Eencellige sortering van immunofenogetypeerde mesenchymale stamcellen van menselijke geëxfolieerde bladverliezende tanden

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering van menselijke mesenchymale stamcellen met behulp van de single-cell sorteermethode. In het bijzonder kan het gebruik van eencellige sortering een zuiverheid van 99% van de immunofenogetypeerde cellen uit een heterogene populatie bereiken in combinatie met een op multiparametrische flowcytometrie gebaseerde benadering.

Abstract

De mesenchymale stamcellen (MSC's) van een organisme bezitten een buitengewoon vermogen om te differentiëren in meerdere afstammingslijnen van volwassen cellen in het lichaam en staan bekend om hun immunomodulerende en ontstekingsremmende eigenschappen. Het gebruik van deze stamcellen is een zegen voor het gebied van regeneratieve biologie, maar tegelijkertijd een vloek voor regeneratieve geneeskunde en therapieën vanwege de vele cellulaire dubbelzinnigheden die ermee gepaard gaan. Deze ambiguïteiten kunnen voortkomen uit de diversiteit in de bron van deze stamcellen en uit hun in vitro groeiomstandigheden, die beide een weerspiegeling zijn van hun functionele heterogeniteit.

Dit garandeert methodologieën om gezuiverde, homogene populaties van MSC's te leveren voor therapeutische toepassingen. Vooruitgang op het gebied van flowcytometrie heeft de detectie van eencellige populaties mogelijk gemaakt met behulp van een multiparametrische benadering. Dit protocol schetst een manier om stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden (SHED's) te identificeren en te zuiveren door middel van fluorescentie-ondersteunde eencellige sortering. Gelijktijdige expressie van oppervlaktemarkers, namelijk CD90-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), CD73-peridinine-chlorofyl-eiwit (PerCP-Cy5.5), CD105-allofycocyanine (APC) en CD44-V450, identificeerde de "heldere", positieve uitdrukkers van MSC's met behulp van multiparametrische flowcytometrie. Er werd echter een significante daling waargenomen in het percentage viervoudige uitdrukkers van deze positieve markers vanaf passage 7 tot de latere passages.

De immunofenogetypeerde subpopulaties werden gesorteerd met behulp van de eencellige sorteermodus, waarbij slechts twee positieve en één negatieve marker de inclusiecriteria vormden. Deze methodologie zorgde voor de levensvatbaarheid van de cellen van de gesorteerde populaties en handhaafde de celproliferatie na het sorteren. De stroomafwaartse toepassing voor een dergelijke sortering kan worden gebruikt om afstammingsspecifieke differentiatie voor de gated subpopulaties te evalueren. Deze aanpak kan worden toegepast op andere eencellige systemen om de isolatieomstandigheden te verbeteren en voor het verkrijgen van informatie over markers op het oppervlak van meerdere cellen.

Introduction

Mesenchymale stamcellen (MSC's) kunnen worden beschouwd als een schaalbare bron van cellen die geschikt zijn voor celgebaseerde therapieën en kunnen worden beschouwd als een gouden standaardsysteem in de regeneratieve geneeskunde. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit verschillende bronnen in het lichaam met verschillende weefseloorsprongen1. Afhankelijk van het bronweefsel vertoont elk type MSC een dubbelzinnig in vitro gedrag². Dit is goed te zien aan hun morfologische en functionele eigenschappen³. Meerdere studies hebben intraklonale variatie in dimensies aangetoond, waaronder differentiatie van volwassen weefsel, genomische toestand en metabole en cellulaire architectuur van MSC's ^2,4.

Immunofenotypering van cellen is een veel voorkomende toepassing van flowcytometrie voor de identificatie van stamcellen en dit werd in 2006 door de International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) gebruikt om een lijst met minimale criteria voor te schrijven om cellen als MSC's te identificeren. Het verklaarde dat samen met plastische adherence en het vermogen om in vitro te differentiëren in drie afstammingslijnen (osteogeen, chondrogenisch en adipogeen), ≥95% van de celpopulatie CD105, CD73, CD90 tot expressie moet brengen, en dat deze cellen de expressie (≤2% positief) van CD34, CD45, CD11b, CD14 en HLA-DR moeten missen, zoals gemeten met flowcytometrie⁵. Hoewel de MSC's werden gedefinieerd door een reeks biomarkers volgens de minimale criteria van de ISCT, konden hun immuuneigenschappen niet worden gebenchmarkt met deze biomarkers en was er behoefte aan meer dan deze criteria om vergelijkingen tussen studies en klonale variaties gemakkelijker te^{kwantificeren 2}.

