Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gaschromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde gerichte metabolomics van harde koraalmonsters

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65628

⸱

13 oktober 2023

 ,  ,  ,  , 
1Climate Change Cluster (C3), University of Technology Sydney, 2Metabolomics Australia, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, The University of Melbourne, 3School of Biological Sciences, Victoria University of Wellington

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we de extractie en bereiding van polaire en semi-polaire metabolieten uit een koraalholobiont, evenals gescheiden koraalgastheerweefsel en Symbiodiniaceae celfracties, voor gaschromatografie-massaspectrometrie-analyse.

Samenvatting

Op gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) gebaseerde benaderingen hebben bewezen krachtig te zijn voor het ophelderen van de metabole basis van de symbiose tussen cnidarian en dinoflagellaat en hoe koraal reageert op stress (d.w.z. tijdens temperatuurgeïnduceerde bleking). Steady-state metabolietprofilering van het koraalholobiont, dat de cnidarian-gastheer en de bijbehorende microben (Symbiodiniaceae en andere protisten, bacteriën, archaea, schimmels en virussen) omvat, is met succes toegepast onder omgevings- en stressomstandigheden om de holistische metabole status van het koraal te karakteriseren.

Om vragen over de symbiotische interacties te beantwoorden, is het echter noodzakelijk om de metabolietprofielen van de koraalgastheer en zijn algensymbionten onafhankelijk te analyseren, wat alleen kan worden bereikt door fysieke scheiding en isolatie van de weefsels, gevolgd door onafhankelijke extractie en analyse. Hoewel de toepassing van metabolomics relatief nieuw is in het koraalveld, hebben de aanhoudende inspanningen van onderzoeksgroepen geresulteerd in de ontwikkeling van robuuste methoden voor het analyseren van metabolieten in koralen, inclusief de scheiding van het koraalgastheerweefsel en algensymbionten.

Dit artikel presenteert een stapsgewijze handleiding voor holobiont-scheiding en de extractie van metabolieten voor GC-MS-analyse, inclusief belangrijke optimalisatiestappen ter overweging. We laten zien hoe, eenmaal onafhankelijk geanalyseerd, het gecombineerde metabolietprofiel van de twee fracties (koraal en Symbiodiniaceae) vergelijkbaar is met het profiel van het geheel (holobiont), maar door de weefsels te scheiden, kunnen we ook belangrijke informatie verkrijgen over het metabolisme van en interacties tussen de twee partners die niet alleen uit het geheel kan worden verkregen.

Inleiding

Metabolieten vertegenwoordigen de eindproducten van cellulaire processen, en metabolomics - de studie van de reeks metabolieten die door een bepaald organisme of ecosysteem worden geproduceerd - kan een directe maatstaf zijn voorhet functioneren van het organisme. Dit is met name van cruciaal belang voor het verkennen van ecosystemen, symbiotische interacties en herstelinstrumenten, aangezien het doel van de meeste beheerstrategieën is om specifieke ecosysteemdienstfuncties te behouden (of te herstellen)2. Koraalriffen zijn een aquatisch ecosysteem dat de potentiële waarde van metabolomics aantoont voor het ophelderen van symbiotische interacties en het koppelen van fysiologische reacties van koraal aan effecten op gemeenschaps- en ecosysteemniveau3. De toepassing van high-throughput gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) wordt vooral gewaardeerd vanwege het vermogen om snel een breed scala aan metabolietklassen gelijktijdig te analyseren met een hoge selectiviteit en gevoeligheid, een snelle identificatie van verbindingen te bieden wanneer spectrale bibliotheken beschikbaar zijn, en een hoge mate van reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid te bieden, met relatief lage kosten per monster.

Koralen zijn holobionten die bestaan uit het koraaldier, fotosynthetische dinoflagellaat-endosymbionten (familie: Symbiodiniaceae4) en een complex microbioom 5,6. Over het algemeen wordt de fitheid van de holobiont voornamelijk gehandhaafd door de uitwisseling van kleine moleculen en elementen om het metabolisch functioneren van elk lid te ondersteunen 7,8,9,10. Metabolomische benaderingen zijn bijzonder krachtig gebleken voor het ophelderen van de metabole basis van symbiosespecificiteit9,11, de bleekreactie op thermische stress 7,8,12,13, ziektereacties 14, blootstellingsreacties aan vervuiling 15, fotoacclimatisatie 16 en chemische signalering 17 bij koralen, evenals bij het helpen ontdekken van biomarkers 18,19. Bovendien kan metabolomics een waardevolle bevestiging bieden van de conclusies die worden afgeleid uit DNA- en RNA-gebaseerde technieken 9,20. Er is daarom een aanzienlijk potentieel voor het gebruik van metabolomics voor het beoordelen van de gezondheid van riffen en het ontwikkelen van instrumenten voor het behoud van riffen3, zoals door de detectie van metabole biomarkers van stress18,19 en voor het onderzoeken van het potentieel van actieve beheerstrategieën zoals voedingssubsidies21.

