Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Screening op sferoïde geneesmiddelgevoeligheid in glioomstamcellijnen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65655

⸱

2 februari 2024

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

In vitro screening op de gevoeligheid van geneesmiddelen is een belangrijk hulpmiddel voor het ontdekken van combinaties van geneesmiddelen tegen kanker. Cellen die in bollen worden gekweekt, activeren verschillende signaalroutes en worden als meer representatief beschouwd voor in vivo modellen dan monolaagse cellijnen. Dit protocol beschrijft een methode voor in vitro screening van geneesmiddelen op sferoïde lijnen.

Samenvatting

In vitro screening op de gevoeligheid van geneesmiddelen is een belangrijk instrument bij de ontdekking van combinatietherapieën tegen kanker. Meestal worden deze in vitro medicijnscreenings uitgevoerd op cellen die in een monolaag worden gekweekt. Deze tweedimensionale (2D) modellen worden echter als minder nauwkeurig beschouwd in vergelijking met driedimensionale (3D) sferoïde celmodellen; Dit geldt met name voor glioomstamcellijnen. Cellen die in bollen worden gekweekt, activeren verschillende signaalroutes en worden als meer representatief beschouwd voor in vivo modellen dan monolaagse cellijnen. Dit protocol beschrijft een methode voor in vitro screening van sferoïde lijnen; Stamcellijnen van muizen en menselijk glioom worden als voorbeeld gebruikt. Dit protocol beschrijft een 3D sferoïde geneesmiddelgevoeligheids- en synergietest die kan worden gebruikt om te bepalen of een geneesmiddel of geneesmiddelcombinatie celdood induceert en of twee geneesmiddelen synergetisch werken. Glioom stamcellijnen worden gemodificeerd om RFP tot expressie te brengen. Cellen worden geplateerd in een lage aanhechting rond de onderste 96 platen en bollen worden 's nachts gevormd. Medicijnen worden toegevoegd en de groei wordt gevolgd door het RFP-signaal in de loop van de tijd te meten met behulp van het Incucyte live imaging-systeem, een fluorescentiemicroscoop die is ingebed in de weefselkweekincubator. De helft van de maximale remmende concentratie (IC50), de mediane letale dosis (LD50) en de synergiescore worden vervolgens berekend om de gevoeligheden voor geneesmiddelen alleen of in combinatie te evalueren. De driedimensionale aard van deze test zorgt voor een nauwkeurigere weerspiegeling van tumorgroei, gedrag en geneesmiddelgevoeligheden in vivo, en vormt zo de basis voor verder preklinisch onderzoek.

Inleiding

Glioblastoom is een verwoestend, hoogwaardig neoplasma van de hersenen met een totale overleving van 5% na vijfjaar1. Hoogwaardige gliomen (HGG) zoals glioblastoom vertegenwoordigen de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde mortaliteit in de pediatrische populatie2 en zijn ook een van de meest recalcitrante tumoren om bij volwassenen te behandelen3. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de moleculaire drijfveren van HGG, blijven de behandelingsopties beperkt3, wat de noodzaak benadrukt van screeningmethoden voor geneesmiddelen die therapeutische gevoeligheden in de kliniek nauwkeuriger voorspellen.

3D-celculturen zijn voornamelijk gebruikt voor het modelleren van fysiologisch relevant celgedrag4. Bovendien kan de 3D-architectuur van de micro-omgeving van de tumor in vitro worden gerecapituleerd door 3D-groeitesten op te stellen5. Sferoïde groei activeert ook verschillende signaalroutes en wordt daarom als meer representatief beschouwd voor in vivo modellen 6,7 in vergelijking met 2D-cultuur. Pediatrische HGG-stamcellen en onze NF1-glioomstamcellijnen van onze muis groeien van nature als neurosferen, en gebruikten deze NF1-glioomcellijnen van muizen in een medicijnscreening met gemiddelde doorvoer8. De pediatrische lijnen die hier worden gebruikt, zijn afgeleid van hemisferisch, middellijn en cerebellair pediatrisch HGG en werden verkregen van en volledig gekarakteriseerd door het Children's Brain Tumor Network (mutatie- en genexpressieprofielen)9. Deze lijnen werden gemodificeerd om een nucleair rood fluorescerend eiwit (RFP) tot expressie te brengen, waarmee proliferatie en overleving kunnen worden gevolgd met behulp van het Incucyte live beeldvormingssysteem. De intensiteit van het RFP-signaal is representatief voor het aantal aanwezige cellen. Andere fluoroforen, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP), kunnen ook worden gebruikt.