Ondanks de richtlijnen van ISCT heeft uitgebreid onderzoek naar MSC's aangetoond dat er heterogeniteit bestaat in deze populatie, die kan ontstaan als gevolg van een veelheid aan factoren, voornamelijk als gevolg van de alomtegenwoordige aard van heterogeniteit die ontstaat tussen MSC-donoren⁶, weefselbronnen⁷, individuele cellen binnen een klonale populatie⁸ en kweekomstandigheden^{2,9, 10}. okt. Karakterisering en zuivering van deze primaire cellen uit verschillende weefselbronnen om de kwaliteit en het lot van de cellen te waarborgen, zijn belangrijke stappen in hun productie. De noodzaak om de getoonde variaties onder de populatie te begrijpen, vereist een efficiënte methode om deze op te lossen in subpopulaties die afzonderlijk kunnen worden onderverdeeld en verzameld¹¹. Analyses op celniveau helpen de uitdagingen van celvariatie te overwinnen, biologische ruis te verminderen die voortkomt uit een heterogene populatie en bieden de mogelijkheid om zeldzame cellen te onderzoeken en te karakteriseren¹².

Op basis van het doel en de gekozen parameters kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de geselecteerde populaties te sorteren en te verrijken. Celsorteertechnieken kunnen zowel bulksortering als single-cell sorteermethoden omvatten. Terwijl bulksortering doelpopulaties kan verrijken door middel van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS)13, fractionering 14 en elutriatie¹⁵, kan eencellige sortering meer homogene populaties verrijken door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)¹¹. Tabel 1 geeft een vergelijkende analyse van elk van deze methoden met zijn eigen voor- en nadelen.

Tabel 1: Vergelijkende analyses van verschillende technieken: MACS, fractionering, elutriatie en FACS, waarbij de verschillen in hun principe en de voor- en nadelen van het kiezen van een bepaalde techniek boven een andere worden benadrukt. Afkortingen: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = Fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Sinds de komst van de techniek heeft single-cell flowcytometrie een belangrijke rol gespeeld bij het opsommen¹⁶, de detectie en karakterisering van een specifieke celpopulatie in een heterogeen monster¹⁷. Hewitt et al. legden in 2006 de basis voor een geautomatiseerde celsorteermethode om de isolatie van homogene pools van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (hESC's) te ^verbeteren18. Single-cell sortering verrijkte de populatie van GFP-getransduceerde hESC's waardoor de isolatie van genetisch gemodificeerde klonen werd vergemakkelijkt, wat een nieuwe dimensie in klinisch onderzoek opende. Om de sorteerefficiëntie te verbeteren, zijn over het algemeen twee benaderingen gevolgd; Ofwel worden de verzamelmedia van de gesorteerde populaties aangepast om de levensvatbaarheid en proliferatie van nagesorteerde cellen^{te behouden 19} , ofwel wordt het algoritme/de software voor het sorteren van cellen op passende wijze aangepast¹².

Met de vooruitgang van de technologie zijn commerciële flowcytometers en celsorteerders in staat geweest om uitdagingen aan te pakken die werden aangegaan bij het aseptisch sorteren van fragiele en zeldzame celpopulaties, met name stamcellen van verschillende oorsprong. Een van de grootste uitdagingen van stamcelbiologen is de klonale isolatie van menselijke pluripotente stamcellen volgens transfectieprotocollen die vereist zijn in genbewerkingsstudies¹⁹. Dit werd aangepakt door afzonderlijke cellen te sorteren in platen met 96 putjes die werden gecoat met Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF's), samen met supplementen en commerciële ROCK-remmers met kleine moleculen. Celisolatiestrategieën kunnen echter grotendeels worden verfijnd met behulp van indexsortering, een kenmerk van het sorteeralgoritme dat het immunofenotype van individuele gesorteerde cellen identificeert¹². Deze verfijnde modaliteit bij het sorteren van eencellige cellen hielp niet alleen bij het verbeteren van de sorteerefficiëntie voor stamcellen, vooral met betrekking tot zeldzame hematopoëtische stamcelpopulaties, maar koppelde ook efficiënt eencellige klonen aan hun stroomafwaartse functionele assays²⁰.

