Multiplex-immunohistochemische analyse van het ruimtelijke immuuncellandschap van de micro-omgeving van de tumor

Samenvatting

Dit protocol beschrijft in detail hoe immuuncelkarakterisering van de micro-omgeving van de tumor met behulp van multiplex immunohistochemie wordt uitgevoerd.

Samenvatting

Het immuuncellandschap van de micro-omgeving van de tumor bevat mogelijk informatie voor de ontdekking van prognostische en voorspellende biomarkers. Multiplex-immunohistochemie is een waardevol hulpmiddel om verschillende soorten immuuncellen in tumorweefsels te visualiseren en te identificeren met behoud van de ruimtelijke informatie. Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor het analyseren van lymfocyten-, myeloïde en dendritische celpopulaties in weefselsecties. Beginnend met het snijden van in formaline gefixeerde paraffine ingebedde secties, automatische multiplexkleuringsprocedures op een geautomatiseerd platform, het scannen van de objectglaasjes op een multispectrale beeldmicroscoop, tot de analyse van afbeeldingen met behulp van een in-house ontwikkeld machine learning-algoritme ImmuNet. Deze protocollen kunnen worden toegepast op een verscheidenheid aan tumormonsters door simpelweg tumormarkers te verwisselen om immuuncellen in verschillende compartimenten van het monster te analyseren (tumor versus invasieve marge) en analyse van de dichtstbijzijnde buur toe te passen. Deze analyse beperkt zich niet tot tumormonsters, maar kan ook worden toegepast op andere (niet-)pathogene weefsels. Verbeteringen aan de apparatuur en de workflow in de afgelopen jaren hebben de doorlooptijden aanzienlijk verkort, wat de toekomstige toepassing van deze procedure in de diagnostische setting vergemakkelijkt.

Inleiding

Immuuncellen spelen een cruciale rol bij de bescherming tegen ziekteverwekkers zoals virussen en bacteriën, maar ook tegen^{kankercellen1}. Daarom is het immuunsysteem binnen de tumormicro-omgeving (TME) veelbelovend voor het ontdekken van prognostische en voorspellende biomarkers². Immuuncelinfiltraten zijn gecorreleerd met de prognose bij verschillende soorten kanker, hoewel dit nog niet is geïmplementeerd in de klinische zorg ^3,4. Bij de meeste tumortypen zijn hoge aantallen cytotoxische T-cellen en T-helper 1-cellen en/of lage aantallen regulerende T-cellen gekoppeld aan goede prognoses. Er worden inspanningen geleverd om een zogenaamde "Immunoscore" op te nemen in de TNM-stadiëring van colorectale kanker, waardoor het wordt omgezet in TNM-I-stadiëring ^5,6. De Immunoscore wordt afgeleid van het totale aantal T-cellen (gedetecteerd met CD3) en cytotoxische T-cellen (gedetecteerd met CD8) in twee verschillende tumorregio's: de tumorkern versus de invasieve marge (IM) van tumoren. Er is ook voorgesteld dat de Immunoscore van prognostische waarde is bij andere soorten kanker, zoals melanoom, longkanker en borstkanker 6,7,8,9. Bovendien kunnen immuuncelinfiltraten ook correleren met de respons op immunotherapie met checkpointblokkade¹⁰. Deze voorspellende biomarkers moeten echter worden gevalideerd in prospectieve studies voordat ze routinematig in de klinische praktijk kunnen worden geïmplementeerd. Bovendien is ook gesuggereerd dat een enkele biomarker onvoldoende zal zijn voor een zinvolle voorspelling¹¹. Daarom is het maken van een volledige kaart van een patiëntmonster door het combineren van verschillende biomarkers voorgesteld als een uitgebreidere voorspellende biomarker in een zogenaamd "kankerimmunogram"¹².

Van de methoden voor het bestuderen van immuuncellen binnen de TME is de oudste en meest bekende techniek immunohistochemie (IHC), die routinematig wordt gebruikt voor diagnostische tests bij verschillende ziekten, met name^kanker13. Deze techniek was lange tijd beperkt tot het gebruik van één of slechts enkele markers¹⁴ en werd daarom in onderzoeksomgevingen weggeconcurreerd door andere technieken zoals flowcytometrie en genexpressieprofilering (GEP). De met formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) tumorweefsels die doorgaans worden gebruikt in routinediagnostiek en onderzoek zijn echter niet (optimaal) geschikt voor flowcytometrie en GEP. Hoewel GEP en flowcytometrie veel inzicht geven in het fenotype en de functie van cellen, is het gebrek aan ruimtelijke informatie een groot nadeel. Daarom kan heterogeniteit binnen een steekproef, zoals verschillen in door immuuncellen geïnfiltreerde versus immuuncel-uitgesloten gebieden van een tumor, onopgemerkt blijven¹⁵. Er zijn nieuwe platforms ontwikkeld voor multiplexanalyse van FFPE-weefsels, zoals multiplex IHC, beeldvormende massacytometrie en CO-detectie door indEXing (CODEX) die kunnen worden gebruikt om meerdere markers tegelijkertijd te detecteren binnen een weefselsectie¹⁶. Immuuncellen in de TME worden uitgebreid bestudeerd om de beste biomarkers voor immunotherapie te vinden. Multiplextechnieken en geautomatiseerde beeldanalyse vormen echter hun eigen hindernissen.

Ons laboratorium heeft uitgebreide ervaring met multiplex IHC-kleuring met behulp van de Opal/Tyramide signaalversterking (TSA) methode en heeft dit geautomatiseerd op een IHC-platform (zie de Materiaaltabel)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28^, 29,30,31. We hebben immuuncelpanels geoptimaliseerd voor de detectie van verschillende subsets van lymfocyten, myeloïde cellen en dendritische cellen (DC's). Weefsels die dichte immuuncelgebieden bevatten - voor lymfocyten of complexe celmorfologieën (d.w.z. myeloïde cellen en DC's) - zijn bijzonder moeilijk te analyseren, met het risico dat het aantal aanwezige immuuncellen wordt over- of onderschat. Om dit probleem op te lossen, werd ImmuNet-analysesoftware ontwikkeld door onze groep³², en deze machine-learningpijplijn verbeterde de kwaliteit van de detectie van deze verschillende soorten immuuncellen enorm. Een gedetailleerd protocol van het verkrijgen van het FFPE-materiaal tot de analyse van immuunceldichtheden in verschillende weefselcompartimenten en afstanden tussen immuunceltypen wordt hier beschreven.

Dit protocol schetst hoe de multiplex IHC-panelen worden uitgevoerd in het Radboud Universitair Medisch Centrum sinds de implementatie van de digitale pathologiebeeldvormer in 2022. De beschreven multiplex IHC-panels kunnen worden gebruikt voor verschillende carcinomen (bijv. long, prostaat, colorectaal, blaas, borst) met behulp van een pancytokeratine-antilichaam als tumormarker of voor melanoom met het gebruik van melanocyt-geassocieerde antilichamen als tumormarkers. Deze multiplex IHC-protocollen zijn zorgvuldig geoptimaliseerd wat betreft de concentratie van primaire antilichamen, fluorofoorcombinaties en de volgorde van de kleuringsprocedure. Wij en anderen hebben multiplex IHC-paneeloptimalisatie eerder beschreven 17,33,34,35. Multiplex IHC-panelen kunnen worden aangepast, maar de beschreven analysepijplijnen moeten worden geëvalueerd en mogelijk dienovereenkomstig worden aangepast of opnieuw worden getraind. De beschreven zevenkleurige multiplex IHC-protocollen maken gebruik van de Opal-fluoroforen Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 en 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), zodat eenvoudig ontmengen en snel scannen op de imager mogelijk is met "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence" (MOTiF). Kleuring en scannen met negen kleuren wordt in dit protocol niet beschreven, omdat dit nog meer fijnafstemming van de experimentele opstelling vereist en een andere scanmodus op de imager die gebruik maakt van het afstembare filter met vloeibare kristallen.

Protocol

Patiëntenmateriaal dat voor dit protocol wordt getoond, maakte deel uit van een eerder uitgevoerd onderzoek en werd officieel vrijgesteld van medisch-ethische goedkeuring door de lokale Radboudumc Medisch Ethische Commissie in overeenstemming met de Nederlandse wetgeving (dossiernummer 2017-3164)³⁰.