Combinatiechemotherapie voor acute lymfatische leukemie, lymfomen, epitheliale maligniteiten en vele andere vormen van kanker bij kinderen is een effectieve manier om tumoren uit te roeien en resistentie tegen geneesmiddelen tegen enkelvoudige middelen te voorkomen10,11. Er is echter beperkte informatie over welke middelen moeten worden gecombineerd om therapeutische gevoeligheden in HGG te bereiken, waardoor het gebruik van nauwkeurigere sferoïde modellen in in vitro medicijntesten wordt aangemoedigd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle protocolprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van het Children's Hospital of Philadelphia.

1. 3D sferoïde celbeplating

  1. Bereid glioomstamcelmedia voor: Om de basismedia te maken, voegt u 50 ml van het proliferatiesupplement en 5 ml van een 100x penicilline-streptomycine-oplossing (10.000 E/ml) toe aan het basale medium (500 ml). Om glioomstamcelmedia te maken, voegt u epidermale groeifactor (EGF) en basale fibroblastgroeifactor (bFGF) toe aan een uiteindelijke concentratie van respectievelijk 20 ng/ml en 10 ng/ml, volgens de beschrijving van de fabrikant.
    OPMERKING: Glioom stamcelmedia kunnen 1 week worden gebruikt bij opslag bij 4 °C.
  2. Dissociëren van cellen die RFP tot expressie brengen:
    OPMERKING: In dit voorbeeld wordt de muis NF1 HGG-stamcellijn 5746 gebruikt.
    1. Breng de glioombollen over in een conische buis van 15 ml en draai de glioombolletjes in een centrifuge (150 x g gedurende 5 min) naar beneden. Verwijder het bovenstaande en voeg 300 μl accutase toe aan de gedissocieerde bolletjes (incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C).
    2. Voeg 1 ml glioom stamcelmedia toe en verbreek de bolletjes door voorzichtig te pipetteren. Centrifugeer de gedissocieerde cellen gedurende 5 minuten bij 150 x g, aspireer supernatant op en los de pellet op in 1 ml glioomstamcelmedia.
  3. Meet de concentratie van cellen met behulp van een celteller of hemocytometer. Bij gebruik van een fluorescentiecelteller voegt u 18 μL van de celsuspensie toe aan 2 μL Acridine Orange/Propidium Iodide Stain. Laad 12 μL van deze suspensie in een hemocytometer om het aantal levende/dode cellen in de suspensie te tellen.
  4. Verdun de cellen tot een uiteindelijke concentratie van 2.000 cellen per 100 μL glioomstamcelmedia.
    OPMERKING: Wijzigingen in de celconcentratie kunnen cellijnafhankelijk zijn en kunnen dienovereenkomstig worden aangepast.
  5. Doseer met behulp van een meerkanaalspipet 100 μl van de celsuspensie (2.000 cellen per 100 μl) in elk putje van een lage bevestigingsplaat met 96 putjes met ronde bodem door omgekeerd pipetteren.
    OPMERKING: Gebruik lage bevestigingsplaten met ronde bodem; Deze platen stimuleren de vorming van een enkele glioombol in elk putje. Omgekeerd pipetteren voorkomt de vorming van bellen, die de beeldopname van het live-celanalysesysteem zullen verstoren.
  6. Centrifugeer de platen 5 minuten op 150 x g .
    OPMERKING: Centrifugatie is een cruciale stap om de vorming van een 3D-neurosfeer op gang te brengen.
  7. Incubeer een nacht om in elk putje een enkele bol te vormen.

