Gaschromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde gerichte metabolomics van harde koraalmonsters

Samenvatting

Hier presenteren we de extractie en bereiding van polaire en semi-polaire metabolieten uit een koraalholobiont, evenals gescheiden koraalgastheerweefsel en Symbiodiniaceae celfracties, voor gaschromatografie-massaspectrometrie-analyse.

Samenvatting

Op gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) gebaseerde benaderingen hebben bewezen krachtig te zijn voor het ophelderen van de metabole basis van de symbiose tussen cnidarian en dinoflagellaat en hoe koraal reageert op stress (d.w.z. tijdens temperatuurgeïnduceerde bleking). Steady-state metabolietprofilering van het koraalholobiont, dat de cnidarian-gastheer en de bijbehorende microben (Symbiodiniaceae en andere protisten, bacteriën, archaea, schimmels en virussen) omvat, is met succes toegepast onder omgevings- en stressomstandigheden om de holistische metabole status van het koraal te karakteriseren.

Om vragen over de symbiotische interacties te beantwoorden, is het echter noodzakelijk om de metabolietprofielen van de koraalgastheer en zijn algensymbionten onafhankelijk te analyseren, wat alleen kan worden bereikt door fysieke scheiding en isolatie van de weefsels, gevolgd door onafhankelijke extractie en analyse. Hoewel de toepassing van metabolomics relatief nieuw is in het koraalveld, hebben de aanhoudende inspanningen van onderzoeksgroepen geresulteerd in de ontwikkeling van robuuste methoden voor het analyseren van metabolieten in koralen, inclusief de scheiding van het koraalgastheerweefsel en algensymbionten.

Dit artikel presenteert een stapsgewijze handleiding voor holobiont-scheiding en de extractie van metabolieten voor GC-MS-analyse, inclusief belangrijke optimalisatiestappen ter overweging. We laten zien hoe, eenmaal onafhankelijk geanalyseerd, het gecombineerde metabolietprofiel van de twee fracties (koraal en Symbiodiniaceae) vergelijkbaar is met het profiel van het geheel (holobiont), maar door de weefsels te scheiden, kunnen we ook belangrijke informatie verkrijgen over het metabolisme van en interacties tussen de twee partners die niet alleen uit het geheel kan worden verkregen.

Inleiding

Metabolieten vertegenwoordigen de eindproducten van cellulaire processen, en metabolomics - de studie van de reeks metabolieten die door een bepaald organisme of ecosysteem worden geproduceerd - kan een directe maatstaf zijn voor^{het functioneren van} het organisme. Dit is met name van cruciaal belang voor het verkennen van ecosystemen, symbiotische interacties en herstelinstrumenten, aangezien het doel van de meeste beheerstrategieën is om specifieke ecosysteemdienstfuncties te behouden (of te herstellen)². Koraalriffen zijn een aquatisch ecosysteem dat de potentiële waarde van metabolomics aantoont voor het ophelderen va....

Protocol

OPMERKING: De experimentele opzet, monsterafname en opslag zijn elders in detail beschreven 2,30,31. Voorafgaand aan het verzamelen en experimenteren moet toestemming worden verkregen voor het verzamelen van wilde koralen. De monsters hier zijn verzameld van kolonies van Montipora mollis (groene kleur-morph) geïmporteerd uit Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), oorspronkelijk verzameld van een rif voor de kust van de Abrohlos-eilanden (West-Australië; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) op een diepte van 1 m onder de aquacultuurvergunning AQ1643. Voorafgaand aan de bemonster....

Resultaten

Alle gegevens die tijdens deze werkzaamheden zijn geproduceerd, zijn beschikbaar in de aanvullende informatie.

Scheiding van gastheer en symbiont

Figuur 1: Opzet en validatie van de scheiding van koraalgastheerweefsels en Symbiodiniaceae cellen. (A) De opstelli.......

Discussie

De scheiding van de gastheer en de symbiont is gemakkelijk en snel haalbaar via eenvoudige centrifugatie, en de resultaten hier laten zien dat het scheiden van de fracties waardevolle informatie kan opleveren die wijst op specifieke bijdragen van holobiont-leden, die kunnen bijdragen aan de functionele analyse van de gezondheid van koraal. Bij volwassen koralen wordt de lipidensynthese voornamelijk uitgevoerd door de residente algensymbiont⁴⁰, die lipiden levert (bijv. triacylglycerol en .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essentieel
2 mL microcentrifugebuizen, PP	Eppendorf	30121880	Polypropyleen biedt hoge weerstand tegen chemicaliën, mechanische stress en extreme temperaturen
2030 Shimadzu gaschromatograaf	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm zuurgewassen glazen kralen	Merck	G1152	Deze maat is optimaal voor het breken van de Symbiodiniaceae-cellen
AOC-6000 Plus Multifunctionele autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagens	Merck	B6916	Elk proteïne colorimetrisch reagens is acceptabel
Persluchtpistool	Ozito	6270636	Soortgelijk ontwerp acceptabel. Het hebben van een fitting om een 1 mL tip over te passen is cruciaal.
DB-5 kolom met 0,25 mm interne diameter kolom en 1 µm filmdikte	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C en/of 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Een of beide interne standaarden kunnen aan het methanol worden toegevoegd.
Vlakbodem 96-well plate	Merck	CLS3614
Glazen scintillatiebuisjes	Merck	V7130	20 mL, met niet-plastic afdichting
Immunoglogin G	Merck	56834	Als niet beschikbaar, Bovine Serum Albumin is acceptabel
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Natriumhydroxide	Merck	S5881	Pellets om 1 M oplossing te maken
tidyverse		v1.3.1	R-pakket
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Of vergelijkbaar
TQ8050NX triple quadrupole massaspectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak monsterzak	Merck	WPB01018WA	Monsterverzamelzak; Maat: groot genoeg om een ~5 cm koraalfragment te huisvesten, maar niet te groot dat het water te verspreid is