1. Verzameling van FFPE-materiaal, selectie van blokken en voorbereiding van monsters

1. Haal FFPE-blok-ID's op uit patiëntendossiers via behandelend artsen of pathologen. Controleer met de lokale regelgeving of ethische toestemming vereist is.
2. Vraag FFPE-blokkades aan bij het lokale pathologiearchief of externe ziekenhuizen.
   OPMERKING: Het is ook mogelijk dat er tumormateriaal of een biopsie wordt verkregen voor een bepaald onderzoek. Dit kan het geval zijn voor kleine klinische proeven of dierstudies. In deze gevallen kan de verwerking van het weefselmonster de verantwoordelijkheid van de onderzoeker zijn.
3. Als er meerdere FFPE-blokkades beschikbaar zijn, selecteer dan het meest representatieve FFPE-blok dat levensvatbaar tumorweefsel bevat, bij voorkeur met omringend stromaal weefsel aanwezig door de met hematoxyline en eosine (HE) gekleurde objectglaasjes te beoordelen (Figuur 1).
   OPMERKING: Het is aan te raden om voor deze selectie een deskundig advies in te winnen (bijv. een patholoog). Het is mogelijk dat HE's niet beschikbaar zijn voor beoordeling van de inhoud van een FFPE-blok en dat er nieuwe moeten worden gemaakt voor de selectie. Ga naar sectie 2 voor een beschrijving.
4. Knip FFPE-linten van 4 μm dikte op een microtoom.
   OPMERKING: De dikte kan tussen 1 μm en 6 μm liggen zonder merkbare vlekkeneffecten; 4 μm is echter de meest standaard.
5. Monteer de monsters op glasplaatjes op een positie die gunstig is voor de fluïditeit van de autostainer (Figuur 2A-C) met behulp van een van de hieronder beschreven methoden:
   1. Leg de secties op het oppervlak van gedestilleerd water van 40 °C in een waterbad om ze uit te rekken en neem ze op met een glasplaatje.
      OF
      Plaats de glasplaatjes op een verwarmingsplaat van 40 °C en bedek de plek waar het gedeelte op de plaat moet worden gemonteerd met een druppel gedestilleerd water. Plaats het gedeelte met een tang op deze druppel en laat het uitrekken. Absorbeer gedestilleerd water met keukenpapier en verwijder overtollig water door op de dia te tikken.
      OPMERKING: Als weefselsecties te dicht bij het label van het objectglaasje worden geplaatst, zal dit resulteren in suboptimale kleuring (Figuur 2D,E). We hebben de neiging om 6-10 glasplaatjes per monster te monteren om de verschillende multiplex IHC-panelen uit te voeren en om een back-up te hebben.
6. Laat de gemonteerde glasglaasjes 1 uur of een nacht drogen bij 56 °C of een nacht bij 37 °C.
7. Gebruik de gemonteerde glasplaatjes voor het experiment of bewaar deze in dozen bij 4 °C.
   OPMERKING: In onze ervaring tot nu toe kunnen deze gemonteerde objectglaasjes jaren worden bewaard voordat multiplex IHC-kleuring wordt uitgevoerd.

2. Het genereren van met hematoxyline en eosine bevlekte objectglaasjes

NOTITIE: Alle volgende stappen van hoofdstuk 2 moeten worden uitgevoerd in een zuurkast.

1. Deparaffineer objectglaasjes in xyleen (2 x 5 min).
2. Rehydrateren in ethanol (99,6% 1 x 5 min; 95% 1 x 5 min; 70% 1 x 2 min). Of dompel de objectglaasjes 3x in 99,6% ethanol.
3. Was de glaasjes in gedestilleerd water (2 min).
4. Kleuring van de kernen met hematoxyline (10 min).
5. Was de glaasjes met gedistilleerd H₂O (5 min).
6. Kleuring de objectglaasjes met eosine (5 min).
7. Dehydrateer de objectglaasjes door ze 3x in 99,6% ethanol te dippen.
8. Dompel de glaasjes 2x in xyleen.
9. Voeg een paar druppels montagemedium toe en sluit af met een dekglaasje.
10. Laat de glaasjes uitharden en haal de glaasjes uit de zuurkast als alle chemicaliën zijn verdampt.

3. Uitvoeren van monoplex en multiplex IHC in de autostainer

1. Bereken hoeveel reagens er nodig is, afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden gekleurd.
   OPMERKING: Per run heeft de autostainer een capaciteit van 30 objectglaasjes en heeft ~18 uur nodig om het multiplex IHC-protocol met zes antilichamen te voltooien. Wanneer er meer objectglaasjes gekleurd moeten worden, kunnen er elke avond van de (werk)week meerdere batches in worden gedaan; 4 avonden van 30 dia's = 120 dia's per week.
   1. Bereid aan het begin van de week alle benodigde reagentia voor. Het autostainersysteem doseert 150 μL reagens per objectglaasje. Gebruik de titratiecontainers van 6 ml voor antilichaam- en opaalreagentia en de containers van 30 ml voor het blokkerende reagens en het secundaire antilichaam-mierikswortelperoxidase.
      OPMERKING: De containers van 6 ml hebben handige inzetstukken die gemakkelijk kunnen worden verwijderd en indien nodig kunnen worden vervangen. Bij reagensberekeningen moet men rekening houden met het dode volume van 1,6 ml of 300 μl voor respectievelijk de 30 ml-container of de 6 ml-titratiecontainer.
   2. Verdun alle opaalfluoroforen en digoxigenine (DIG) 1:100 in het meegeleverde verdunningsmiddel; verdun Opal780 1:25 in het antilichaamverdunningsmiddel. Verdun alle primaire antilichamen in antilichaamverdunningsmiddel, met verdunningen gespecificeerd in aanvullend dossier 1.
2. Om dit protocol te volgen, voert u monoplex IHC (Supplemental File 2) uit op objectglaasjes die zowel amandelcontroleweefsel als andere (tumor)weefseltypes bevatten die van belang zijn voordat u begint met het eigenlijke multiplex IHC-experiment om er zeker van te zijn dat alle reagentia goed zijn voorbereid.
   OPMERKING: Monoplex IHC duurt ~3,5 uur en kan voor het einde van die dag worden gecontroleerd op signaalpatronen en intensiteit. Als bepaalde signalen te zwak zijn (figuur 3), kunnen aanpassingen aan de reagentia worden gedaan.
3. Voor autofluorescentiecorrectie maak je een objectglaasje met (tumor)weefsel dat autofluorescerende structuren bevat, zoals bloed en collageen. Bereid dit objectglaasje gelijktijdig voor met monoplex IHC-objectglaasjes, maar met een blokkerend reagens ter vervanging van het antilichaam en de opalreagentia (aanvullend bestand 3).
   OPMERKING: In principe kan zo'n objectglaasje worden hergebruikt voor multispectrale beeldvorming totdat de autofluorescentiecorrectie niet meer optimaal is. Bij sterk autofluorescerende weefsels, zoals de hersenen en de lever, is het echter raadzaam om dat weefsel te gebruiken voor de autofluorescentiecorrectie.
4. Laad bij elke multiplex IHC-run 29 monsters in het autostainer-systeem met één controleweefselglaasje om de prestaties van elke multiplex IHC-run te controleren.
5. Download multiplex IHC-protocollen van de website van de autostainer onder het tabblad Downloads en pas ze aan zodat ze passen op elk op maat gemaakt multiplex IHC-paneel³⁶. Voor multiplex IHC, zie Aanvullend Bestand 4 voor het protocol en voor aangepaste multiplex IHC-panelen, zie Aanvullend Bestand 1.
6. Na voltooiing van het kleuringsprotocol haalt u de objectglaasjes uit de autostainer en plaatst u ze in een bak met wasbuffer.
7. Om besmetting van het autostainersysteem met DAPI te voorkomen, aangezien de monsters al in zeer lage concentraties zijn gekleurd, dient u DAPI handmatig aan te brengen voordat u de objectglaasjes afdekt met dekglaasjes. Voeg twee druppels DAPI per ml wasbuffer toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   OPMERKING: Voor het bouwen van spectrale bibliotheken is het belangrijk dat er geen DAPI-kleuring in de monsters zit. Eén druppel DAPI per ml wasbuffer en 10 minuten incubatie bij RT is ook mogelijk.
8. Was de glaasjes 3x met wasbuffer.
9. Leg de glaasjes op keukenpapier en tik de overtollige wasbuffer van de glaasjes.
10. Pipetteer een paar druppels montagemedium op het weefsel.
11. Plaats een glazen dekglaasje voorzichtig op het montagemedium om het glaasje schuin af te dekken om luchtbellen te voorkomen.
12. Verwijder overtollig montagemedium en luchtbellen door voorzichtig met een tang of een schone pipetpunt op het glazen dekglaasje te drukken.
13. Laat de objectglaasjes ~24 uur met rust voordat het montagemedium stolt, hetzij horizontaal op een microscopie-diabord of laad ze rechtstreeks in de microscoop voor beeldvorming.
14. Nadat het montagemedium is gestold of nadat de objectglaasjes zijn afgebeeld, bewaart u de objectglaasjes in microscopiedozen bij 4 °C.