Het scheiden van de gastheer- en symbiontecellen en het onafhankelijk analyseren van hun metabolietprofielen, in plaats van samen als de holobiont, kan meer informatie opleveren over de partnerinteracties, onafhankelijke fysiologische en metabole statussen en mogelijke moleculaire mechanismen voor aanpassing 11,12,22,23,24. Zonder het koraal en de Symbiodiniaceae te scheiden, is het bijna onmogelijk om de bijdrage en het metabolisme van koraal en/of Symbiodiniaceae onafhankelijk van elkaar op te helderen, behalve met complexe genoomreconstructie en metabole modellering25, maar dit moet nog worden toegepast op de symbiose tussen koraal en dinoflagellaat. Bovendien kan een poging om informatie over het individuele metabolisme van de gastheer of algensymbiont uit het metabolietprofiel van de holobiont te halen, leiden tot verkeerde interpretatie.

Tot voor kort werd bijvoorbeeld gedacht dat de aanwezigheid van C18:3n-6, C18:4n-3 en C16 meervoudig onverzadigde vetzuren in extracten van koraal- en holobiontweefsels afkomstig was van de algensymbiont, omdat werd aangenomen dat koralen niet de ωx-desaturaten bezitten die essentieel zijn voor de productie van omega-3 (ω3) vetzuren; recent genoombewijs suggereert echter dat meerdere cnidarians het vermogen hebben om ω3 PUFA de novo te produceren en ω3 PUFA met lange keten verder te biosynthetiseren26. Het combineren van GC-MS met stabiele isotopenetikettering (bijv. 13 C-bicarbonaat, NaH 13CO3) kan worden gebruikt om het lot van fotosynthetisch gefixeerde koolstof te volgen via koraalholobiont-metabole netwerken onder zowel controleomstandigheden als als reactie op externe stressoren27,28. Een cruciale stap in het volgen van het lot van 13 C is echter de scheiding van het koraalweefsel van de algencellen - alleen dan kan de aanwezigheid van een 13C-gelabelde verbinding in de koraalgastheerfractie ondubbelzinnig worden toegewezen als een van Symbiodiniaceae afgeleide metaboliet die naar hetkoraal wordt verplaatst of een stroomafwaarts product van een getransloceerde gelabelde verbinding. Deze techniek heeft zijn kracht bewezen door de lang gekoesterde veronderstelling uit te dagen dat glycerol de primaire vorm is waarin fotosynthese wordt verplaatst van symbiont naar gastheer29, en door op te helderen hoe de voedingsflux tussen partners verandert tijdens het bleken27,28 en als reactie op incompatibele Symbiodiniaceae species11.

Hoewel de beslissing om weefsels te scheiden voornamelijk wordt gedreven door de onderzoeksvraag, zijn de bruikbaarheid, betrouwbaarheid en potentiële metabole effecten van deze aanpak belangrijk om te overwegen. Hier bieden we gedetailleerde, gedemonstreerde methoden voor de extractie van metabolieten uit de holobiont, evenals de afzonderlijke gastheer- en symbiontenfracties. We vergelijken de metabolietprofielen van de gastheer en symbiont onafhankelijk van elkaar en hoe deze profielen zich verhouden tot het holobiontmetabolietprofiel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De experimentele opzet, monsterafname en opslag zijn elders in detail beschreven 2,30,31. Voorafgaand aan het verzamelen en experimenteren moet toestemming worden verkregen voor het verzamelen van wilde koralen. De monsters hier zijn verzameld van kolonies van Montipora mollis (groene kleur-morph) geïmporteerd uit Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), oorspronkelijk verzameld van een rif voor de kust van de Abrohlos-eilanden (West-Australië; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) op een diepte van 1 m onder de aquacultuurvergunning AQ1643. Voorafgaand aan de bemonstering werden de kolonies gedurende 3 maanden gehouden in een aquarium van 800 liter bij 35 PSU, onder blauw en wit licht bij 150 μmol fotonen·m−2·s−1 en bij 25 °C ± 0,5 °C. De koraalfragmenten (~5cm2, N = 6) werden ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 °C tot verwerking.