2. Geneesmiddelen toevoegen voor synergietest (Figuur 1)

  1. Zorg ervoor dat elk putje van de plaat met 96 putjes een specifieke concentratie van zowel geneesmiddelen 1 als 2 krijgt. Maak een raster waarin elke concentratie van medicijn 1 wordt gecombineerd met elke concentratie van medicijn 2 in tweevoud.
  2. Maak een seriële verdunning van de twee geneesmiddelen waarvoor de synergie wordt bepaald (5 verdunningen van geneesmiddel 1 en 7 verdunningen van geneesmiddel 2) met behulp van de glioomstamcelmedia (Figuur 1A).
    OPMERKING: In dit onderzoek wordt een seriële verdunningsreeks van 50% gebruikt; Elke verdunningsreeks kan echter worden gebruikt.
    1. De verdunningsreeks moet 7x meer geconcentreerd zijn dan de gewenste eindconcentratie in elk putje. Als de hoogste eindconcentratie voor geneesmiddel 1 bijvoorbeeld 1 μM is, maakt u de eerste concentratie van de verdunningsreeks voor geneesmiddel 1, 7 μM (1 ml, buisje B of I in figuur 1A).
    2. Voeg 500 μl glioomstamcelmedia toe aan elke extra buis van de verdunningsreeks (buisjes C-H en J-M, zoals weergegeven in figuur 1).
    3. Om de verdunningsreeks te maken, aspireert u 500 μl van het geneesmiddelmengsel uit buis B of buis I en voegt u dit toe aan de volgende buis in de verdunningsreeks buis C of buis J (die respectievelijk 500 μl glioomstamcelmedia bevat). Meng goed en herhaal dit tot de volgende tube in de verdunningsreeks. Voer een DMSO-controle uit (buis A) en zorg ervoor dat de DMSO-concentratie onder alle omstandigheden hetzelfde is.
      OPMERKING: Wijzigingen in geneesmiddelconcentraties en verdunningsreeksen kunnen worden aangebracht. Zorg ervoor dat u de juiste geneesmiddelconcentraties vermeldt in aanvullend bestand 1 als de verdunningsreeks wordt gewijzigd.
  3. Voeg aan elk putje van de 96 putjes 20 μl geneesmiddel 1 en 20 μl geneesmiddel 2 toe door omgekeerd pipetteren, zoals weergegeven in figuur 1B, voor een eindvolume van 140 μl per putje; Geneesmiddelcombinaties worden in tweevoud geëvalueerd. Als u de meegeleverde downstream-analyse voor IC50 en LD50 gebruikt, gebruik dan de lay-out van het geneesmiddel zoals weergegeven in figuur 1B.
    1. In deze test wordt ook het effect van elk medicijn afzonderlijk (zonder dat het andere medicijn aanwezig is) gemeten. Zorg ervoor dat u 20 μL DMSO-controlemedia (buis A in figuur 1B) toevoegt aan die afzonderlijke medicijnputjes om het uiteindelijke volume van elk putje op 140 μl te brengen.
    2. Zorg ervoor dat de putjes geen bubbels bevatten, omdat dit de beeldvorming beïnvloedt.
      OPMERKING: Wijzigingen aan het uiteindelijke deel kunnen worden aangebracht; Zorg er echter voor dat u de concentraties in punt 2.2 aanpast.
  4. Plaats de platen in de live imager en bewaak de groei van elke bol in elke put met behulp van de sferoïde-module, instelling voor één bol, waarbij zowel helderveld als RFP worden afgebeeld met een vergroting van 4x.
  5. Monitor de platen gedurende 72 uur en bekijk elk putje van de plaat met een regelmatig tijdsinterval, meestal 2 uur.
    OPMERKING: Upload een correcte plaatkaart; dit zorgt voor een goede downstream-analyse (Figuur 1C).