4. Beeldvorming met behulp van de digitale pathologiebeeldcamera en annotatie van scanbestanden

1. Schakel de imager in door op de aan/uit-knop aan de rechterkant van de machine te drukken. Start na minimaal 20 s de software op.
   NOTITIE: Wacht 20 s om de hardware correct op te starten.
2. Laad de glaasjes per vier glaasjes in de cassettes.
   1. Optioneel: Voer de dia's in een .csv bestand in waarvoor een sjabloon kan worden gedownload (aanvullend bestand 5). Om het .csv bestand in het programma te laden, slaat u het op in C:\Users\Public\Akoya\VectraPolaris\States.
      OPMERKING: Er kunnen maximaal 20 cassettes of 80 dia's tegelijkertijd worden geladen.
3. Referentie-instellingen
   1. Open Check Dashboard vanuit het hoofdmenu.
      OPMERKING: Een cassette met referentiedia's wordt door de fabrikant geleverd en kan optioneel permanent in sleuf 20 worden bewaard.
   2. Stel de helderveldreferenties eenmaal per week in op de meegeleverde dia volgens de instructies van de fabrikant (duurt enkele minuten).
   3. Stel de fluorescentiereferenties eenmaal per maand in op het meegeleverde glaasje volgens de instructies van de fabrikant (duurt meer dan 1 uur).
4. Het maken of aanpassen van het protocol
   1. Ga terug naar het hoofdmenu en klik op Protocol bewerken om een protocol te maken.
   2. Klik op Nieuw... en selecteer Fluorescentie als Beeldvormingsmodus, Multispectrale diascan en Opal Polaris 5, 6 en 7 kleur onder de optie Kleuring .
   3. Geef het protocol een naam onder Protocolnaam en sla het op onder een onderzoek door een onderzoek te selecteren uit Beschikbare onderzoeken of maak een onderzoek aan onder Nieuwe studie maken | Naam van de studie.
   4. Eindig door Protocol maken te selecteren.
   5. Gebruik voor dit type scannen alleen de instellingen voor multispectrale diascans in het linkervenster; negeer het venster aan de rechterkant Multispectrale veldinstellingen.
   6. Scan de dia's met verschillende vergrotingen. Als u dit protocol wilt volgen, scant u met een vergroting van 20x door de pixelresolutie op 0,50 μm (20x) te laten.
   7. Stel de belichtingstijden in door Scanbelichting te selecteren.
   8. Laad de cassette waarin de dia's worden bewaard door de juiste sleuf te selecteren onder de optie Lastdrager .
   9. Als u door de dia's wilt navigeren, selecteert u Overzicht maken om een overzichtsafbeelding te verkrijgen van de drager met de dia's nadat de drager is geladen. Om dit automatisch in of uit te schakelen, klik je op het tandwielpictogram rechtsboven, ga je naar Voorkeuren..., en vink je de optie aan of uit onder Navigatie Overzicht Afbeelding om Automatisch beelddrager bij het laden voor interactieve taken in te schakelen.
   10. Stel de belichtingstijden per filter in op de bijbehorende monoplex IHC-kleurplaten door Scan belichtingen instellen te selecteren en verschillende plekken met een positief signaal te zoeken. Stel handmatig scherp of gebruik Autofocus en selecteer Automatisch belichten nadat u bent overgeschakeld naar het compatibele filter voor dat signaal. Selecteer de laagste belichtingstijd om overbelichting te voorkomen en maak snapshots van elke dia ter referentie nadat alle belichtingstijden zijn ingesteld (Afbeelding 3).
       OPMERKING: Negeer de optie Veldbelichting instellen voor dit type scan.
   11. Stel de belichtingstijden op een multiplex gekleurd objectglaasje in door alle filters op een paar locaties met een positief signaal te controleren. Verkort de laagste automatische belichtingstijd met 10% om overbelichting te voorkomen en maak een paar snapshots nadat alle belichtingstijden zijn ingesteld.
   12. Maak snapshots van het ongekleurde objectglaasje voor autofluorescentiecompensatie met behulp van het filter Voorbeeld-AF om te navigeren (Afbeelding 3H).
       OPMERKING: Locaties met erytrocyten en collageenstructuren zijn van belang. De belichtingstijd van het Opal480-filter moet mogelijk worden verkort voor sterke autofluorescerende gebieden. Als het signaal van Opal480 sterk genoeg is, moet het nog steeds goed gescheiden zijn (zie hoofdstuk 6) van de autofluorescerende structuren vanwege de implementatie van het gepatenteerde Sample AF-filter.
   13. Beoordeel de kwaliteit van de kleuring en beeldvorming met behulp van de software (zie secties 5 en 6; Figuur 4, aanvullend bestand 6: aanvullende figuur S1 en aanvullende figuur S2).
   14. Selecteer de knop Opslaan... om ervoor te zorgen dat het protocol en de aangepaste belichtingstijden in het protocol worden opgeslagen.
       OPMERKING: Wanneer het protocol al is opgeslagen, wordt er tot nu toe geen extra melding van niet-opgeslagen aanpassingen gegeven door de software.
5. Automatisch scannen van dia's
   1. Ga terug naar het hoofdmenu en klik op Dia's scannen om de dia's te scannen.
   2. Voer handmatig dianamen/ID's en bijbehorende taken en protocol in onder Taken configureren of automatisch vanuit het eerder gemaakte .csv bestand met Load Setup.
   3. Klik op Scannen om het scannen te starten.
   4. Wacht tot er een venster verschijnt om de scaninstellingen op te slaan. Klik op Opslaan om de standaardinstellingen te gebruiken en te beginnen met scannen.
      OPMERKING: Scannen met deze methode duurt ~10-20 minuten per dia. Afhankelijk van het aantal dia's kan het scannen tot een hele dag duren.
   5. Controleer of het scannen van de dia's voor alle dia's is gelukt door te zoeken naar eventuele foutmeldingen. Als u wilt weten of het scannen is gelukt, zoekt u naar een opgeslagen Akoya-scanbestand (.qptiff) van de scan en het volledige weefsel in de scan.

5. Annotatie van gegevens met behulp van de diaviewer

1. Ga terug naar het hoofdmenu en klik op Launch Phenochart om de diaviewer te openen.
2. Als de scanbestanden niet direct zichtbaar zijn, geef dan hun locatie aan door eerst op het tandwielpictogram in de rechterbovenhoek te klikken, ga naar Browserlocatie wijzigen... en selecteer willekeurig een van de .qptiff-bestanden van de gewenste dataset.
   OPMERKING: Gegevens worden standaard opgeslagen op D:\Data\VectraPolaris.
3. Laad een dia door deze te selecteren en in de rechterbovenhoek op Laden te klikken of door erop te dubbelklikken.
4. Log in door op de knop Inloggen in de rechterbovenhoek te klikken.
   OPMERKING: De gebruikersnaam kan alleen de initialen of naam zijn en wordt gebruikt om bij te houden wie welke aantekeningen heeft gemaakt.
5. Om te ontmengen, klikt u op de knop Ontmengen bovenaan en selecteert u de optie Opal + AF .
   OPMERKING: Dit is handig om een deel van het autofluorescerende signaal in de buurt van het Opal 480-kanaal te verwijderen, maar niet alles.
6. Om een algoritme te genereren voor de batchverwerking van de gegevens, selecteert u representatieve afbeeldingen met behulp van de stempel met de optie voor inForm Projects 1 x 1 afbeeldingen (beeldgrootte: 928 μm x 696 μm).
   OPMERKING: Een paar representatieve stempels met tumor, stroma, achtergrond en verschillende soorten immuuncellen worden in de dataset geselecteerd om te eindigen met ~20-30 afbeeldingen.
7. Afhankelijk van wat er in het weefsel moet worden geanalyseerd, selecteert u een interessegebied met behulp van de ROI-optie en selecteert u voor inForm Batch. Verwijder handmatig afbeeldingen die niet hoeven te worden geanalyseerd, zoals afbeeldingen die te ver van de tumor verwijderd zijn of op de achtergrond staan.
   OPMERKING: We hebben de neiging om een ROI rond de hele tumor te tekenen en één extra afbeelding weg van het tumorgebied te selecteren om een IM van ~ 0.5 mm te kunnen analyseren.
   Als de getekende ROI relatief klein is, zal de ROI bestaan uit 2-9 samengevoegde 20x afbeeldingen. Aangezien dit niet onze voorkeur heeft, stempelt u handmatig het weefsel van belang (geselecteerd voor inForm Batch) om dit te omzeilen.
8. Wanneer u klaar bent met annoteren, laat u de annotaties automatisch opslaan en laadt u de volgende dia.
9. Controleer tijdens het annotatieproces of de dia's correct zijn gescand.
   1. Als er een .qptiff-bestand ontbreekt of als een objectglaasje niet met succes is gescand, controleer dan of er weefsel op het glaasje aanwezig is, maak het glaasje schoon met 70% ethanol en scan opnieuw.
   2. Als het weefsel niet volledig is gescand, waardoor een mogelijk belangrijk (tumor)gebied ontbreekt, of als het scannen van het belangrijke gebied onscherp was, reinig dan het objectglaasje met 70% ethanol en scan opnieuw.
      OPMERKING: In beide gevallen kan het ook helpen om het weefsel te omcirkelen met een stift bovenop het dekglaasje om het systeem te helpen het weefsel te lokaliseren en opnieuw te proberen te scannen (Aanvullend bestand 6: Aanvullende afbeelding S3). In onze handen werkte een dunne rode stift beter dan een dikke zwarte stift.
10. Zodra het scannen en annoteren van alle voorbeelden is voltooid, maakt u een back-up van de gegevens door ze op een andere computer of externe schijf op te slaan.