1. Bereiding van de extractieoplossingen en -apparatuur

  1. Bereid ten minste 1 dag voorafgaand aan het verwijderen van koraalweefsel de extractieoplossingen en -apparatuur voor.
  2. Ultrapuur water voorkoelen in schoon, wasmiddelvrij glaswerk bij 4 °C.
  3. Meng 100% methanol van LC-kwaliteit met een eindconcentratie van 10 μg·ml−1 van de juiste interne standaard(en) (bijv. 13C6 sorbitol).
  4. Maak een extractieoplossing voor 50% methanol met de helft van 100% methanol van LC-kwaliteit en de helft van ultrapuur water. Bewaar beide methanoloplossingen bij -20 °C.
    OPMERKING: Om afbraak van de metabolieten te helpen voorkomen, wordt aanbevolen om de monsterverwerkingsstappen uit te voeren in batches van vijf koraalfragmenten tegelijk, met één extra biologische (alleen water) blanco (totale monsters N = 6). Zodra elk koraalmonster is gescheiden in de twee fracties (koraalgastheerweefsel, voortaan "gastheer", en microalgencellen, voortaan "symbiont"), zal het totale aantal monsters in één verwerkingsbatch 12 zijn.

2. Het blussen van het koraalmetabolisme

OPMERKING: De experimentele opzet, monsterafname en opslag zijn elders in detail beschreven 2,30,31. Er moet echter worden opgemerkt dat de tijd die nodig is om het metabolisme te doven (d.w.z. de tijd tussen het verzamelen van koraalmonsters en het bewaren ervan) van cruciaal belang is om de oorspronkelijke respons vast te leggen30. Bewaar het monster zo snel mogelijk na het verzamelen om veranderingen in de samenstelling van de metabolieten als gevolg van monsterafbraak of fysiologische reacties van niet-doelwitten te voorkomen32.

  1. Plaats het koraalfragment in een steriele monsterafnamezak en laat overtollig zeewater zoveel mogelijk weglopen. Dompel het monster minimaal 30 s onder in vloeibare stikstof. Verplaats de monsters zo snel mogelijk naar een vriezer van -80 °C om ze te bewaren.
    NOTITIE: Monsters kunnen worden ingevroren bij -80°C in lichtgeblokkeerde containers tot verwerking, waardoor vries-dooicycli worden vermeden.

3. Verwijdering van koraalweefsel uit het skelet

OPMERKING: De monsters moeten te allen tijde op ijs (4 °C) worden bewaard om ervoor te zorgen dat ze tegelijkertijd in vloeibare vorm zijn en tegelijkertijd een doorgaand metabolisme voorkomen.

  1. Plaats een schone, steriele monsterafnamezak op ijs, zodat de zak stabiel en open is bovenop het ijs in een ondiepe put, maar niet ondergedompeld is in het ijs. Voeg 10 ml koud (4 °C) ultrapuur water toe aan de zak.
    OPMERKING: Dit helpt om herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van het koraalfragment als gevolg van de koude perslucht en het omringende ijs te voorkomen.
  2. Selecteer een koraalfragment met een gesteriliseerd pincet en spoel het af met koud (4 °C) ultrapuur water met een steriele pasteurpipet totdat er geen zeewaterresten meer achterblijven. Dompel het gespoelde koraalfragment onder in de zak met de 10 ml ultrapuur water.
    NOTITIE: Deze spoeling is van cruciaal belang om eventuele resterende zouten te verwijderen die de stroomafwaartse analyse zouden verstoren. Vermijd handcontact met het water of koraalfragment door de zak om het monster op 4 °C te houden.
  3. Plak een steriele pipetpunt van 1 ml over het uiteinde van een luchtpistool met isolatietape, waarbij ~5 mm het uiteinde van de punt wordt afgesneden (Figuur 1A).
  4. Richt het luchtpistool op het koraalfragment met de zak half verzegeld en de luchtstroom op laag-medium om het weefsel voorzichtig te verwijderen door een cirkelvormige beweging van het water over het koraalfragment aan te moedigen.
  5. Na ~3 min, of wanneer al het weefsel uit het skelet lijkt te zijn verwijderd, zet u de lucht uit en verwijdert u de airbrush. Sluit de zak volledig af.
  6. Knijp al het verwijderde koraalweefsel in een onderste hoek van de zak. Snijd de tegenoverliggende hoek af en giet de inhoud van de zak voorzichtig in een buis van 15 ml op ijs.

