriële mutant te construeren ....

Results

Visualisatie van de Z-ring in Anabaena sp. met behulp van de verticale immobilisatiemethode
Om de dynamiek van Z-ringcomponenten in bacteriën te bestuderen, is het noodzakelijk om afbeeldingen in verticaal georiënteerde cellen te verkrijgen. In deze positie is het mogelijk om de Z-ring en de belangrijkste eiwitten van het divisoom te visualiseren om de eiwitdynamiek te volgen door middel van time-lapse microscopie. De klassieke monstervoorbereiding voor bacteriën werkt niet voor filamenteuze .......

Discussion

De studie van de dynamiek van divisoomeiwitten is zonder twijfel een uitdaging. Met name bij filamenteuze cyanobacteriën is een van de uitdagingen de visualisatie van de Z-ring in het horizontale vlak, waarvoor de cellen verticaal georiënteerd moeten zijn. De methode die we hier hebben beschreven, maakt het mogelijk om de positie van de Z-ring in het XY-vlak uit te voeren van de verschillende analyses. Dit is de eerste eenvoudige methode voor filamenteuze cyanobacteriën die de volledige visualisatie van de Z-ring mogelij.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	-	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
Microcentrífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.
Nikon Timelapse Microscope	Nikon	-	The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.
Thin razor blades Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.