6. Spectrale ontmenging

1. Open de geautomatiseerde beeldanalysesoftware inForm.
2. Laad de afbeeldingen in de software door Bestand | Open afbeelding; Selecteer .qptiff-bestanden. Laat de stempels, die in stap 5.6 zijn gemarkeerd als inForm Projects , in het project laden.
3. Laad de .qptiff-bestanden die worden afgebeeld voor de autofluorescentiecompensatie.
4. Om autofluorescentie te compenseren, gebruikt u de autofluorescentie selecteren op de afbeeldingstool om een lijn op de afbeelding te trekken van de ongekleurde dia door verschillende soorten structuren die autofluorescerend zijn, zoals erytrocyten en collageen.
5. Wijs in de sectie Markeringen en kleuren bewerken... markeringsnamen toe die overeenkomen met de opaalfluorofoor en pas de kleur aan de voorkeurskleur aan.
6. Om de fluoroforen te ontmengen, selecteert u Alles voorbereiden in de linkerbenedenhoek.
7. Neem de beelden door en controleer of alle signalen zichtbaar zijn in de beelden en of het ontmixen goed is gegaan. Selecteer het oogbolpictogram om alle markeringen één voor één uit te schakelen en in te schakelen om de kwaliteit te controleren.
8. Train eventueel de algoritmen voor weefselsegmentatie, celsegmentatie en fenotypering.
9. Ga naar het tabblad Exporteren en maak een nieuwe lege exportmap door op de knop Bladeren... onder de Exportmap te klikken.
10. Selecteer onder de Te exporteren afbeeldingen: de optie Samengestelde afbeelding en Componentafbeeldingen (TIFF met meerdere afbeeldingen).
11. Selecteer Bestand | Opslaan | Project om het algoritme op een bepaalde locatie op te slaan.
12. Ga naar het tabblad Batchanalyse verticaal aan de linkerkant voor de batchverwerking van dia's.
13. Selecteer Afzonderlijke mappen maken voor elk item onder de exportopties.
14. Als u dia's voor analyse wilt toevoegen, selecteert u .qptiff-bestanden onder de knop Dia's toevoegen... en laadt u ze in de batchanalyse.
15. Selecteer Uitvoeren om de batchverwerking van dia's te starten.

7. ROI-tekening

1. Maak een map met alleen de componentbestanden uit sectie 6, maar houd de hiërarchische mappenstructuur intact (componentbestanden bevinden zich in mappen met de naam van een voorbeeld/dia).
2. Open de QuPath-software voor het bekijken van dia's.
3. Klik aan de linkerkant op Project maken en selecteer/maak een nieuwe lege map met een geschikte naam.
4. Klik op Automatiseren en selecteer Scripteditor weergeven.
5. Kopieer en plak het script dat beschikbaar is in aanvullend bestand 7. Wijzig op regel 34 de locatie in de plaats waar de diamappen met alle componentbestanden zich bevinden (de map die in stap 7.1 is gemaakt.
6. Selecteer Uitvoeren en terugkeren wanneer het batchgewijs samenvoegen van dia's is voltooid (de volgende dag of later) om door te gaan.
7. Sleep de gegenereerde .ome.tif bestanden naar het QuPath-project en sla ze op als een project.
8. Wanneer er automatisch een nieuw venster verschijnt, selecteert u Afbeeldingstype instellen | Fluorescentie en klik op Importeren.
9. Bekijk in het menu aan de linkerkant de lijst met monsters; dubbelklik op een om het voorbeeld te openen (Figuur 5A).
10. Als u de intensiteit van de kanalen wilt aanpassen om ze beter zichtbaar te maken, klikt u op het contrastpictogram.
11. Selecteer alle kanalen en klik op Resetten.
12. Schakel autofluorescentie uit.
13. Als u een ROI voor de tumor wilt maken, klikt u op het contrastpictogram en selecteert u Grijswaarden weergeven. Selecteer het tumormarkeringskanaal en pas de intensiteit aan om het optimaal zichtbaar te maken (Figuur 5B).
14. Klik op het penseel om de ROI van een tumor ruwweg te tekenen.
15. Klik tijdens het selecteren van de staaftool buiten de ROI terwijl u op de alt-toets drukt om de ROI van buitenaf glad te strijken (Figuur 5C).
16. Voeg gescheiden tumorstukken samen met dezelfde ROI.
17. Geef de ROI een passende naam, zoals tumor , door met de rechtermuisknop op de annotatie in de lijst aan de linkerkant te klikken; selecteer Eigenschappen instellen en voer de naam in.
18. Als u een ROI voor de IM wilt maken, breidt u de bestaande ROI van het tumorgebied uit door het volgende te selecteren: Objecten | Aantekeningen... | Annotaties uitvouwen.
19. Selecteer de grootte van de expansiestraal en selecteer Interieur verwijderen en Beperken tot bovenliggend element (Figuur 5D).
20. Klik op het contrastpictogram, selecteer het autofluorescentiekanaal en pas de intensiteit aan om het optimaal zichtbaar te maken.
21. Klik op de toverstaf en pas de ROI aan terwijl u op de alt-toets drukt om de ROI van buitenaf glad te strijken en alle achtergronden te verwijderen die geen deel zouden moeten uitmaken van deze ROI.
22. Geef de ROI een geschikte naam, zoals invasieve marge of IM door met de rechtermuisknop op de annotatie in de lijst aan de linkerkant te klikken, Eigenschappen instellen te selecteren, de naam in te voeren en desgewenst de kleur te wijzigen in groen.
23. Sla de annotaties op: Bestand | Objecten exporteren | Exporteer alle objecten en klik op OK met de standaardselectie op Exporteren als FeatureCollection en sla het op een voorkeurslocatie op.

8. Detectie van immuuncellen

1. Aangezien ImmuNet componentgegevens (meerkanaals TIFF-bestanden) gebruikt voor zowel training als inferentie, splitst u annotaties op in trainings- en validatiesets. Als u het model wilt trainen, volgt u de stappen die worden beschreven in het Readme-bestand van de opslagplaats, waarbij u de voorbeeldgegevensset en annotaties vervangt door de gewenste gegevens. Geef het model, afgezien van verschillende immuuncellen, negatieve voorbeelden door achtergrondannotaties te maken op plaatsen die niet als een cel van belang zouden moeten worden herkend: tumorcellen, andere cellen of "geen cellen" (structuren die kunnen worden verward met cellen van belang); zie de ImmuNet-publicatie voor details³².
2. Zorg er met behulp van de validatieannotaties voor dat de prestaties bevredigend zijn. Kijk naar het foutenpercentage per annotatietype - een deel van de validatieannotaties dat het model niet heeft gedetecteerd - de meest eenvoudige evaluatiemetriek. Evalueer de prestaties met betrekking tot valse positieven door een paar volledig geannoteerde ROI's te maken en de F-scores te berekenen.
3. Naast kwantitatieve evaluatie, inspecteer de voorspelling visueel om een kwalitatief beeld te krijgen van de fouten die het model vaak maakt (Figuur 6, Aanvullend Bestand 6: Aanvullende Figuur S4 en Aanvullende Figuur S5). Als de prestaties van het model als onvoldoende worden beoordeeld, visualiseert u de voorspelling voor enkele tegels zoals beschreven in de opslagplaats en controleert u welke sites het meest vatbaar zijn voor fouten. Maak meer aantekeningen op dergelijke sites en voer modeltraining en -evaluatie opnieuw uit.
4. Wanneer de doelprestaties zijn bereikt, voert u de deductie uit voor de hele gegevensset zoals beschreven in de sectie Deductie voor de hele gegevensset van de opslagplaats Readme. Gebruik de verkregen .csv bestanden met de modelvoorspelling als input voor data-analyse (schrijf daar een Python- of R-script voor).