4. Facultatieve homogenisatie

OPMERKING: Sommige koraalsoorten zijn stroperiger dan andere, wat betekent dat het luchtborstelen het weefsel in klonten zal verwijderen in plaats van in een brij. Als er klontjes weefsel zichtbaar zijn in het airbrush-homogenaat, kan voor alle monsters een homogenisatiestap bij 4 °C worden toegevoegd.

  1. Reinig een mechanische zaagtandhomogenisator twee keer met 4 °C 70% methanol en tenslotte met 4 °C ultrapuur water.
  2. Homogeniseer het koraalmonster in een buis van 15 ml gedurende ~1 minuut totdat het monster volledig is gehomogeniseerd en er geen klonten meer zichtbaar zijn.
  3. Reinig de homogenisator zoals in stap 4.1 tussen elk monster. Houd de homogenisatietijd consistent over de monsters.

5. Monsterafname voor normalisatie

  1. Verzamel een aliquot van 1.000 μL uit het gehomogeniseerde weefsel voor het aantal Symbiodinaiaceae-cellen, de analyse van het eiwitgehalte van het koraalgastheerweefsel en een schatting van chlorofyl. Bewaren bij -20 °C tot klaar om te analyseren (sectie 10).

6. Facultatieve scheiding van koraalgastheerweefsel en Symbiodiniaceae cellen

  1. Centrifugeer het koraalhomogenaat bij 2.500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een gekoelde centrifuge.
    OPMERKING: Deze snelheid is optimaal om de zwaardere Symbiodiniaceae cellen, terwijl hun celwanden intact blijven, te scheiden van het gastheerweefsel, dat in het supernatant is opgehangen.
  2. Verwijder het supernatans met het gastheermateriaal en plaats het in een nieuw buisje van 15 ml.
    OPMERKING: De lipiden uit het gastheerweefsel vormen meestal een smal roze/wit laagje bovenop de symbiontencellen. Deze laag kan samen met het oplosbare supernatans van de gastheer worden verzameld via pipetteren (Figuur 1B).
  3. Draai de gastheer krachtig gedurende precies 1 minuut. Bewaar het monster van de algenpellet en het supernatantmonster op ijs.
  4. Voeg 2 ml ultrapuur water van 4 °C toe aan de algenkorrel. Draai krachtig gedurende precies 2 minuten om de pellet te resuspenderen.
    OPMERKING: Als er geen individuele fragmenten van 1 cm uit de koraalkolonie zijn verzameld voor Symbiodiniaceae genotypering, kan hier een 200 μL aliquot van de Symbiodiniaceae celsuspensie worden verzameld, bewaard in de geprefereerde DNA-bufferoplossing en opgeslagen zoals beschreven in Thurber et al.30 voor Symbiodiniaceae genotypering (bijv. volgens González-Pech et al.12).
  5. Herhaal stap 6.1-6.4 nog een keer.
    OPMERKING: De betrouwbare scheiding van de gastheer en symbiont hangt af van de koraalbiomassa en -soort, aangezien sommige soorten stroperiger kunnen zijn dan andere. Een minimum van drie wasstappen wordt aanbevolen, maar dit kan worden verhoogd afhankelijk van het scheidingssucces. Herhaal de wasstappen 4.7-4.9 totdat er geen Symbiodiniaceae cellen meer te zien zijn in de bodem van de gastheerfractie en totdat de Symbiodiniaceae fractie zichtbaar vrij is van gastheermateriaal (bijv. geen witte laag bovenop) (Figuur 1).
  6. Verwijder het supernatans met het gastheermateriaal en plaats het in een nieuw buisje van 15 ml.
  7. Bewaar de symbiontkorrel in de tube van 15 ml.