Dit artikel richt zich op het sorteren van eencellige cellen van immunofenogetypeerde stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden (SHED's) voor de verrijking van subpopulaties om hun functionele differentiatiecapaciteiten te bestuderen. Met behulp van een combinatie van twee MSC-positieve markers, CD90 en CD73, en een negatieve hematopoëtische marker CD45, werden de MSC's immunofenotypeerd en werden de dim- en null-expressoren geïdentificeerd. Op basis van hun immunofenotype werden de subpopulaties geïdentificeerd als zuivere MSC's, enkelvoudige positieve en dubbelnegatieve populaties. Ze werden gesorteerd met behulp van de single-cell sorteringsmodus om zuivere en verrijkte subpopulaties te verkrijgen voor verdere functionele studies om vast te stellen of de differentiële expressie van markers een artefact was van in vitro kweekomstandigheden of dat het ook enig effect heeft op de functionele eigenschappen. Cellen die geen homogene expressie waren van de "positieve MSC-markers" werden gesorteerd om hun functionele eigenschappen te bestuderen.

Protocol

Ethische goedkeuring en toestemming om deel te nemen: Menselijke geëxfolieerde bladverliezende tandpulpmonsters werden ontvangen na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming en volledige ethische goedkeuring door Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) Oral and Maxillofacial Department, Bengaluru, in overeenstemming met de normen die zijn vastgesteld door de Hospital Ethical Clearance Committee, SRGCDS. Waarna isolatie, kweek, onderhoud en toepassing van SHED's werden goedgekeurd door en in overeenstemming met de richtlijnen die worden aanbevolen door het Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) van het Manipal Institute of Regenerative Medicine, MAHE - Bengaluru. Zie de Tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

1. Bereiding van reagentia en buffers

1. Voor cultuuronderhoud
   1. Bereid MSC-celkweekmedia (10%) met behulp van basaal medium voor ongedifferentieerde hESC's, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine (pen-streptomycine) (tabel 2).
   2. Bereid MSC-celkweekmedia (20%) voor met behulp van basaal medium voor ongedifferentieerde hESC's, 20% FBS, 1% L-glutamine en 1% Pen-strep (Tabel 2).
   3. Bereid neutraliserende media voor met behulp van basaal medium voor ongedifferentieerde hESC's, 1% L-glutamine en 1% antibioticum-antimycoticum (anti-anti) (tabel 2).
2. Voor flowcytometrische analyse en sortering
   1. Bereid kleuringsbuffer voor met 2% FBS in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   2. Bereid een stockoplossing van 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (1 μg/ml) door 1 μl aan 1 ml PBS toe te voegen
3. Voor afstammingsspecifieke differentiatie van MSC's
   1. Bereid differentiatiemedia voor osteogene, chondrogene en adipogene differentiatie voor volgens de in tabel 3 beschreven samenstelling. Bewaar de bereide aliquots bij 4 °C voor de duur van het experiment.
   2. Bereid serum-uitgehongerde media (2% media) met behulp van basaal medium voor ongedifferentieerde hESC's, 2% FBS, 1% L-glutamine en 1% Pen-strep (tabel 2).

SOORT MEDIA			DOEL VAN DE MEDIA			SAMENSTELLING VOOR 50 ml
						FBS (FBS)	Pen-Streptokokken	L-Glutamine	BASAAL MEDIUM VOOR ONGEDIFFERENTIEERDE hESC's
10% media			MSC-cultuur en onderhoud			5 ml	500 μL	500 μL	44 ml
20% media			CFU-F-test			10 ml	500 μL	500 μL	39 ml
Serum uitgehongerd (2%) media			Media voor controleputten in differentiatieprotocol			1 ml	500 μL	500 μL	48 ml
Neutraliserende media			Media voor het neutraliseren van de celsuspensie na trypsinisatie			-	500 μL	500 μL	49 ml

Tabel 2: Celkweekmedia voor kweekonderhoud en assays. Afkortingen: MSC = mesenchymale stamcel; CFU-F = kolonievormende eenheid-fibroblast.

ONDERDELEN	OSTEOGENE MEDIA	CHONDROGENE MEDIA	ADIPOGENE MEDIA
Basale media	90 ml	90 ml	90 ml
Inductie media	10 ml	10 ml	10 ml
Totaal volume	100 ml	100 ml	100 ml

Tabel 3: Differentiatiemedia voor trilineaire differentiatie van SHED's.

