Methodenartikel

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

DOI:

10.3791/65722

⸱

12 januari 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vetweefsel is een uitstekende bron van mesenchymale stamcellen. Hier brengen we de stapsgewijze extractie, cultivatie en karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) uit epididymaal vetweefsel van Zwitserse muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn uitgebreid bestudeerd als een nieuwe therapeutische benadering, voornamelijk om verergerde ontstekingen te stoppen vanwege hun potentieel om de immuunrespons te moduleren. De MSC's zijn immuunbevoorrechte cellen die in staat zijn om te overleven in immunologisch onverenigbare allogene transplantatieontvangers op basis van lage expressie van klasse I major histocompatibility complex (MHC)-moleculen en bij het gebruik van celgebaseerde therapie voor allogene transplantatie. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit verschillende weefsels, waarvan het beenmerg en vetweefsel de meest worden gebruikt. We bieden een eenvoudig protocol om MSC's te isoleren, te kweken en te karakteriseren uit epididymaal vetweefsel van muizen. Het epididymale vetweefsel wordt chirurgisch weggesneden, fysiek gefragmenteerd en verteerd met 0,15% collagenase type II-oplossing. Vervolgens worden primaire vetweefsel-afgeleide stamcellen (ADSC's) gekweekt en in vitro geëxpandeerd, en wordt de fenotypische karakterisering uitgevoerd door middel van flowcytometrie. We bieden ook de stappen om de ADSC's te differentiëren in osteogene, adipogene en chondrogene cellen, gevolgd door functionele karakterisering van elke cellijn. Het hier verstrekte protocol kan worden gebruikt voor in vivo en ex vivo experimenten, en als alternatief kunnen de van vet afgeleide stamcellen worden gebruikt om MSC's-achtige onsterfelijke cellen te genereren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn volwassen multipotentiaalcellen die differentiëren tot cellen zoals osteoblast, chondroblast en adipocyt 1,2. Deze cellen bevinden zich in verschillende organen en kunnen daarom worden geëxtraheerd uit volwassen weefsels zoals beenmerg, spieren, vet, haarzakjes, tandwortel, placenta, dermis, perichondrium, navelstreng, long, lever en milt 3,4.

De effecten van MSC's op de fysiologie en het immuunsysteem zijn gerapporteerd 5,6. Deze cellen zijn veelbelovend voor de behandeling van verschillende ziekten, zowel in de menselijke als in de diergeneeskunde. De MSC's kunnen ontstekingen onder controle houden en angiogenese en weefselhomeostase bevorderen via verschillende mechanismen, zoals cel-celcontact, oplosbare factoren en kleine extracellulaire blaasjes 7,8,9,10. Bovendien zijn de MSC's immuunbevoorrechte cellen die in staat zijn om te overleven in immunologisch onverenigbare allogene transplantatieontvangers, omdat deze cellen een lage expressie vertonen van klasse I major histocompatibility complex (MHC)-moleculen en worden gebruikt in celgebaseerde therapie voor allogene transplantatie11,12. De lage immunogeniciteit in combinatie met het regeneratieve potentieel maakt MSC's ideale kandidaten voor celtherapie, zoals graft-versus-host-ziekte (GvHD)13, systemische lupus erythematosus (SLE)14 en multiple sclerose15, onder andere16,17.

Ondanks het feit dat MSC's zich in verschillende volwassen weefsels bevinden, biedt het vetweefsel voordelen ten opzichte van andere bronnen, zoals toegankelijkheid voor oogsten, met minimale chirurgische ingrepen; groot aantal beschikbare cellen met hoge uitzettingssnelheid; en eenvoudige in-vitro-uitbreiding met behulp van een eenvoudig uit te voeren protocol zonder de noodzaak van specifieke apparatuur en goedkope materialen 18,19,20. Eenmaal geëxtraheerd, moeten de van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) worden gekarakteriseerd zoals vastgesteld door de International Society for Cellular Therapy (ISCT)21. MSC's moeten dus morfologie fibroblastachtige, gehechtheid aan plastische cultuur vertonen, waarbij een hoog percentage (≥95%) mesenchymale markers zoals endoglin (CD105), ecto-5'-nucleotidase (CD73) en Thy-1 (CD90) tot expressie worden gebracht, en een laag percentage (≤2%) hematopoëtische markers zoals leukocyt gemeenschappelijk antigeen (CD45), transmembraanfosfoglycoproteïne (CD34), glycolipide-verankerd membraanglycoproteïne (CD14), integrine alfa M (CD11b), B-celantigeenreceptorcomplex-geassocieerde eiwit-alfaketen (CD79α) of B-lymfocytenoppervlakteantigeen B4 (CD19) en klasse II humaan leukocytenantigeen (HLA-II). Bovendien is een functionele karakterisering vereist en moeten de cellen in staat zijn om te differentiëren tot osteoblast-, chondroblast- of adipoblastcellen21.