7. Het drogen van de steekproef

  1. Vries het holobionthomogenaat of zowel de gescheiden gastheer- als de Symbiodinaiaceae-fractie in bij −80 °C gedurende ~120 min. Vries de monsters 's nachts met een vacuüm van 0,01 mbar bij −85 °C.
    OPMERKING: Om monsterverlies tijdens vriesdrogen te voorkomen, wordt aanbevolen om een deksel te gebruiken dat uit een andere steriele buis is gesneden, of steriele parafilm, met een gat van ~ 2 mm dat zorgvuldig is doorboord met een steriele naald van 25 G.
  2. Als het droog is, weeg dan met behulp van een laboratoriumbalans een van de volgende factoren af: 1) 25 mg van de holobiont; 2) 15 mg van de symbiontenfractie; of 3) 30 mg van het gastheerweefsel van elk monster in afzonderlijke 2 ml weekmakervrije microcentrifugebuisjes.
    OPMERKING: Kritieke stap: De optimalisatie van de biomassa voor extractie is essentieel om ervoor te zorgen dat de GC-MS niet overbelast raakt en tegelijkertijd voldoende signaal garandeert. Het gedroogde koraalmateriaal is zeer statisch. Om monsterverlies te voorkomen, gebruikt u antistatische apparaten om elektrostatische ladingen van de monsters en weegvaten te verwijderen. Een eenvoudig en kosteneffectief alternatief is om een wasdrogervel onder de monsterbuis te plaatsen. De gedroogde symbiontkorrel kan met behulp van een steriel mesje op het gewenste gewicht worden gesneden.

8. Intracellulaire metabolietextracties

  1. Intracellulaire metabolietextractie uit gevriesdroogd holobiont:
    1. Voeg 400 μL 100% koude (-20 °C) methanol toe met interne standaard(en; 13 okt.C6 sorbitol en/of 13C5-15 N valine, bij 10μM) aan elke buis.
    2. Voeg een klein aantal 710-1.180 μm zuurgewassen glasparels (~10 mg) toe aan elk monster. Plaats in een kralenmolen op 50 Hz gedurende 3 minuten in een voorgekoeld (-20 °C) kralenmoleninzetstuk.
    3. Voeg aan elke buis nog eens 600 μl 100% koude (-20 °C) methanol met IS's (13 C6 sorbitol en/of 13C5-15 N valine, bij 10μM) toe.
    4. Vortex om 1 minuut te mengen. Plaats op een rotisserie-shaker bij 4 °C gedurende 30 min.
  2. Intracellulaire metabolietextractie uit gescheiden gevriesdroogde Symbiodiniaceae cellen:
    1. Voeg 200 μL 100% koude (−20 °C) methanol met IS's (13 C6 sorbitol en/of 13C5-15 N valine, bij 10μM) toe aan het gedroogde Symbiodiniaceae materiaal.
    2. Voeg een klein aantal 710-1.180 μm zuurgewassen glasparels (~10 mg) toe. Plaats in een kralenmolen op 50 Hz gedurende 3 minuten in een voorgekoeld (-20 °C) kralenmoleninzetstuk.
    3. Voeg nog eens 800 μL 100% koude (-20 °C) methanol met IS's toe en draai gedurende 30 s.
  3. Intracellulaire metabolietextractie uit gescheiden gevriesdroogd gastheerweefsel:
    1. Voeg 1 ml 100% koude (-20 °C) LC-kwaliteit methanol bevattende IS's (13 C6 sorbitol en/of 13C5-15 N valine, bij 10μM) toe aan het gedroogde gastheermateriaal.
    2. Vortex om 20 s te mengen. Plaats in een drijvende buishouder in een sonicatiebad op 4 °C gedurende 30 min.

9. De zuivering van het metabolietenextract

  1. Centrifugeer de monsters (holobiont/gastheer/symbiont) bij 3.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  2. Breng al het supernatans over in een nieuwe microcentrifugebuis van 2 ml en zorg ervoor dat u de celrestpellet niet verstoort.
    OPMERKING: Dit zijn de semi-polaire extracten. Deze kunnen tijdelijk op ijs worden bewaard, maar langdurig worden bewaard bij -80 °C in het donker.
  3. Voeg aan de resterende celresten 1.000 μL 50% koude (-20 °C) methanol toe. Draai krachtig gedurende 1 minuut om te resuspenderen.
  4. Centrifugeer de monsters bij 3.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  5. Verzamel het supernatans (polaire extracten) en voeg het samen met de semipolaire extracten van hetzelfde monster.
    OPMERKING: Het celafval kan worden opgeslagen bij -80 °C en worden gebruikt voor normalisatie van het eiwitgehalte (sectie 11).
  6. Centrifugeer de gepoolde extracten bij 16.100 g gedurende 15 minuten om alle neerslag te verwijderen en verplaats het supernatans naar een nieuwe weekmakervrije microcentrifugebuis (2 ml).
    OPMERKING: De monsterextracten kunnen in het donker bij -80 °C worden bewaard.
  7. Wanneer u klaar bent om te analyseren, doet u 50 μl van elk extract in een glazen inzetstuk. Concentreer gedurende 30 minuten op 30 °C met behulp van een vacuümconcentrator. Herhaal dit nog vier keer (voor 250 μL totaal gedroogd extract).
    OPMERKING: De gedroogde monsters kunnen tot analyse bij kamertemperatuur onder droogmiddelomstandigheden worden bewaard.