2. Kweek en onderhoud van SHED's

1. Onderhoud cellen in 10% MSC-kweekmedia en voer mediawissels uit om de 2 dagen of indien nodig.
2. Trypsiniseer cellen bij 95% confluentie met 0,25% trypsine-EDTA.
3. Neutraliseer cellen na trypsinisatie met behulp van neutraliserende media.
4. Centrifugeer de buis bij 300 × g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur om een celpellet te verkrijgen.
5. Decanteer het supernatans en resuspendeer de celpellet in 10% MSC-kweekmedia.
6. Zaadcellen in vers bereide celkweekschaaltjes met 10% MSC-kweekmedia voor verdere experimenten of subkweek.
   OPMERKING: De optimale zaaidichtheid voor SHED's is 0,2 × 10 6 cellen in een schaal van 100 mm en 0,8 × 10 6 cellen in een T-75-kolf, om respectievelijk 1,5 × 10 6 cellen en 4 × 10 ⁶ cellen te verkrijgen bij 90-100% confluentie.

3. Karakterisering van MSC's

1. Celgroeitest op korte termijn
   1. Zaad 4 × 10⁴ cellen/putje in drievoud in platen met 6 putjes in 10% MSC-kweekmedia.
   2. Incubeer de platen gedurende 7 dagen bij 37 °C en ververs de media om de 2 dagen.
   3. Oogst de cellen op dag 2, 4 en 8 met 0,25% trypsinebehandeling en was ze met kweekmedia.
   4. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer de pellet in 1 ml media.
   5. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en bepaal hun levensvatbaarheid met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode.
   6. Bereken de proliferatiesnelheid met behulp van vergelijking (1):
      (1)
2. Kolonievormende eenheid-fibroblast (CFU-F) test
   1. Zaai 10.000 cellen in een schaaltje van 100 mm en kweek ze op in 20% MSC-kweekmedia.
   2. Incubeer de platen gedurende 14 dagen bij 37 °C en ververs de media om de 3 dagen.
   3. Spoel de kolonies na 14 dagen af met PBS, fixeer ze met kristalviolette kleurstof in methanol en spoel ze opnieuw met PBS om de resterende vlek te verwijderen.
   4. Tel en breng de kolonies in beeld.
      OPMERKING: Tel kolonies met >50 cellen. De efficiëntie van kolonievorming wordt berekend als het aantal kolonievormende eenheden.
3. Immunofluorescentie-test
   1. Zaai de MSC's op schaaltjes van 35 mm en laat ze groeien tot 80-90% samenvloeiing.
   2. Verwijder de media en spoel de vaat één keer met PBS.
   3. Fixeer de cellen met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) door ze 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C te laten incuberen.
   4. Was na fixatie de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
   5. Voeg 0,3% Triton X-100 toe in PBST (0,05% Tween 20-oplossing in PBS) voor permeabilisatie van de cellen. Bewaar het 15 minuten op kamertemperatuur op de wipstoel.
   6. Was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
   7. Voeg 3% runderserumalbumine (BSA) toe voor blokkering en houd het 1 uur op kamertemperatuur op de rocker.
   8. Was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
   9. Voeg 800 μL 1:500 verdunning van muisanti-vimentine toe, bewaar het 1 uur op kamertemperatuur op de wip en breng de plaat over naar 4 °C voor een nacht incubatie.
   10. Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam en was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 minuten op de wipstoel.
   11. Voeg 800 μL 1:1.000 verdunning van geit anti-muis IgG (H+L) kruislings geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 555, toe en bewaar dit gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op de wipstoel.
   12. Was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
   13. Voeg Alexa fluor 488 Phalloidin Probes 240 μL toe in 1.000 μL PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten op de wipstoel.
   14. Was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
   15. Voeg 700 μL DAPI-montant toe en observeer de cellen onder een microscoop.
4. Afstammingsspecifieke differentiatie
   1. Differentiatie volgens 2D-cultuur
      1. Neem twee platen met 48 putjes en label ze als respectievelijk osteogene en adipogene afstammingslijnen.
      2. Zaai 15.000 cellen/putje in vier putjes van elke plaat en kweek ze in 10% MSC-kweekmedia.
      3. Zodra de monolaag van cellen 90% samenvloeiing heeft bereikt, labelt u de eerste twee putjes als 'Controle' en vervangt u de bestaande media door serumuitgehongerde media (2% media). Voeg in de laatste twee putten met het label 'Test' differentiatiemedia toe van een van de twee afstammingslijnen, adipogeen of osteogeen. Markeer dit als Dag 0.
      4. Vervang de media voorzichtig om de drie dagen om peeling te voorkomen en zorg ervoor dat u verontreiniging voorkomt.
      5. Handhaaf deze voorwaarden tot de eenentwintigste dag; Verwerk vervolgens voor het kleuringsexperiment.
   2. Differentiatie volgens 3D-cultuur
      1. Neem twee buisjes van 15 ml voor het uitvoeren van chondrogene differentiatie met behulp van 3D-pelletcultuur.
      2. Breng 1 × 10 6 cellen over in elke buis en centrifugeer gedurende⁶ minuten bij 300 × g om een pellet te vormen. Label een tube als 'Control' en voeg er 10% MSC-kweekmedia aan toe; label de andere buis als 'Test' en voeg chondrogene differentiatiemedia toe. Plaats de buisjes voorzichtig in de couveuse met de doppen losjes vastgeschroefd. Markeer dit als Dag 0.
      3. Vervang de media om de drie dagen zorgvuldig, om te voorkomen dat de pellet losraakt/desintegreert tijdens het wisselen van media.
      4. Handhaaf deze omstandigheden tot de eenentwintigste dag en verwerk dan de cellen voor verdere experimenten.
5. Afstammingsspecifieke cytochemische kleuring
   1. Gebruik voor 2D-culturen de gedifferentieerde (test) en ongedifferentieerde MSC's (controleplaten) (uit stap 3.4.1.5.) voor het kleuren, verwijder eerst de media en was tweemaal met PBS. Fixeer de cellen met 4% PFA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en was eenmaal met PBS. Voer de kleuring voor elke afstamming als volgt uit.
      1. Voeg voor de afstamming van adipocyten permeabilisatie-oplossing uit de kit toe en incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid en voeg 1 ml Oil red O werkoplossing toe en bewaar dit gedurende 10 minuten. Verwijder de vlek en geef vijf wasbeurten met gedestilleerd water.
      2. Voeg voor de afstamming van osteocyten 5% vers bereid zilvernitraat (in gedestilleerd water) toe aan elk putje en houd de plaat 1 uur onder UV. Verwijder de oplossing en voeg 2,5% natriumthiosulfaat toe om het niet-gereageerde zilver te verwijderen; Houd het 5 minuten aan. Verwijder de vlek, was twee keer met gedestilleerd water en observeer de gekleurde cellen onder een microscoop.
   2. Voor 3D-culturen wordt de pellet verzameld na het einde van de differentiatieperiode van stap 3.4.2.3 en worden cryosecties van het gedifferentieerde weefsel in de vorm van de pellet verkregen. Laat de glaasjes aan de lucht drogen en op kamertemperatuur zijn voordat u doorgaat met het kleuren.
      1. Volg voor de afstamming van chondrocyten de aanwijzingen van de kleurset om voldoende wasoplossing toe te voegen, verwijder deze, voeg de fixeeroplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten. Wassen met gedestilleerd water, de kleuroplossing toevoegen en 30 minuten incuberen. Driemaal wassen met 0,1 N zoutzuur; Voeg gedestilleerd water toe om de zuurgraad te neutraliseren. Observeer de gekleurde cellen onder een helderveldmicroscoop.