Hier laten we zien hoe de MSC's uit epididymaal vetweefsel kunnen worden verkregen met behulp van mechanische dissociatie en enzymatische vertering voor in vitro-studies en de morfologische karakterisering die is gepreconconiseerd door ISCT.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens internationale richtlijnen voor dierethiek en werden goedgekeurd door institutionele commissies voor zorg en gebruik van de Staatsuniversiteit van Santa Cruz onder protocolnummer 021/22. Zwitserse mannelijke muizen (6-8 weken) werden verkregen van het Animal Breeding, Maintenance and Experimentation Laboratory - State University of Santa Cruz (LaBIO-UESC) Animal Research Facility, onderhouden in specifieke pathogeenvrije omstandigheden, en kregen ad libitum water en voedsel met licht/donkercycli van 12 uur.

OPMERKING: Andere muizen kunnen worden gebruikt; We raden het gebruik van volwassen muizen (6-8 weken) aan, omdat ze meer ontwikkeld vetweefsel en cellen hebben met een hoge proliferatieve activiteit.

1. Voorbereiding

OPMERKING: Voordat u verder gaat, bereidt u de volgende reagentia voor die hieronder worden beschreven. Zie de materiaaltabel voor informatie over reagens en materiaalleveranciers. Persoonlijke beschermingsmiddelen zoals maskers, petten, laboratoriumjassen en handschoenen moeten bij alle praktische procedures worden gedragen.

  1. Extractie van epididymaal vetweefsel
    1. Bewaar het operatiemateriaal: drie sets steriele pincetten en scharen, vijf naalden en een beker met 200 ml 70% ethanol.
    2. Bereid een terminaal verdovingsmiddel voor en meng ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).
  2. Cultuur van ADSC's
    1. Basaal medium: Bereid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) media met hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 50 μg/ml gentamicine, 0,25 μg/ml amfotericine B, 100 E/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine.
    2. Digest-oplossing: Bereid 0,15% collagenase type II in PBS gesteriliseerd in een filter van 0,25 μm.
      OPMERKING: Het is niet nodig om de vier antibiotica te gebruiken die in het basale medium worden beschreven. Het hangt af van de celkweekomstandigheden van het laboratorium waar dit wordt uitgevoerd.
  3. Fenotypische karakterisering van ADSC's
    1. Bereid 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS.
    2. Verdun de anti-muisantilichamen zoals vermeld in tabel 1.
    3. Bereid 2% formaldehyde in PBS.
  4. ADSC's osteogene differentiatie
    1. Osteogeen differentiatiemedium: Bereid DMEM aangevuld met 5,67 M ascorbinezuur, 10 nM dexamethason, 0,02 M β-glycerofosfaat, 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine.
    2. Bereid voor Von Kossa-kleuring de volgende oplossingen: 70% ethanol in water, 5% zilvernitraat in water, gedestilleerd water, 5% natriumthiosulfaat in water en 1% eosine B in water.
  5. Adipogene differentiatie:
    1. Adipogene differentiatiemedium: Bereid DMEM voor aangevuld met 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 200 μM indomethacine, 1 μM dexamethason, 10 μM insuline, 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine.
    2. Bereid voor olierode kleuring de volgende oplossingen: 10% formaline in gedeïoniseerd water, 60% isopropanol in gedeïoniseerd water, lysochroom (vetoplosbare kleurstof) diazokleurstof (olierode O-oplossing) in 60% isopropanol en 1% hematoxyline in gedeïoniseerd water.
  6. Chondrogene differentiatie:
    1. Chondrogenisch differentiatiemedium: Bereid chondrogenisch medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine.
    2. Bereid 10% formaldehyde in PBS.
    3. Bereid voor proteoglycanen en glycosaminoglycanenkleuring de volgende oplossingen: Heteroglycaankleuring (Alcian Blue 1%) in azijnzuur, pH 2,5, paraffine, hematoxyline, ethanolreeksverdunning in water (100%, 96%, 80% en 70%).