10. Derivatisering van metabolieten

OPMERKING: Een online derivatiseringsproces in twee stappen wordt gebruikt voor de methoximatie en trimethylsilylering van de polaire metabolieten.

  1. Voeg 25 μL methoxyaminehydrochloride (30 mg/ml pyridine) toe aan elk monster.
  2. Schud bij 37 °C op een orbitale schudder die is ingesteld op 750 tpm gedurende 2 uur.
  3. Voeg 25 μL N,O-bis (trimethylsilyl)trifluoracetamide + trimethylchloorsilaan toe aan elk monster.
  4. Opnieuw roeren bij 37 °C en 750 tpm gedurende 1 uur.
  5. Laat de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in evenwicht komen voordat u 1 μL in een verdeelverhouding van 1:10 in de GC injecteert.

11. Gaschromatografie-massaspectrometrie-analyse

NOTITIE: De massaspectrometer moet worden afgesteld volgens de aanbevelingen van de fabrikant met behulp van tris-(perfluorbutyl)-amine (CF43).

  1. Gebruik helium met ultrahoge zuiverheid als draaggas met een constant kolomdebiet van 1 ml/min.
  2. Gebruik een DB-5-kolom van 30 m met een filmdikte van 1 μm en een inwendige diameter van 0,25 mm.
  3. GC oven programma
    1. Stel de inlaattemperatuur in op 280 °C.
    2. Begin bij de injectie met een oventemperatuur van 100 °C en houd deze 4 minuten vast.
    3. Verhoog de temperatuur met 10 °C/min tot 320 °C en houd deze vervolgens 11 minuten vast.
  4. Parameters van de massaspectrometer
    1. Stel de MS-overdrachtslijn in op 280 °C en stel de ionenbron in op 200 °C.
    2. Gebruik argon als het botsingscelgas om het MRM-production (Multiple Reaction Monitoring) te genereren.
    3. Bereik metabolietdetectie ten opzichte van een tijdgesegmenteerde MRM-bibliotheek met MRM-doelen.

12. Symbiodiniaceae celtellingen, analyse van het eiwitgehalte van koraalgastheerweefsel en chlorofyl: een schatting

  1. Aantal cellen van Symbiodiniaceae:
    1. Neem een aliquot van het homogenaat van het koraalweefsel.
    2. Centrifugeer de monsters bij 2.000 × g om de algen te pelleteren.
    3. Verwijder het supernatans van ~200 μL uit de algenkorrel en plaats het in een nieuwe microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Dit is het eiwitmonster dat zal worden gebruikt om de gegevens te normaliseren; bewaar het bij -20 °C alvorens te analyseren, indien nodig.
    4. Resuspendeer de algenkorrel in 1 ml gefilterd zeewater door voorzichtig op en neer te pipetteren. Verdun indien nodig de algensuspensie om het tellen van de cellen te vergemakkelijken.
    5. Voer een celtelling uit met behulp van een hemocytometer onder een lichtmicroscoop door 10 μL toe te voegen aan een van de kamers. Voltooi 8-10 tellingen per monster.
      OPMERKING: Alternatieve methoden voor het tellen van de algencellen kunnen ook worden toegepast, indien beschikbaar (bijv. flowcytometrie, confocale microscopie met hoge doorvoer).
    6. Bereken de concentratie van de symbionte cellen (ml−1), rekening houdend met de gebruikte verdunningsfactoren.
  2. Bepaling van het eiwitgehalte
    1. Kwantificeer het eiwitgehalte van het monster (bijv. via de colorimetrische test van Bradford, zoals oorspronkelijk beschreven door Bradford et al.33, of de Lowry-test34,35, waarvan het protocol elders is beschreven voor cnidarians 36).
  3. Chlorofyl een extractie
    1. Gebruik een celkorrel van ~200.000 cellen, bevroren of vers.
    2. Breng elke algenkorrel over in 2 ml dimethylformamide (DMF) in een glazen scintillatieflacon en incubeer gedurende 48 uur in het donker bij 4 °C.
      OPMERKING: DMF is giftig en kankerverwekkend, dus de monstervoorbereiding moet worden voltooid onder een zo donker mogelijke zuurkast en op ijs. Als er < 200.000 cellen zijn, gebruik dan minder DMF.
    3. Centrifugeer gedurende 3 minuten op 16.000 × g.
    4. Breng 200 ml over in een UV-96-putplaat voor fotometrische metingen. Voer elk monster in drievoud uit met DMF als blanco.
    5. Meet de absorptie bij golflengten (E) 663,8 nm, 646 nm en 750 nm. Trek de extinctie bij 750 nm af van de extinctie bij beide andere golflengten.
      OPMERKING: Meten bij 750 nm corrigeert voor eventuele verstrooiing of troebelheid in het monster.
    6. Bereken de chlorofyl a-concentratie (μg/ml) met behulp van vergelijking (1):
      Chl a concentratie (μg/ml) = (12.00 × E 663.8) - (3.11 × E646.8) (1)