9. Voorspelling, fenotypering en data-analyse

OPMERKING: In dit gedeelte geven we een voorbeeld van eenvoudige gegevensanalyse voor een enkel melanoommonster dat is gekleurd met het lymfocytenpaneel, dat de locaties van immuuncellen die zijn geïdentificeerd door ImmuNet (sectie 8) combineert met ROI's die zijn afgebakend met QuPath (sectie 7). De analyse is uitgevoerd in R 4.1.1 (een script wordt geleverd als aanvullend bestand 8). Het script vereist de pakketten: plyr 1.8.8, dplyr 1.0.8, tidyr 1.2.0, sf 1.0-7, ggplot2 3.4.0, RANN 2.6.1 en RColorBrewer 1.1-2, die kunnen worden geïnstalleerd met de opdracht install.packages(). Als invoer is een .csv bestand nodig met de voorspelling van ImmuNet van een monster en een bestand met ROI's die zijn geëxporteerd vanuit QuPath. Stappen 9.1-9.6 beschrijven de analyse van een enkel monster dat wordt uitgevoerd in het meegeleverde script, en secties 9.7-9.9 beschrijven opties voor de analyse van meerdere monsters.

1. Nadat u de voorspelling van ImmuNet in R hebt geladen, bepaalt u de drempels voor voorspelde markerexpressie door de markers die fenotypes definiëren tegen elkaar uit te zetten en de drempels te selecteren die de populaties het beste scheiden.
   OPMERKING: De poortstrategie die voor de gegeven steekproef wordt gebruikt, wordt weergegeven in figuur 7B. Poortstrategieën voor de myeloïde en dendritische celpanelen worden weergegeven in aanvullend bestand 6: aanvullende figuur S6 en aanvullende figuur S7.
2. Nadat u de drempels hebt bepaald, gebruikt u deze om aan elke ImmuNet-voorspelling een fenotype toe te kennen dat in een paneel is gedefinieerd. Merk bij sommige voorspellingen op dat geen van de voorspelde markers boven de drempel ligt of dat de combinatie van markers die na de drempel als uitgedrukt wordt beschouwd, inconsistent kan zijn (bijv. CD3⁺ CD20⁺ voorspellingen in de lymfocytenpanels). Als in stap 8.3 goede modelprestaties worden bereikt, zal het deel van dergelijke voorspellingen klein zijn; Filter ze uit vóór de analyse.
3. Om de ROI's voor de tumor en de invasieve marge tot 100 μm die in QuPath zijn getekend afzonderlijk te analyseren, laadt u de bijbehorende GeoJSON-bestanden in R en bepaalt u voor elke voorspelling de ROI waarin de voorspelling valt.
4. Voor een sanity check en als onderdeel van de verkennende data-analyse, visualiseert u de immuuncellen die in een monster worden aangetroffen afzonderlijk in de bijbehorende ROI's, samen met de grenzen van de ROI's (Figuur 7A).
5. Bereken nu de dichtheden van verschillende immuuncellen afzonderlijk voor elke ROI. De dichtheden die in de gegeven steekproef worden gevonden, zijn weergegeven in tabel 1.
6. Als er meerdere monsters beschikbaar zijn, visualiseer dan de verdeling van de celdichtheden. Log-transformeer de dichtheidswaarden om normaal verdeelde waarden te bereiken.
   OPMERKING: Wanneer het aantal fenotypes 0 is, kunnen deze niet Log-getransformeerd worden, wat leidt tot ontbrekende waarden. Om dit probleem op te lossen, kan LaPlacian smoothing worden toegepast door eerst 0,5 toe te voegen aan alle celtellingen voordat deze wordt gedeeld door het oppervlak.
7. Analyseer de dichtheidswaarden en plot ze met behulp van de software van uw keuze (Figuur 8).
8. Bewaarde locaties van cellen maken ruimtelijke analyse mogelijk. Zoek bijvoorbeeld voor elke gedetecteerde immuuncel een naaste buur en bereken vervolgens voor elk fenotype het percentage gevallen waarin de verschillende fenotypen als de dichtstbijzijnde buur voorkomen.
   OPMERKING: Aangezien het aantal natural killer (NK)-cellen dat in deze steekproef werd aangetroffen erg klein was, hebben we ze uitgesloten van deze analyse. De verkregen resultaten voor tumor- en IM-ROI's worden weergegeven in figuur 9.

Resultaten

FFPE-blokken met tumorweefsel werden geselecteerd op basis van pathologierapporten en HE-gekleurde objectglaasjes. Wanneer er meerdere tumorlaesies van de patiënt worden verwijderd en/of tumormonsters groot zijn, worden deze verdeeld over meerdere FFPE-blokken. We geven de voorkeur aan het analyseren van immuuncellen in zowel het tumorcompartiment als wat bekend staat als de invasieve marge (IM) van de tumor. De IM is niet-kankerachtig stromaal weefsel dat grenst aan de tumor. Daarom, wanneer er meerdere FFPE-blokken beschikbaar zijn voor één tumormonster, worden de FFPE-blokken geselecteerd die beide weefseltypen bevatten. Zoals te zien is op de HE-gekleurde objectglaasjes, bevatte één FFPE-blok tumorweefsel en stromaal weefsel naast de tumor (Figuur 1A). Een ander FFPE-blok van dezelfde tumor bevatte veel minder omringend stromaal weefsel (Figuur 1B). Voor sommige weefselmonsters is er echter geen keuze in FFPE-blokken of is de IM niet aanwezig in een van de FFPE-blokken. Dit is vaak het geval bij (naald)biopten, waar bij de interpretatie van de data rekening mee gehouden moet worden.

Figuur 1: HE-gekleurde objectglaasjes van een melanoomtumormonster. (A) Een voorbeeld van een tumormonster met stromaal weefsel naast de tumor (IM) in de rechterbovenhoek van het monster (aangegeven met zwarte pijlpunten). (B) Een ander monster van dezelfde tumorlaesie met weinig tot geen stromaal weefsel in het monster. Schaal balken = 5 mm. Afkortingen: HE = hematoxyline en eosine; IM = invasieve marge. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Multiplex IHC-kleuring met een voorgesteld zevenkleurenpaneel (aanvullend bestand 4) kan handmatig worden uitgevoerd in een kleuringsproces van 3 dagen (rekening houdend met normale werkuren) of 's nachts in een autostainer. Bij het gebruik van de autostainer moeten secties op een bepaalde locatie op het glasplaatje worden gemonteerd die een optimale vloeibaarheid van het systeem mogelijk maakt (Figuur 2A). Wanneer secties correct op dia's zijn gemonteerd (Figuur 2B), worden ze gelijkmatig gekleurd (Figuur 2C). Als secties niet optimaal op het objectglaasje zijn gemonteerd (Figuur 2D), resulteert dit vaak in een suboptimaal kleuringspatroon (Figuur 2E) omdat de fluïditeit van de autostainer het (volledige) weefsel niet bereikt. Dit kan gebeuren wanneer de monsters erg groot zijn, of wanneer gemonteerde objectglaasjes worden geleverd door iemand die niet op de hoogte is van dit probleem. In deze gevallen moet alleen het goed gekleurde deel van het objectglaasje worden geselecteerd voor analyse. Een andere keuze voor dit soort monsters zou kunnen zijn om ze handmatig te beitsen om de vloeistoffen optimaal te verspreiden.

Afbeelding 2: Montage van het FFPE-gedeelte op het glasplaatje en impact. (A) Schema van waar het glasplaatje op het objectglaasje moet worden gemonteerd voor een optimale kleuring op de autostainer. (B) Voorbeeld van een correct gemonteerde slede. (C) Correct gemonteerde objectglaasjes resulteren in een gelijkmatig gekleurd weefselgedeelte. (D) Voorbeeld van een suboptimaal gemonteerde dia. (E) Suboptimaal gemonteerde objectglaasjes kunnen resulteren in een onvolledig gekleurd weefselgedeelte, zoals te zien is aan de linkerkant van deze foto. Schaal balken = 5 mm. Afkorting: FFPE = formaline-gefixeerd en paraffine-embedded. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Wanneer grote multiplex IHC-experimenten worden uitgevoerd in meerdere kleuringsrondes en grote hoeveelheden oplossingen moeten worden bereid, is het het beste om deze reagentia eerst te testen in een monoplex IHC-run voordat u overgaat naar de multiplex IHC. Monoplex IHC wordt gecontroleerd met de digitale pathologiebeeldvormer op verwachte kleuringspatronen en de belichtingstijden worden ingesteld met de bijbehorende filters op controleglaasjes (Figuur 3A-H). Amandelweefsel wordt gebruikt als positieve controle voor de meeste markers van immuuncellen. Aangezien de DAPI-blootstellingstijd in tonsilcontroleweefsel altijd hoger is dan in andere weefsels (figuur 3G), moet de DAPI-blootstellingstijd worden ingesteld op het te bestuderen weefseltype. Normale belichtingstijden bij dit type scannen liggen tussen 1 ms en 30 ms, afhankelijk van de fluorofoor en het filter (Figuur 3I). Wanneer een monoplex IHC deze aantallen overschrijdt of het kleuringspatroon niet zo duidelijk is als verwacht, moet de antilichaamoplossing worden aangepast of vervangen. In het hier getoonde voorbeeld hebben we besloten om de concentratie van FOXP3 te verhogen (Figuur 3C en Figuur 3I) om de intensiteit meer binnen het bereik van de andere markers te hebben. Autofluorescentie kan ook sterker zijn in andere weefsels dan in weefsel voor de controle op de amandelen. In onze instelling ligt de belichtingstijd voor het Sample AF-filter tussen 25 ms en 50 ms (Figuur 3H,I).