Antilichaam/fluorofoorVerdunningKloonEindconcentratie (μg/ml)Functie en cel waarin het tot expressie komt
CD34- PE1:100RAM34 NL2De factor van de celadhesie. Hematopoëtische stamcellen.
CD45- APC1:10030-F112Hulp bij het activeren van leukocyten. Uitgedrukt in leukocyten.
CD71- FITC1:100C25Regelt de ijzeropname tijdens celproliferatie. Prolifererende cellen, reticulocyten en voorlopercellen.
CD29- FITC1:100Ha2/55Adhesie en activering, embryogenese, leukocyten, dendritische cellen, bloedplaatjes, mestcellen, fibroblasten en endotheelcellen.
CD90- PerCP1:100OS-72Signalering, hechting. T-lymfocyt, NK, monocyt, hemtopoëtische stamcellen, neuron en fibroblast.

Tabel 1: Antilichamen gebruikt voor fenotypische karakterisering van ADSC's door middel van flowcytometer. Lijst van antilichamen met hun respectievelijke fluorochromen, verdunningen, kloon en uiteindelijke concentratie, evenals hun functie in de cel die tot expressie wordt gebracht.

2. Werkwijze

OPMERKING: Het vetweefsel is door het hele lichaam verdeeld op onderhuidse of intra-abdominale locaties. Bij muizen zijn de meest voorkomende vetweefsels die voor experimenten worden gebruikt, het subcutane epididymale, mesenterische en retroperitoneale22. Hier worden de stappen voor het verkrijgen van epididymaal vetweefsel weergegeven (Figuur 1).