13. Kwantificering van de celbiomassa na metabolietextracties voor normalisatie

OPMERKING: Er zijn twee opties voor de kwantificering van celbiomassa die hieronder worden beschreven: de kwantificering van eiwit gerelateerd aan biomassa met behulp van een gemodificeerde Bradford-colorimetrische methode en de meting van het drooggewicht van celresten. Beide methoden zijn geschikt om te gebruiken, omdat beide een nauwkeurige kwantificering van de celbiomassa bieden.

  1. Eiwitgehalte van de celresten
    1. Resuspendeer de bevroren celresten met 1 ml 0,2 M NaOH en incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 98 °C.
    2. Koel de monsters ~10 minuten op ijs en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 3.000 × g bij een omgevingstemperatuur.
    3. Kwantificeer het eiwitgehalte van het monster (bijv. via de colorimetrische test van Bradford, zoals aanvankelijk beschreven door Bradford et al.33 en gewijzigd door Smart et al.37).
  2. Meting van het drooggewicht van celresten
    1. Resuspendeer de celresten van de intracellulaire metabolietextractie in dubbel gedestilleerd water (~10 ml).
    2. Filtreer de oplossing onder vacuüm met behulp van een voorgewogen membraanfilter (0,22 μm porie, 47 mm).
    3. Was de buizen met biomassa twee keer met ultrapuur water om de volledige overdracht van biomassa naar het membraanfilter te garanderen.
    4. Verwijder het membraanfilter met de biomassa en droog het af met een magnetron (laag vermogen; ~250 W gedurende 20 min).
    5. Bewaar het filtreerpapier een nacht in een exsiccator . Noteer het drooggewicht van het filtreerpapier en bereken het drooggewicht van de biomassa door het gewicht van het droge membraanfilter (met behulp van een schoon, droog membraanfilter dat naast het monsterfilter wordt gedroogd) af te trekken van het totale gewicht.

14. Data-analyse

  1. Analyseer metabolietdoelen met behulp van metabolietdatabases waarbij elk doelwit bestaat uit een kwantificator en een kwalificerende MRM.
  2. Inspecteer de gedetecteerde metabolietdoelen visueel en integreer ze indien nodig handmatig.
  3. Gebruik een metabolietpiekgebied om de relatieve abundantie van elk monster voor elke groep te berekenen. Waarden worden blanco gecorrigeerd en genormaliseerd om het interne standaard piekgebied te bemonsteren en vervolgens om het eiwitgehalte van celresten te bemonsteren volgens Smart et al.37.
  4. Gooi metabolieten met een relatieve standaarddeviatie van meer dan 35% in alle behandelingsgroepen weg (N = 23 metabolieten).
  5. Transformeer de gegevens (bijv. kubuswortel) en centreer ze; bevestigen een normale verdeling en homogeniteit van variantie.
  6. Voer de data-analyse uit (ANOVA en heatmap-constructie; bijv. met behulp van https://www.metaboanalyst.ca)38. Cluster de monsters om de variabiliteit binnen de behandeling te onderzoeken met behulp van de pakketten "cluster", "factoextra" en "klustR". Bereken de gap-statistiek (een methode om het optimale aantal clusters39 te bepalen) met behulp van de functie "clusGap" in R en zet uit met behulp van het R-pakket "tidyverse". Voer PERMANOVA's uit om de significantie in de scheiding tussen de metabolietprofielen van de behandeling te onderzoeken (bijv. in Primer).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Alle gegevens die tijdens deze werkzaamheden zijn geproduceerd, zijn beschikbaar in de aanvullende informatie.