Figuur 3: Instelling van de belichtingstijden op monoplex IHC en ongekleurde controlemonsters. (A) CD20 - Opal 480 signaal in tonsil controleweefsel. (B) CD3 - Opal 520 signaal in amandel controle weefsel. (C) FOXP3 - Opal 570 signaal in het controleweefsel van de amandelen. (D) CD56 - Opal 620 signaal in amandel controle weefsel (E) CD8 - Opal 690 signaal in amandel controle weefsel. (F) Tumormarker - Opaal 780-signaal in het controleweefsel van de amandelen. (G) Het DAPI-signaal in het controleweefsel van de amandelen is vaak zwakker dan het weefseltype dat van belang is. (H) Autofluorescentie - monster AF-signaal in tumorcontroleweefsel. (I) Screenshot van de belichtingstijden voordat deze met 10% worden aangepast en worden gecontroleerd op multiplex IHC-bevlekte dia's. Schaal balken = 100 μm. Afkortingen: AF = autofluorescentie; IHC = immunohistochemie; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Nadat multiplex IHC is uitgevoerd, worden de belichtingstijden aangepast op basis van de monoplex IHC-instellingen door een paar multiplex IHC-dia's te controleren en auto-exposé te selecteren. Bij dit type scannen is er geen optie voor bescherming tegen verzadiging en daarom is het uiterst belangrijk om de belichting niet te hoog in te stellen, waardoor overbelichting wordt voorkomen. Overmatige blootstelling belemmert de spectrale ontmenging van de fluoroforen. We stellen vaak geen belichtingstijden in die langer zijn dan de belichtingstijden die waren gebaseerd op de monoplex IHC en we verlagen de belichtingstijden alleen voor markers die sterker zijn in de multiplex IHC (Figuur 3G en Figuur 4A). Door op verschillende locaties op een paar dia's automatisch te belichten, kan worden vastgesteld dat de belichtingstijden van enkele filters nog te hoog zijn. Deze moeten worden aangepast aan het laagste getal dat wordt waargenomen bij gebruik van de instelling voor automatische belichting en nog eens 10% van de waarde aftrekken om overbelichting op andere onzichtbare locaties te voorkomen (Figuur 4A). Met deze methode kunnen de belichtingstijden voor bepaalde filters lager zijn dan degene die op monoplex IHC zijn ingesteld. Bij een succesvol multiplex IHC-experiment moeten echter alle markers waarneembaar zijn, ten minste op het controleglaasje (Figuur 4B-H, Aanvullend Dossier 6: Aanvullende Figuur S1 en Aanvullende Figuur S2). Houd er rekening mee dat bepaalde markers mogelijk niet in elk monster aanwezig zijn. Door een controleglaasje met ten minste een amandeldoorsnede op te nemen, kan een succesvolle kleuring van alle markeringen van de standaardpanelen en de signaalsterkte worden geverifieerd.

Figuur 4: Voorbeeld van een succesvol gekleurd gedeelte met het lymfocytenpanel in een melanoomtumormonster. (A) Blootstellingstijden die zijn gebruikt om dit multiplex IHC-monster te registreren. (B) Samengesteld beeld van multiplex IHC-lymfocytenpanel in tumorweefsel. (C) CD20 - Opaal 480 signaal in magenta. (D) CD3 - Opal 520 signaal in rood. (E) FOXP3 - Opal 570 signaal in groen. (F) CD56 - Opal 620 signaal in geel. (G) CD8 - Opal 690 signaal in cyaan. (H) TM - Opaal 780 in wit. Schaal balken = 100 μm. Afkorting: TM = tumor marker; IHC = immunohistochemie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Multiplex IHC-objectglaasjes worden volledig gescand door de digitale imager. Tegels voor latere analyse worden geselecteerd in de diaviewer. Wanneer echter meer specifieke regio's moeten worden geanalyseerd, zoals tumor versus IM, kunnen deze interessegebieden (ROI's) worden getekend met behulp van QuPath. Nadat de batchverwerking van de tegels die in de diaviewer zijn geselecteerd, is voltooid, worden de componentbestanden weer samengevoegd (Afbeelding 5A en aanvullend bestand 7). Met behulp van het tumormarkeringskanaal (Figuur 5B) en de toverstaf in QuPath kan de tumoromtrek worden getraceerd om de "Tumor ROI" te vormen (Figuur 5C). Vervolgens kan de ROI van de tumor worden uitgebreid met een bepaalde afstand, in dit geval 500 μm, om een "invasieve marge-ROI" te creëren (Figuur 5D). Elke ongewenste achtergrond (niet-weefsel) wordt uit deze ROI verwijderd met de toverstaf door naar het autofluorescentiesignaal te kijken (Figuur 5E). Zowel de ROI van de tumor als de ROI van IM worden opgeslagen als een GeoJSON-bestand voor verdere verwerking (Figuur 5F).

Figuur 5: Tumor ROI en invasieve marge ROI tekenproces in QuPath. (A) Samengevoegde componentbestanden. (B) Grijswaardenbeeld waarop alleen het tumormarkeringskanaal te zien is. (C) Tumor ROI wordt getekend rond het signaal van de tumormarker. (D) Een nieuwe ROI wordt gemaakt door de ROI van de tumor uit te breiden met 100-500 μm om de IM-ROI te vormen. (E) De IM ROI is aangepast om alleen stromaal weefsel op te nemen door achtergrond- (negatief signaal) en andere grote weefselstructuren zoals vet, bloedvaten en haarzakjes uit te sluiten. (F) De resulterende tumor-ROI en IM-ROI worden opgeslagen en geëxporteerd naar GeoJSON-bestanden voor verdere verwerking van de regio's. De ROI van de tumor wordt weergegeven met een rode omtrek en de IM-ROI met een groene omtrek. Schaal balken = 2 mm. Afkortingen: ROI = regio van belang; IM = invasieve marge; GeoJSON = geografische JavaScript object notatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ImmuNet-netwerken kunnen worden gebruikt om immuuncellen te detecteren. Voor het lymfocytenpanel kan het experimentele samengestelde beeld (Figuur 6A) visueel worden vergeleken met de immuuncellen die door de software worden gedetecteerd (Figuur 6B). Vergelijkbare visuele vergelijkingen kunnen worden gemaakt voor het myeloïde paneel (aanvullend bestand 6: aanvullende figuur S4) en het dendritische celpaneel (aanvullend bestand 6: aanvullende figuur S5).

Figuur 6: Lymfocyten herkend door ImmuNet. (A) Samengestelde afbeelding van Figuur 4B met cellen herkend door ImmuNet met witte stippen. (B) Cellen herkend door ImmuNet en vervolgens gedetecteerde markerexpressie. Schaal balken = 50 μm. Afkorting: TM = tumor marker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Immuuncellen die door ImmuNet worden gedetecteerd en in .csv formaat worden opgeslagen, kunnen in elke programmeertaal worden geïmporteerd voor verdere analyse. We voerden ruimtelijke visualisatie en gating uit in R (Supplemental File 8). De gedetecteerde cellen kunnen vervolgens ruimtelijk worden gevisualiseerd (Figuur 7A, Aanvullend Bestand 6: Aanvullende Figuur S6 en Aanvullende Figuur S7). Gating op pseudomarkerexpressie kan worden uitgevoerd om de individuele immuuncellen te fenotyperen (Figuur 7B).