figure-protocol-1
Figuur 1: Experimenteel ontwerp voor het verkrijgen van van vetweefsel afgeleide stamcellen van Zwitserse muizen. (A) Plaats het dier met naalden op het kurk- of piepschuimbord; (B) Til de huid op met een pincet, maak een snee in het midden van de buikstreek en maak de huid los van het buikvlies; (C) identificeer het witte vetweefsel boven de bijbal; (D) breng het weefsel over naar DMEM-medium aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica, was het epididymale vetweefsel grondig met PBS en breng het weefsel over naar de digestoplossing; (E), fragmenteer het weefsel en (F) incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur, krachtig schudden om de 10 minuten; (G) na het tellen van de cellen, leg er platen met 6 putjes op en observeer de celmorfologie onder een omgekeerde microscoop. (F) De celmorfologie zal veranderen van rond naar fibroblastachtig. Schaalbalk = 22,22 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Extractie van epididymaal vetweefsel
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat alle procedures onder steriele omstandigheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire flowkast om een zuivere en contaminatievrije celcultuur te garanderen.
    1. Euthanaseer de dieren met ketamine en xylazineoplossing (100 en 10 mg/kg, zoals beschreven in stap 1.1.2) via intraperitoneale route.
      OPMERKING: Andere euthanasiemethoden kunnen worden gebruikt23. Zorg ervoor dat het dier dood is door de afwezigheid van een hartslag te bevestigen.
    2. Leg het dier met de buikzijde naar boven op een met aluminiumfolie beklede kurk- of piepschuimplaat en zet het vast met steriele naalden (Figuur 1A).
      OPMERKING: Om besmetting te voorkomen, spuit 70% alcohol in de buikstreek. U kunt het haar ook scheren met een scalpel.
    3. Til de huid op met een pincet in het midden van de buikstreek en maak een snee met een steriele schaar.
      NOTITIE: Twee sets steriele pincetten en scharen zijn nodig om besmetting te voorkomen. De eerste wordt gebruikt om het dier te openen en de huid en de buikvlieslaag te snijden; De tweede wordt gebruikt om het epididymale vetweefsel op te nemen. Bewaar ook 150 ml 70% alcohol in een bekerglas om een schaar en pincet tussen de stappen schoon te maken.
    4. Breng de schaar onder de huid van het dier en open deze om deze los te maken van het buikvlies (Figuur 1B). Til de peritoneale laag op met een pincet en knip deze af met een steriele schaar.
    5. Gebruik een ander steriel pincet en een schaar en identificeer de bijbal boven de teelballen en het witte vetweefsel boven de bijbal. Trek met een steriel pincet aan het hele epididymale vetweefsel van ongeveer 2 cm groot en snijd heel dicht bij de bijbal (figuur 1C).
    6. Doe het vet in een steriele conische buis van 50 ml met basaal medium en plaats deze op ijs (Figuur 1D). Ga in de kap verder met de volgende stappen zoals hieronder beschreven.
  2. Isolatie van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's)
    OPMERKING: Verwerk de monsters in een kap met laminaire stroming van biologische klasse II en het personeel moet een laboratoriumjas, handschoenen en chirurgisch masker dragen.
    1. Was het epididymale vetweefsel grondig met PBS.
      OPMERKING: Deze stap is essentieel om het bloed en andere deeltjes uit het monster te verwijderen. Het bloed kan het collagenase type II-enzym remmen en het experiment in gevaar brengen.
    2. Breng met een steriel pincet het epididymale vetweefsel over in een buisje van 50 ml met 15-20 ml digestieoplossing, bereid als stap 1.2.2. Fragmenteer het weefsel met een steriele schaar en broed het weefsel gedurende 1 uur uit bij 37 °C (figuur 1E, F).
      OPMERKING: In deze stap kan een waterbad of incubator van 37 °C worden gebruikt. Elke 10 minuten moet de suspensie krachtig worden geschud om de spijsvertering te vergemakkelijken. Verleng de incubatietijd van 1 uur niet.
    3. Inactiveer het collagenase door het monster 1:1 te verdunnen in basaal medium en centrifugeer de suspensie bij 250 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de vasculaire fractie van het stroma te verkrijgen. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 1 ml basaal medium.
    4. Controleer de levensvatbaarheid en tel de cellen door middel van de trypanblauwe kleurstofuitsluitingsmethode in een Neubauer-kamer met een verdunning van 1:10 of 1:100.
      OPMERKING: De verwachte opbrengst is ongeveer 0,5-1 miljoen cellen/g verwerkt vetweefsel en een levensvatbaarheid van 80%.
    5. Plaat de geïsoleerde cellen (0,3-0,5 miljoen) in 3 ml basaal medium in één putje van een plaat met 6 putjes. Incubeer de cellen een nacht bij 37 °C met 5 % CO2 .
    6. Volgende dag: Haal het medium uit het putje en was de cellen met PBS. Voeg 3 ml basaal medium toe. Herhaal dit proces elke 2 dagen totdat de cellen voor 90% samenvloeien.
      OPMERKING: Observeer altijd de morfologie van de cellen onder de omgekeerde microscoop, die verandert van rond naar fibroblastachtig (Figuur 1H).
  3. Uitbreiding van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's)
    OPMERKING: Zodra de cellen ~90% samenvloeien, gaat u verder met de subcultuur zoals hieronder beschreven.
    1. Haal het medium uit het putje en was de cellen met PBS. Voeg 0,5 ml/putje trypsine/EDTA (0,05 % trypsine; 200 mg/l EDTA) toe en incubeer de plaat gedurende 3-5 minuten bij 37 °C om de cellen los te maken.
      OPMERKING: Overschrijd niet meer dan 5 minuten trypsine/EDTA. De volledige loslating van de cellen moet worden geverifieerd onder de omgekeerde microscoop. Het proces kan worden versneld door voorzichtig op en neer te pipetteren of op de zijkant van de plaat te tikken.
    2. Inactiveer het enzym door het monster 1:1 te verdunnen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotica.
    3. Verdeel de celsuspensie in 2 putjes en voeg 3 ml basaal medium toe (DMEM aangevuld met 10 % FBS en 1 % antibiotica). 's Nachts incuberen bij 37 °C met 5% CO2 .
    4. Verander het medium de volgende dag en vervolgens elke 2 dagen tot 90% samenvloeiing.
    5. Herhaal het proces tot de derde doorgang en ga verder met fenotype en functionele karakterisering.
      OPMERKING: Observeer altijd de morfologie van de cellen onder de omgekeerde microscoop, die verandert van rond naar fibroblastachtig.
  4. Karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's)
    1. Fenotypische karakterisering door middel van flowcytometrie
      1. Maak de cellen los met behulp van trypsine/EDTA, zoals beschreven in de stappen 2.3.1 tot en met 2.3.2.
      2. Verzamel de cellen in een conische buis (50 ml) en centrifugeer bij 250 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS.
      3. Tel de cellen zoals beschreven in stap 2.2.4 en zaai 0,5-1 x 106 cellen in 100 μL PBS in een plaat met 96 putjes.
        OPMERKING: Het aantal putjes is afhankelijk van de kleur van het fluorochroomconjugaat en de filters/lasers van de cytometer.
      4. Voeg antilichamen (tabel 1) verdund in 1% BSA toe in PBS.
        OPMERKING: Het is niet nodig om Fc-blok te gebruiken om niet-specifieke binding te voorkomen, omdat we al BSA gebruiken om antilichamen te verdunnen. Reserveer een monster van cellen zonder antilichamen te ontvangen die zullen worden gebruikt als controle op kleuring. De antilichamen kunnen in dezelfde put worden gecombineerd volgens de fluorochroom kleurstof en cytometer die in het laboratorium beschikbaar zijn. Alle in tabel 1 beschreven antilichamen kunnen in hetzelfde putje worden toegevoegd, behalve de CD71 FITC en CD29 FITC, die zich in verschillende putjes moeten bevinden vanwege hetzelfde fluorochroom.