Scheiding van gastheer en symbiont

figure-results-1
Figuur 1: Opzet en validatie van de scheiding van koraalgastheerweefsels en Symbiodiniaceae cellen. (A) De opstelli...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De scheiding van de gastheer en de symbiont is gemakkelijk en snel haalbaar via eenvoudige centrifugatie, en de resultaten hier laten zien dat het scheiden van de fracties waardevolle informatie kan opleveren die wijst op specifieke bijdragen van holobiont-leden, die kunnen bijdragen aan de functionele analyse van de gezondheid van koraal. Bij volwassen koralen wordt de lipidensynthese voornamelijk uitgevoerd door de residente algensymbiont40, die lipiden levert (bijv. triacylglycerol en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling om bekend te maken.

Dankbetuigingen

J.L.M. werd ondersteund door een UTS Chancellor's Research Fellowship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100% LC-grade methanolMerck439193LC grade essentieel
2 mL microcentrifugebuizen, PPEppendorf30121880Polypropyleen biedt hoge weerstand tegen chemicaliën, mechanische stress en extreme temperaturen
2030 Shimadzu gaschromatograafShimadzuGC-2030
710-1180 µm zuurgewassen glazen kralenMerck
G1152		Deze maat is optimaal voor het breken van de Symbiodiniaceae-cellen
AOC-6000 Plus Multifunctionele autosamplerShimadzuAOC6000
Bradford reagensMerckB6916Elk proteïne colorimetrisch reagens is acceptabel
PersluchtpistoolOzito6270636Soortgelijk ontwerp acceptabel. Het hebben van een fitting om een 1 mL tip over te passen is cruciaal.
 DB-5 kolom met 0,25 mm interne diameter kolom en 1 µm filmdikteAgilent122-5013
DMFMerckRTC000098
D-Sorbitol-6-13C en/of 13C5–15N ValineMerck605514/ 600148Een of beide interne standaarden kunnen aan het methanol worden toegevoegd.
Vlakbodem 96-well plateMerckCLS3614
Glazen scintillatiebuisjesMerckV713020 mL, met niet-plastic afdichting
Immunoglogin GMerck56834Als niet beschikbaar, Bovine Serum Albumin is acceptabel
Primerv4
Rv4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight softwarev3.6
NatriumhydroxideMerckS5881Pellets om 1 M oplossing te maken
tidyversev1.3.1R-pakket
TissueLyser LTQiagen85600Of vergelijkbaar
TQ8050NX triple quadrupole massaspectrometerShimadzuGCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plateGreinerM3812
Whirl-Pak monsterzakMerckWPB01018WAMonsterverzamelzak; Maat: groot genoeg om een ~5 cm koraalfragment te huisvesten, maar niet te groot dat het water te verspreid is

Referenties

  1. Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
  2. Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H. , Academic Press. Cambridge, MA. 211-229 (2022).
  3. Lawson, C. A., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M. , Springer. Cham, Switzerland. 179-202 (2022).
  4. LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
  5. Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
  6. Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
  7. Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
  8. Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
  9. Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
  10. Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
  11. Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336(2018).
  12. González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
  13. Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
  14. Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421(2021).
  15. Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601(2020).
  16. Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
  17. Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610(2021).
  18. Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
  19. Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687(2020).
  20. Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
  21. Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760(2018).
  22. Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
  23. Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
  24. Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
  25. Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433(2018).
  26. Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
  27. Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12(2018).
  28. Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
  29. Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
  30. Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176(2022).
  31. Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262(2020).
  32. Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  34. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  35. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  36. Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
  37. Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
  38. Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
  39. Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
  40. Chen, W. -N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
  41. Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
  42. Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
  43. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
  44. Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246(2021).
  45. Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
  46. Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
  47. Oakley, C., Davy, S. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. van Oppen, M., Lough, J. , Springer. Cham, Switzerland. 189-211 (2018).
  48. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  49. Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
  50. Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76(2021).
  51. Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Koraalholobiontscheiding van Symbiodiniaceaeextractie van metabolietenisolatie van koraalweefselmetabolietprofileringdetectie van biomarkersstressrespons van koraal
Gaschromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde gerichte metabolomics van harde koraalmonsters
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.