Figuur 7: Gatingstrategie van het lymfocytenpaneel. (A) Immuuncellen gedetecteerd in interessegebieden voor tumoren en invasieve marges, afgebakend met QuPath. (B) Gating van alle cellen die door ImmuNet zijn gedetecteerd uit deel A. Lymfocyten worden eerst afgeschermd op CD20⁺ B-cellen en CD3⁺ T-cellen. CD3⁺ T-cellen zijn verder omheind voor CD8- en FOXP3-expressie. De CD20-CD3-populatie is omheind voor CD56⁺ natural killer cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Wanneer fenotypes van de voorspelde cellen worden bepaald met gating, kunnen celdichtheden van verschillende fenotypes worden berekend binnen verschillende ROI's. Dit wordt berekend door het totale aantal cellen per fenotype te delen door de oppervlakte van de ROI (Tabel 1, Figuur 8 en Supplemental File 8). Hier worden ^B-cellen gedefinieerd als CD3-CD20⁺, helper-T-cellen als CD3⁺CD20-CD8-FoxP3-, regulerende ^T-cellen als CD3⁺CD20-CD8-FoxP3⁺, cytotoxische T-cellen als CD3⁺CD20-CD8⁺FoxP3-en ^NK-cellen als CD3-CD20-CD56⁺.

Fenotype	Dichtheid in tumor (cellen/mm2)	Dichtheid in IM (cellen/mm2)
B-cel	185.74	145.62
Helper T-cel	301.46	157.51
Regulerende T-cel	38.53	19.53
Cytotoxische T-cel	185.35	83.21
NK-cel	0.18	0

Tabel 1: Dichtheden van fenotypes in ROI's. Dichtheden van cellen van verschillende fenotypes gevonden in een enkel melanoommonster gekleurd met het lymfocytenpaneel. Dichtheden worden afzonderlijk berekend in tumor- en IM-ROI's. Afkortingen: IM = invasieve marge; ROI = regio van belang.

Figuur 8: Voorbeeld van data-analyse voor meerdere steekproeven. Dichtheidsanalyse van verschillende lymfocytenfenotypes in tumor en IM van 23 primaire melanoomtumoren. Afkortingen: IM = invasieve marge; ROI = regio van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om meer in de ruimtelijke informatie van deze immuuncellen te duiken, is het ook mogelijk om afstanden te bepalen tussen geïdentificeerde fenotypes of percentages van fenotypes van naaste buren in een steekproef (Figuur 9).

Figuur 9: Voorbeeld van een analyse van de dichtstbijzijnde buur voor een enkel monster. Percentage fenotypes van de dichtstbijzijnde buur voor verschillende celtypen in (A) tumor- en (B) IM ROI's gevonden in een enkel melanoommonster gekleurd met het lymfocytenpaneel. Afkortingen: IM = invasieve marge; ROI = regio van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Multiplex IHC met een samenvatting van de protocolspecificaties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Autostainer-protocol voor monoplex. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Autostainer-protocol voor autofluorescentiecompensatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 4: Autostainerprotocol voor multiplex immunohistochemie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Sjabloon .csv bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 6: Myeloïde en dendritische celpanels in een melanoomweefselmonster; markeringsglaasjes in geval van scanfalen; myeloïde en dendritische cellen herkend door ImmuNet; poortstrategieën van myeloïde en dendritische celpanels. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 7: QuPath stitch script. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 8: Script voor gegevensanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Ruimtelijke analyse van de TME is een gewilde techniek om meer te weten te komen over het immuuncelcompartiment en nieuwe prognostische en voorspellende biomarkers te ontdekken, met name op het gebied van immuno-oncologie¹⁶. Hiervoor worden veel verschillende technieken ontwikkeld, waarbij eiwitten, mRNA-transcripten of een combinatie van beide worden gedetecteerd, met schattingen tot 100-1.000 doelen. Een hogere multiplexing gaat echter ten koste van minder high-throughput experimenten, hogere experimentele kosten en technische uitdagingen, en vaak kan slechts een klein deel van de TME worden geanalyseerd. Multiplex IHC met behulp van de op TSA gebaseerde methode die we hier beschrijven, detecteert zes verschillende markers + DAPI tegelijkertijd, is relatief goedkoper om uit te voeren en hele weefselsecties worden in minder dan 20 minuten in beeld gebracht, klaar om volledig te worden geanalyseerd. Deze techniek is minder complex geworden met de automatisering van het kleuringsproces. Verbeteringen in de multispectrale microscoop, waaronder de toevoeging van twee extra filters, hebben de spectrale ontmengings- en scantijden enorm verbeterd. Het is mogelijk om tot acht verschillende markers + DAPI tegelijkertijd te detecteren. Door de multiplexing uit te breiden met meer markers, verdwijnen de bovengenoemde voordelen echter omdat spectrale ontmenging een grotere uitdaging wordt en de scantijden voor hele objectglaasjes aanzienlijk toenemen. Er wordt gewerkt aan het standaardiseren van multiplex IHC tussen verschillende instellingen om de implementatie in de diagnostische setting gemakkelijker te maken. Voor deze standaardisatie van multiplex IHC adviseren we gebruikers om zich te houden aan het meer toegankelijke protocol met zes verschillende markers + DAPI. Toch is er nog heel wat technische kennis nodig en kan downstream analyse een uitdaging zijn, waarvoor we methodologieën hebben ontwikkeld die in dit protocol worden beschreven.

Standaardisatie begint met de ontwikkeling van multiplex IHC-panelen. Het belang van de keuze van primaire antilichamen die bepaalde eiwitdoelen detecteren, is al eerder benadrukt¹⁷. Onze multiplex IHC-panelen zijn meestal ontwikkeld met klonen van primaire antilichamen die ook op onze diagnostische afdeling worden gebruikt en gevalideerd voor IHC. In het geval van het dendritische cel multiplex IHC-panel werden de meeste antilichamen echter niet gebruikt in de diagnostische setting (van der Hoorn et al., manuscript in inzending). Om specificiteit te garanderen en batchverschillen te minimaliseren, hebben we ervoor gekozen om monoklonale antilichamen te gebruiken in plaats van polyklonale antilichamen en hebben we ook de meeste antilichamen gevalideerd met behulp van getransfecteerde cellijnen en primaire cellen. In de loop der jaren zijn in tal van onderzoeken verschillende versies van multiplex IHC-panelen gebruikt met behulp van het Vectra 3-systeem 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Om deze multiplex IHC-panelen optimaal te implementeren op het PhenoImager HT-systeem, moesten er enkele aanpassingen worden gedaan in de combinaties van primaire antilichamen en fluoroforen. Om te profiteren van een betere spectrale ontmenging en snellere scantijden van hele weefselsecties, is de implementatie van de nieuwste Opal480- en Opal780-fluoroforen en het vermijden van het gebruik van Opal540- en Opal650-fluoroforen in zevenkleurige multiplex IHC-panelen noodzakelijk. De scantijden zijn ~3-10 keer sneller, afhankelijk van de grootte van het weefselgedeelte. Multiplex IHC-paneelaanpassingen waren vrij eenvoudig te realiseren, maar er moeten enkele overwegingen in gedachten worden gehouden. Het fluorescerende spectrum van Opal480 overlapt veel met het autofluorescentiespectrum en interfereert daarom met de spectrale ontmenging van erytrocyten en andere autofluorescerende structuren. Het gebruik van een verhoogde concentratie van het primaire antilichaam in combinatie met Opal480 loste dit probleem in de meeste gevallen op. De implementatie van het gepatenteerde Sample AF-filter op de PhenoImager HT vergemakkelijkt het ontmengen van Opal480 en autofluorescentie. Het is echter het beste om een primair antilichaam te gebruiken dat een duidelijk signaal afgeeft bij gebruik met Opal480, zodat het signaal hoger is dan de autofluorescentie.

Hoewel deze multiplex IHC-panelen zijn ingeburgerd, is variatie van batch tot batch iets dat moet worden overwogen. Door monoplex IHC-controles uit te voeren voordat het volledige multiplex IHC-experiment werd gestart, zagen we soms dat primaire antilichamen van experiment tot experiment sterker of zwakker presteerden. De redenen hiervoor kunnen pipetteerfouten, suboptimale opslagcondities voor reagentia en houdbaarheid zijn. We hebben dit opgelost door de primaire antilichaamoplossing aan te passen op basis van onze ervaring. Zelfs als geen van de bovengenoemde aanpassingen hoefde te worden gemaakt, is het bij elk multiplex IHC-batchexperiment belangrijk om belichtingstijden in te stellen op basis van monoplex IHC-gekleurde controleglaasjes.