      5. Incubeer de plaat 30 minuten bij 4 °C in het donker.
      6. Was de cellen, vul het volume aan tot 200 μl met behulp van PBS, centrifugeer de plaat bij 252 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap nog een keer.
      7. Fixeer de cellen door 200 μL per putje 2% formaldehyde toe te voegen aan PBS. Bewaar de cellen in het donker bij 4 °C tot ze worden geanalyseerd in de flowcytometer.
        OPMERKING: Voor het beste resultaat moet u de cellen op de flowcytometer zo snel mogelijk verkrijgen. De helderheid van de fluorescentie van markers neemt voor de meeste fluorochromen na 48 uur aanzienlijk af. Overschrijd dus niet langer dan 48 uur om de plaat te lezen. Acquisitie van 30.000 evenementen wordt aanbevolen.
      8. Gebruik de gating-strategie in figuur 2B om de ASC-populatie te selecteren.
    2. Functionele karakterisering: Osteogene differentiatie
      1. Maak de cellen los met behulp van trypsine/EDTA (zoals beschreven in de stappen 2.3.1 tot en met 2.3.2), verzamel en centrifugeer de cellen (zoals beschreven in de stappen 2.4.1.2 en 2.4.1.2) en tel ze (zoals beschreven in stap 2.2.4).
      2. Plaat, in drievoud, 2 x 105 cellen per putje in 6-putjes platen in basale mediaal (DMEM aangevuld met 10 % FBS en 1 % antibiotica); incuberen bij 37 °C in 5% CO2 .
        OPMERKING: Er zijn twee platen met 6 putjes nodig, één voor elke differentiatietijd (14 en 21 dagen).
      3. Vervang de volgende dag het medium door osteogeen medium (stap 1.4.1).
        OPMERKING: reserveer 3 putten die alleen worden gekweekt met het basale medium, dat de controle zal zijn voor differentiatie.
      4. Kweekcellen gedurende 14 en 21 dagen in osteogene media en de controlecellen, waarbij de media om de 3 dagen worden vervangen. Ga verder met Von Kossa-kleuring (stap 1.4.2) om de gemineraliseerde knobbeltjes aan het einde van elke kweekperiode te beoordelen.
      5. Zuig het medium uit elk putje op en was de cellen twee keer met PBS. Fixeer de cellen met 2 ml 70% ethanol een nacht bij kamertemperatuur (RT). Was de cellen voorzichtig in stromend water.
      6. Voeg 2 ml 5% zilvernitraatoplossing toe en incubeer de plaat gedurende 1 uur in ultraviolet licht. Was de cellen met gedestilleerd water. Voeg 2 ml 5% natriumthiosulfaat toe en incubeer gedurende 5 minuten. Wassen met gedestilleerd water.
      7. Bestrijk de vlek met 2 ml eosine gedurende 40 s. Was met gedestilleerd water totdat de kleuroplossing is verwijderd en visualiseer de kleuring met een optische microscoop.
    3. Functionele karakterisering: Adipogene differentiatie
      1. Maak de cellen los met behulp van trypsine/EDTA (zoals beschreven in de stappen 2.3.1 tot en met 2.3.2), verzamel en centrifugeer de cellen (zoals beschreven in de stappen 2.4.1.2 en 2.4.1.2) en tel ze (zoals beschreven in stap 2.2.4).
      2. Plaat: 2 x 10,5 cellen per putje in 6-putjes platen in basale mediaal (DMEM aangevuld met 10 % FBS en 1 % antibiotica); incuberen bij 37 °C in 5% CO2 .
        OPMERKING: Er zijn twee platen met 6 putjes nodig, één voor elke differentiatietijd (14 en 21 dagen).
      3. Vervang de volgende dag het medium door het adipogene medium (stap 2.5.1).
        OPMERKING: Reserveer 3 putjes die alleen worden gekweekt met het basale medium als controle.
      4. Kweek cellen gedurende 14 en 21 dagen in adipogeen medium, waarbij het medium om de 3 dagen wordt vervangen. Aan het einde van elke kweekperiode gaat u over tot olie-rode O-kleuring (stappen 2.4.3.5-2.4.3.7), een indicator van intracellulaire lipideaccumulatie.
      5. Zuig de media uit elke put op. Was de cellen twee keer met PBS. Fixeer cellen in 2 ml 10% formaline gedurende 1 uur. Was een keer met PBS en daarna een keer met water.
      6. Vlek met 2 ml Oil-Red O-oplossing in 60% isopropanol gedurende 5 min. Was een keer met gedestilleerd water.
      7. Tegenvlek met 2 ml 1% hematoxyline verdund 1:2 in gedestilleerd water gedurende 1 minuut. Was met gedestilleerd water totdat de kleuroplossing is verwijderd en visualiseer de gekleurde monsters met een optische microscoop.
    4. Functionele karakterisering: Chondrogene differentiatie
      1. Maak de cellen los met behulp van trypsine/EDTA (zoals beschreven in de stappen 2.3.1 tot en met 2.3.2), verzamel en centrifugeer de cellen (zoals beschreven in de stappen 2.4.1.2 en 2.4.1.2) en tel ze (zoals beschreven in stap 2.2.4).
      2. Plaats 5 x 105 ADSC's in vier conische buizen van polypropyleen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g om een pellet te vormen. Gooi het supernatant weg.
      3. Kweek de pellets gedurende 14 en 21 dagen in een conische buis in een chongeen medium (stap 1.6.1) of alleen in een basaal medium (differentiatiecontrole) bij 37 °C in 5% CO2. Vervang het medium elke 3 dagen en vermijd het verwijderen van pellets.
        OPMERKING: Elke celpellet verwijst naar elke kweektijd, evenals hun respectievelijke controles die alleen met basaal medium zijn gekweekt.
      4. Verzamel aan het einde van elk kweektijdstip de pellets met een pincet met een fijne punt en plaats ze op een plaat met 24 putjes. Ga verder met histologische doorsnede en kleuring van proteoglycanen en glycosaminoglycanen (stappen 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        LET OP: Elke korrel wordt in een aparte put verwerkt.
      5. Fixeer de pellets in 2 ml 10% gebufferd formaldehyde gedurende 30 minuten. Gooi de formaldehyde-oplossing weg en voeg 2 ml 70% ethanol toe. Verwijder de pellet met behulp van een punt uit de conische buis en veranker de pellets in paraffine.
      6. Maak met een roterende paraffinemicrotoom histologische doorsneden van 5 μm. Incubeer de secties gedurende 15 minuten bij 60 °C en dompel ze twee keer onder in xyleen (gedurende 5 en 15 minuten).
      7. Rehydrateer de monsters door de histologische secties onder te dompelen in alcoholbaden in afnemende concentraties (100%, 96%, 80% en 70%) gedurende elk 2 minuten en spoel vervolgens gedurende 5 minuten af met gedeïoniseerd water.
      8. Ga verder met het kleuren van de monsters met Alcian blauw 1% in azijnzuur, pH 2,5, gedurende 30 minuten.
      9. Bestrijk de vlek gedurende 1 minuut met hematoxyline en was met gedestilleerd water. Monteer met DPX (mountant voor histologie) of een andere montageoplossing en visualiseer monsters met behulp van een optische microscoop.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen geëxtraheerd uit vetweefsel volgens het hier gepresenteerde protocol vertoonden een morfologie die voldeed aan de minimale criteria voor MSC's voorgesteld door ISCT. Een overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. Fenotypisch vertoonden ADSC's in de eerste dagen van de celkweek aanhankelijkheid aan plastische en fibroblastachtige morfologie (Figuur 2A). Bovendien groeiden ze homogeen en vormden ze kolonies. Bovendien vertoonden ADSC's een lage expressie van CD34 (2,12%) en CD45 (1,81%), beide hematopoëtische markers, en een hoge expressie van CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) en CD90 (55,1%), allemaal mesenchymale celmarkers (Figuur 2B).