3. Berekening van IC50, LD50 en synergiescore (Figuur 2 en Figuur 3)

  1. Analyseer de RFP-intensiteit voor elke put en elk tijdstip met behulp van de live imager-software. De gebruikte analyseparameters staan vermeld in de aanvullende bestanden (aanvullend bestand 2).
    OPMERKING: Verschillende analyseparameters kunnen naar wens worden gebruikt.
  2. Exporteer de RFP-gegevens als Total Red Integrated RFP-intensiteit voor elke put en zorg ervoor dat u de onbewerkte niet-gegroepeerde gegevens exporteert (Figuur 2A).
    OPMERKING: Als u het meegeleverde sjabloon (aanvullend bestand 1) gebruikt om IC50 en LD50 te berekenen, is het essentieel om u te houden aan punt 3.2
  3. Bepaal het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elke geneesmiddelcombinatie van (1) de vouwverandering in vergelijking met alleen DMSO (voor deze berekening zijn de 0 h-waarden niet nodig) en (2) de Log2 van vouwverandering ten opzichte van 0 uur door de onbewerkte gegevens in het meegeleverde Excel-blad te plakken (Figuur 2B en zie voorbeeld in aanvullend bestand 1).
  4. Pas de maximale concentratie van drugs 1 en 2 in de spreadsheet aan (Figuur 2B).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de concentraties van geneesmiddelen 1 en 2 aanpast; anders worden onjuiste LD50- en IC50-waarden berekend.
  5. Bereken IC50-waarden met behulp van een geschikte softwaretoepassing voor gegevensanalyse (hier wordt GraphPad gebruikt). Gebruik voor de berekening van de IC50-waarde de gemiddelde vouwverandering en standaarddeviatievouwverandering in vergelijking met DMSO alleen bepaald in stap 3.4, en kopieer de IC50-tabellen van geneesmiddelen 1 en 2 naar de data-analysesoftware (Log(remmer) vs. genormaliseerde respons, variabele helling) (Figuur 3A).
    1. Gebruik voor de IC50-berekeningen alleen gegevens van putten waaraan een enkel onderdeel is toegevoegd. Gebruik de Log medicijnconcentratiewaarden in de data-analysesoftware, die automatisch worden berekend in de meegeleverde spreadsheet.
  6. Bereken synergiescore:
    1. Gebruik alleen de gemiddelde vouwverandering ten opzichte van DMSO van elke combinatie om de synergiescore te berekenen met behulp van een softwarepakket of website. Bijvoorbeeld https://synergyfinder.fimm.fi/ 12 (parameters: LL4-curve, ZIP-methode voor het berekenen van de synergiescore). Aanvullend bestand 1 berekent automatisch de waarden die nodig zijn om de synergie-invoertabel te maken die kan worden geüpload naar SynergyFinder (Figuur 3B). Een voorbeeld van de synergie-invoertabel wordt gegeven in Aanvullend Bestand 3.
      OPMERKING: Een score boven de 10 staat voor synergie, een score onder de -10 voor antagonisme en een waarde tussen -10 en 10 duidt op additieve effecten.
  7. Bereken de LD50 score:
    1. Bereken voor elke concentratie van medicijn 1 de LD50 van medicijn 2. Het aanvullende bestand berekent automatisch de Log2-waarde en standaarddeviatie voor elke concentratie (Figuur 3C).
    2. Voer het gemiddelde en de standaarddeviatie van de Log2-vouwverandering in ten opzichte van 0 uur, evenals het aantal replicaten in de data-analysesoftware (in deze studie 2,) en bereken de LD50-waarde en LD50-standaarddeviatie door de concentratie bij -1 te bepalen (Log2 = -1 staat voor de log2-waarde waarvoor 50% van het signaal verloren gaat in vergelijking met 0 uur). Gebruik in deze berekeningen het model Log(remmer) vs. respons, variabele helling 4 parameters.
      OPMERKING: De software voor gegevensanalyse berekent niet automatisch de geneesmiddelconcentratie die overeenkomt met een log2 = -1-waarde; deze waarde kan echter worden toegevoegd aan de gerapporteerde berekeningen van de data-analysesoftware als een door de gebruiker gedefinieerde vergelijking (Figuur 3C). Zorg ervoor dat u de Log-concentratiewaarden in de gegevensanalysesoftware gebruikt, die automatisch worden berekend in de meegeleverde spreadsheet. Aanvullend bestand 4 toont de IC50- en LD50-panelen in de GraphPad-software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als voorbeeld werd de synergie van Trametinib (MEK-remmer) en GDC-0941 (PI3K-remmer), die twee RAS-downstream-effectorroutes in glioomstamcellijn 5746 (RFP-expressie) remmen, geëvalueerd (Figuur 4). Figuur 4A toont dezelfde bol op 0 uur en 72 uur behandeld met een combinatie van Trametinib en GDC-0941. Deze beelden zijn rechtstreeks vanuit de live imager-software geëxporteerd. IC50 en LD50 zijn berekend zoals beschreven in Graph...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft de 3D-screeningstests voor geneesmiddelen die effectief zijn gebruikt om kwetsbaarheden voor geneesmiddelen in sferoïde modellen van glioom8 te beoordelen. Dit 3D sferoïde testsysteem is speciaal ontworpen om een nauwkeuriger preklinisch onderzoek mogelijk te maken van combinatorische chemotherapieën voor glioomcellijnen die in bolletjes worden gekweekt. Voor HGG biedt deze methode een kader voor het identificeren van potentiële kwetsbaarhe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL centrifugebuizenCELLTREAT22941115 mL polypropyleen centrifugebuizen, sterieel
96- well plateS-bioMS9096UZ96-well ronde bodem ultra-lage aanhechtingsplaat
AccutaseSTEMCELL Technologies7922Cel losmakingsoplossing
Acridine Orange/Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001Live/dead kleur voor celtelling
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2Human recombinant bFGF
CeltellerLogos BiosystemsL20001LUNA-FL Dual Fluorescerende Celteller
CentrifugeEppendorf5810RCentrifugeren van cellen en platen
DMSOPierce20688oplosmiddel voor verbindingen
EGFSTEMCELL Technologies78006.2Human recombinant EGF
EppendorfbuizenCostar07-200-534Microcentrifugebuizen
ExcelMicrosoftMicrosoft excel
GDC-0941SelleckchemS1065Medicijn 1
GraphPadGraphPadGraphPad Prism 9Berekening van IC50 en LD50
HemocytometerLogos BiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3Fluorescentiemicroscoop ingebed in de weefselkweekincubator die elke put op specifieke tijdsintervallen afbeeldt.
Incucyte softwareSartoriusIncucyte 2022BAnalyse van proliferatiegegevens
MediaSTEMCELL Technologies5702NeuroCult (Muis en Rat) proliferatiekit met basaal medium en groeisuplement
Penicilline-StreptomycineGibco15140122Antibiotica om aan media toe te voegen
TrametinibSelleckchemS2673Medicijn 2