Omdat ons onderzoek in eerste instantie gericht was op verschillende soorten carcinomen en melanoom, moesten multiplex IHC-panels met minimale aanpassingen uitwisselbaar zijn tussen tumortypes. Daarom hebben we altijd meerdere (tumor)weefseltypen meegenomen in het optimalisatieproces en hebben we gezien dat verdunningen voor primaire antilichamen voor immuuncelmarkers vergelijkbaar kunnen worden gehouden tussen verschillende tumortypes. Voor de detectie van tumorweefsel tussen carcinomen en melanoom zijn echter verschillende tumormarkers nodig. Dienovereenkomstig is de tumormarker altijd geoptimaliseerd om aan het einde van elk multiplex IHC-paneel te werken en wordt hij momenteel altijd gebruikt in combinatie met Opal780, dat toevallig ook op de laatste fluorofoor moet zijn in een multiplex IHC-kleuringsprocedure. Door de tumormarker consequent aan het einde van de multiplex IHC te gebruiken, kunnen deze multiplex IHC-panels gemakkelijk worden verwisseld voor andere tumortypes, zoals glioblastoom (d.w.z. GFAP) en Hodgkin-lymfoom (d.w.z. CD30). Voor angiosarcoom gebruikten we dit lymfocyt multiplex IHC-panel met erytroblasttransformatie-specifiek-gerelateerd gen (ERG) als tumormarker met slechts twee^{optimalisatie-experimenten 25}. De optimalisatie omvatte titratie van het primaire ERG-antilichaam en het testen van het multiplex IHC-panel met ERG aan het einde.

Andere aanpassingen aan deze multiplex IHC-panelen kunnen ook worden gemaakt door een bepaalde immuuncelmarker te vervangen door een andere immuun- of functionele marker. Elke verandering vraagt om optimalisatie. Het protocol voor optimalisatie kan worden gevolgd zoals eerder beschreven¹⁷. Bepaalde wijzigingen aan de voorgestelde multiplex IHC-panelen zullen interfereren met de ImmuNet-algoritmen die we hebben gemaakt. Er moeten voldoende gegevens worden gegenereerd en er moet tijd worden besteed aan het implementeren van deze wijzigingen in het algoritme (ten minste 750 annotaties voor elke nieuwe marker en/of celfenotypes, en 150 annotaties voor validatie van eerder getrainde markers). De hier gepresenteerde panels bevatten geen functionele markers, hoewel de implementatie van immuuncheckpointmarkers zoals PD-1 en PD-L1 in multiplex IHC-panels in ons laboratorium wordt uitgevoerd. De analyse van markers die minder binair zijn in negatieve en positieve signalen is echter moeilijker gebleken en is een gebied van actief onderzoek in onze groep.

Het aantal markers dat gelijktijdig met multiplex IHC kan worden beoordeeld, is beperkt in vergelijking met andere nieuwe technieken. Hoewel dit kan worden omzeild door verschillende panelen op opeenvolgende plakjes van een FFPE-blok te analyseren, zal het moeilijk zijn om deze plakjes ruimtelijk te vergelijken. Oriëntatie en gevouwen artefacten zijn waarschijnlijk niet hetzelfde na de voorbereiding van de objectglaasjes. Toch is multiplex IHC vrij toegankelijk, wat het een aantrekkelijk hulpmiddel maakt voor meer instellingen en onderzoekers en daarom meer geschikt is voor toekomstige implementatie in een diagnostische setting. Met de standaardisatie van multiplex IHC-immuuncelpanels voor meerdere tumortypen en stroomafwaartse analysepijplijnen kon meer kennis worden opgedaan over verschillen in TME tussen patiënten en tumortypes. Dit kan bijvoorbeeld leiden tot meer inzicht in de rol van de TME in de antitumorrespons op specifieke behandelingen. Dit kan zelfs aanleiding geven tot nieuwe biomarkers om factoren zoals respons op behandeling en verwachte overleving te voorspellen. Over het algemeen kan dit multiplex IHC in staat stellen een klinisch hulpmiddel te worden om te helpen bij klinische besluitvorming, in een gepersonaliseerde geneeskundebenadering. Toegegeven, meer stappen van de analyseprocedure moeten waarschijnlijk worden geautomatiseerd en gestandaardiseerd om haalbaar te zijn voor gebruik in een dagelijkse diagnostische omgeving, dus tot nu toe is het vooral een futuristisch perspectief.

Analyse van meerdere markers op een enkel voorbeeldglaasje kan een zeer krachtig hulpmiddel zijn, ondanks de technische uitdagingen. Met gestandaardiseerde experimentele protocollen en een robuuste analysemethode, zoals we hier hebben beschreven met behulp van ImmuNet, maakt de kwantificering van meerdere markers het informatiever dan klassieke IHC, terwijl multiplex IHC een relatief hoge doorvoer blijft in vergelijking met nieuwe experimentele methoden met een hogere plex.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
anti-CD14	Cell Marque	114R-16	sectie 3, clone EPR3653
anti-CD163	Cell Marque	163M-15	sectie 3, clone MRQ-26
anti-CD19	Abcam	ab134114	sectie 3, clone EPR5906
anti-CD1c (BDCA1)	Thermo Scientific	TA505411	sectie 3, clone OTI2F4
anti-CD20	Thermo Scientific	MS-340-S	sectie 3, clone L26
anti-CD3	Thermo Scientific	RM-9107	sectie 3, clone sp7
anti-CD303/BDCA2	Dendritics via Enzo Lifesciences/Axxora	DDX0043	sectie 3, clone 124B3.13
anti-CD56	Cell Marque	156R-94	sectie 3, clone MRQ-42
anti-CD66b	BD Biosciences	555723	sectie 3, clone G10F5
anti-CD68	Dako Agilent	M087601	sectie 3, clone PG-M1
anti-CD8	Dako Agilent	M7103	sectie 3, clone C8/144B
anti-Foxp3	Thermo Scientific	14-4777	sectie 3, clone 236A/E7
anti-Gp100	Dako Agilent	M063401	sectie 3, clone HMB45
anti-HLA-DR, DP, DQ	Santa Cruz	sc-53302	sectie 3, clone CR3/43
anti-MART-1	Thermo Scientific	MS-799	sectie 3, clone A103
anti-pan cytokeratin	Abcam	ab86734	sectie 3, clone AE1/AE3 + 5D3
anti-SOX10	Sigma Aldrich	383R	sectie 3, clone EP268
anti-Tyrosinase	Sanbio	MONX10591	sectie 3, clone T311
anti-XCR1	Cell Signaling Technologies via Bioké	44665S	sectie 3, clone D2F8T
antibody diluent	Akoya BioSciences	SKU ARD1001EA	sectie 3, van Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide (kan optioneel ook worden vervangen door TBST met 10% BSA)
Bond Aspirating Probe	Leica Biosciences	S21.0605	sectie 3
Bond Aspirating Probe Cleaning	Leica Biosciences	CS9100	sectie 3
Bond Dewax Solution	Leica Biosciences	AR9222	sectie 3
Bond Objectglas label + print lint	Leica Biosciences	S21.4564.A	sectie 3
Bond Research Detection System 2	Leica Biosciences	DS9777	sectie 3
Bond RX autostainer	Leica Biosciences	-	sectie 3, geautomatiseerde platform
Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L	Leica Biosciences	AR9961	sectie 3
Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L	Leica Biosciences	AR9640	sectie 3
Bond TM Wash Solution 10x - 1 L	Leica Biosciences	AR9590	sectie 3
BOND Universal Covertile	Leica Biosciences	S21.4611	sectie 3
Bond(TM) Titration Kit	Leica Biosciences	OPT9049	sectie 3
Coverslip 24 x 32 mm #1 (0.13-0.16 mm)	Fisher Scientific	15717592	sectie 2
coverslip 24 x 50 mm	VWR	631-0146	sectie 2
DAPI Fluoromount-G	VWR	0100-20	sectie 3, wanneer monoplex slides snel moeten worden gecontroleerd, niet voor officiële analyse, dan wordt DAPI apart geverfd voor betere resultaten
Eosine			sectie 2, zelfgemaakt
Ethanol 99.5%	VWR	4099.9005	sectie 2
Fluoromount-G	VWR	0100-01	sectie 3
haematoxyline		-	sectie 2, zelfgemaakt
ImmuNet		-	immuunceldetectie en fenotypeerpijplijn
inForm software 2.4.10	Akoya BioSciences	-	sectie 4 & 6
OPAL 480 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1500001KT	sectie 3
OPAL 520 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1487001KT	sectie 3
OPAL 570 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1488001KT	sectie 3
OPAL 620 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1495001KT	sectie 3
OPAL 690 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1497001KT	sectie 3
OPAL 780 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1501001KT	sectie 3
Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide	Akoya BioSciences	NEL821001KT	sectie 3
PhenoChart 1.1.0	Akoya BioSciences	-	sectie 5
PhenoImagerHT	Akoya BioSciences	CLS143455	sectie 4, digitale pathologie imager met dia-viewer en beeldverwerkingssoftware (voorheen bekend als Vectra Polaris)
Quick-D mounting medium	Klinipath	7280	sectie 2
QuPath 0.3.2			softwareplatform voor gehele dia-beeldanalyse
R 4.1.1
Slide boxes	VWR	631-0737	sectie 1
SuperFrost Plus	Thermo Scientific through VWR	631-9483	sectie 1
Vectra Polaris software 1.0.13	Akoya BioSciences	-	sectie 4
Xylene	VWR	4055-9005	sectie 2