figure-results-1
Figuur 2: Fenotypische karakterisering van van vetweefsel afgeleide cellen. (A) De morfologie van ADSC's verandert van rond naar fibroblastachtig op dag 2, 4 en 8 van de kweek; schaalbalk = 22,22 μm. (B) Histogrammen voor markers die al dan niet (CD71, CD29 en CD90) door ASC worden uitgedrukt (CD34 en CD45). Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Miranda et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Functioneel gezien vertoonden ADSC's multipotentie om te differentiëren in osteoblast, adipoblast en chondroblast wanneer ze gedurende 14 of 21 dagen in geconditioneerde media voor elke afstamming werden gekweekt (Figuur 3). De Von Kossa-kleuring onthulde gemineraliseerde knobbeltjes in de extracellulaire matrix, kenmerkend voor het osteogeneseproces (Figuur 3). De olierode O-kleuring toonde lipidevacuolen aan in het cytoplasma van ADSC's, en de Alcian Blue-kleuring bevestigde de aanwezigheid van glycosaminoglycaan in de extracellulaire matrix (Figuur 3). Samen hebben fenotypische en functionele kenmerken de populatie van cellen die uit epididymaal vetweefsel worden geëxtraheerd als MSC's bevestigd.

figure-results-2
Figuur 3: Functionele karakterisering van van vetweefsel afgeleide cellen. Osteogene, adipogene en chondrogene multiafstammingspotentieel van ADSC na 14 en 21 dagen op kweek. Schaalbalk = 50 μm (bovenste paneel), 100 μm (middelste en onderste panelen). Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Miranda et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De MSC's kunnen uit verschillende weefsels worden geëxtraheerd. Ondanks dat beenmerg een veel voorkomende bron van MSC's vertegenwoordigt bij zowel muizen als mensen25,26, hebben we ervoor gekozen om in deze studie met vetweefsel te werken vanwege de rijkdom aan MSC's, de distributie in het lichaam en de gemakkelijke toegang ertoe. Als alternatief kunnen van vet afgeleide stamcellen worden gebruikt om MSC's-achtige onsterfelijke cellen te genereren27.