Referenties

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013-2017. Neuro-Oncology. 22 (22 Suppl 2), v1-v95 (2020).
  2. Jones, C., et al. Paediatric and adult malignant glioma: close relatives or distant cousins. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (7), 400-413 (2012).
  3. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacological Research. 171, 105780(2021).
  4. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Molecular Oncology. 1 (1), 84-96 (2007).
  5. Lv, D., et al. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  6. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  7. Kim, H., et al. Changes in global gene expression associated with 3D structure of tumors: an ex vivo matrix-free mesothelioma spheroid model. PLoS One. 7 (6), e39556(2012).
  8. Dougherty, J., et al. Identification of therapeutic sensitivities in a spheroid drug combination screen of Neurofibromatosis Type I associated high grade gliomas. Plos One. 18 (2), e0277305(2023).
  9. Ijaz, H., et al. Pediatric high-grade glioma resources from the Children's Brain Tumor Tissue Consortium. Neuro Oncology. 22 (1), 163-165 (2020).
  10. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Jr Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews. Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  11. Al-Lazikani, B., et al. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era. Nature Biotechnology. 30 (7), 679-692 (2012).
  12. Ianevski, A., et al. SynergyFinder 3.0: an interactive analysis and consensus interpretation of multi-drug synergies across multiple samples. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W739-W743 (2022).
  13. Ledur, P. F., et al. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  14. Sazonova, E. V., et al. Drug toxicity assessment: cell proliferation versus cell death. Cell Death Discovery. 8 (1), 417(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Sferoïde drugscreeninggliomastamcellendruggevoeligheidsassay3D-celmodellencombinatietherapie met geneesmiddelencelstervingsassaysynergiescoreRFP-expressielive-imagingIC50-berekening

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.