Sommige punten van de extractie verdienen speciale aandacht voor het succes van de hier gedeelde protocollen. Ten eerste benadrukken we de zorg om het weefsel te verzamelen dat in aseptische omstandigheden moet worden gedaan. Zorg er dus voor dat de muizen goed worden gedesinfecteerd met 70% alcohol voordat u met de operatie begint. Een ander belangrijk punt is om niet dezelfde set pincetten en scharen te gebruiken om het epididymale vetweefsel op te pakken, waardoor elke besmettingsbron wordt vermeden.

Een tweede punt van zorg is de verwerking van weefsel. De fragmenten in de conische buis moeten goed en krachtig worden geschud met 10 minuten incubatie bij 37 °C. Het is erg belangrijk om het medium de volgende dag te vervangen en vervolgens om de 2-3 dagen. Het wordt aanbevolen om de cultuur dagelijks te observeren en de gemiddelde kleur, celvorm en eventuele interferentie in de omgeving van de cultuur te controleren.

Een derde zorg betreft de beste tijd/passage voor MSC-karakterisering. Hier raden we aan om het bij de derde doorgang van cellen te doen, maar dit is niet verplicht. Het hangt af van het doel van het onderzoek. In de derde passage hebben we ongeveer 80% van de cellen gekarakteriseerd als MSC's, wat genoeg is voor de doelstellingen van deze studie bijvoorbeeld. De fenotypische karakterisering wordt uitgevoerd door de expressie van hematopoëtische markers (bijvoorbeeld CD34 en CD45) en mesenchymale markers (bijvoorbeeld CD29, CD73, CD90 en CD105) te analyseren. Bovendien benadrukt de International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT)21 dat de ADSC's een fibroblastachtige morfologie moeten hebben en zich moeten houden aan het plastic van het kweekplatform. De morfologie kan tijdens de groeicultuur onder een microscoop worden waargenomen. De functionele karakterisering wordt uitgevoerd door het potentieel van ADSC's te analyseren om te differentiëren in osteoblast-, adipoblast- en chondroblastcellen. In de fenotypische karakterisering kan het percentage mesenchymale en hematopoëtische markers variëren afhankelijk van de diersoort en de celbron, en niet volledig voldoen aan de door het ISCT aanbevolen aantallen. De ISCT beveelt bijvoorbeeld voor menselijke MSC's ≥95% van CD105, CD73, CD90 en ≤2% van CD45, CD34, CD14 of CD11b, CD79a of CD19 aan, humaan leukocytenantigeen - DR-isotype (HLA-DR)21. Bovendien is het belangrijk om de functionele karakterisering uit te voeren en de multipotentie van cellen te bevestigen die differentiëren tot osteoblasten, chondrocyten en adipocyten. Ten minste twee van deze afstammingslijnen worden aanbevolen om multipotentie te bewijzen.

Naast deze gemarkeerde punten kunnen sommige hier voorgestelde tests worden vervangen, bijvoorbeeld Alizarin Red S in plaats van Von Kossa-kleuring, Periodic Acid Shiff in plaats van Alcian Blue en polymerasekettingreactie (PCR) in plaats van flowcytometrie.

Van de drie soorten vetweefsel die bij mensen worden beschreven (wit, bruin en beige), heeft wit vetweefsel de hoogste bron van MSC's28. Dit weefsel kan worden verkregen uit onderhuidse, abdominale en liesstreek, zoals het vet boven de hier gerapporteerde bijbal. De fysieke fragmentatie en enzymatische vertering door collagenase die in het hier gedeelde protocol wordt gebruikt, leiden de stromale vasculaire fractie (SVF) af die bestaat uit vele celtypen, behalve de adipocyten, die tijdens de verwerking uitgeput raken.

Concluderend zijn de belangrijkste voordelen van het gebruik van vetweefsel als bron van MSC's onder meer hun overvloed en het gemak van methoden voor celisolatie, geassocieerd met het therapeutisch potentieel van de MSC's als ontstekingsremmende en regeneratieve eigenschappen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek ondersteund door een subsidie van de Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) en Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG en URS dankzij de beurs verleend door respectievelijk Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
140 °C High Heat Sterilization CO2 IncubatorRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinaC180
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Acetic acid glacialSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% in water
Amphotericin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acidSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
Automatic pipettesThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
BeakerNiet van toepassing1 eenheid
Bovine serum albuminSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Cell culture plates (6-well)Merck, Darmstadt, GermanyZ70775907 eenheden steriele. TPP weefselkweekplaten
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)Merck, Darmstadt, GermanyCLS35307701 eenheid steriele. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-behandeld oppervlak, ronde bodem heldere wells, steriele
Chondrogenic mediumStem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life TechnologiesA1007101TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-fosfaat
Collagenase type IILife Technologies, California, USA17101015
kurk- of piepschuimbord bedekt met aluminiumNiet van toepassing1 eenheid
katoenNiet van toepassing50 g
DexamethasoneSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
Dissectie schaarNiet van toepassing03 eenheden steriele
DPX-bevestigingsmiddel voor histologieSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco’s gewijzigd Eagle’s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523Met 1000 mg/L glucose en L-glutamine, zonder natriumbicarbonaat, poeder, geschikt voor celkweek
Eosine BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Fetaal bovien serum (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
FormaldehydeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
FormalineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
GentamicineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
HematoxylineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Hypodermische naald (0,3 mm x 13 mm)Niet van toepassing5 eenheden
IndomethacineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI0200000
InsulinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride oplossingSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061,0 mg/mL in methanol (als vrije base), gecertificeerde referentiemateriaal, Cerilliant®
Neubauer kamerSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620BRAND tellingskamer BLAUBRAND Neubauer patroon. Met clips, dubbel geregeld
Nichiryo pipettentips (0,1–10 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645540Volumebereik 0,1–10 μL, langwerpig, bulkpack. Steriele
Nichiryo pipettentips (1–10 mL)Merck, Darmstadt, GermanyZ717401Volumebereik 1–10 mL, universeel, bulkpack. Steriele
Nichiryo pipettentips (200 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645516Maximaal volume 200 μL, gradueel, ministack. Steriele
Oil-Red O oplossingSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910,5% in isopropanol
ParaffineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146–48, in blokvorm
Penicilline/StreptomycineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Oplossing gestabiliseerd, met 10.000 eenheden penicilline en 10 mg streptomycine/mL, 0,1 μm gefilterd, BioReagent, geschikt voor celkweek
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Poeder, pH 7

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van stamcellenflowcytometrieosteogene differentiatieadipogene differentiatiechondrogene differentiatiecollagenase digestieepididymale weefsels van muizen

Gerelateerde artikelen