4. Kleuring van het celoppervlak voor immunofenotypering

OPMERKING: Aanbevolen celkweekplaten voor het verkrijgen van een optimaal aantal cellen in stappen 4.2-4.5 zijn schalen van 100 mm of T75-kolven.

1. Celvoorbereiding voor flowcytometrische experimenten
   1. Trypsiniseer en verzamel de cellen uit een confluente schaal/kolf en centrifugeer gedurende 6 minuten bij 300 × g om de celpellet te verkrijgen.
   2. Resuspendeer de pellet in 1 ml media en bepaal het levensvatbare celgetal met behulp van een hemocytometer volgens de trypanblauwe uitsluitingsmethode.
   3. Centrifugeer de celsuspensie na het tellen opnieuw en spoel de pellet nog twee keer met 1 ml kleurbuffer.
   4. Gooi het supernatans weg en breng de pellet ten slotte opnieuw in een geschikt volume van de kleuringsbuffer, afhankelijk van het protocol (zie stappen 4.2 tot 4.5).
2. Voorbereiding van compensatiecontroles
   1. Neem zeven FACS-buizen en label ze als Ongekleurd, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 en APC.
   2. Resuspendeer de laatste pellet in de kleurbuffer (zie stap 4.1.) met behoud van een celdichtheid van 0,5 × 10,6 cellen per 50 μL per buisje voor de Ongekleurde en DAPI buisjes.
   3. Bereid de enkelvoudig gekleurde buizen voor op compensatie zoals beschreven in tabel 4.
   4. Draai elke buis na bereiding voorzichtig in een draaikolk en incubeer gedurende 30 minuten in het donker.
   5. Na de incubatie twee wasbeurten geven door 1 ml kleurbuffer aan elke tube toe te voegen, gevolgd door een korte vortex en centrifugeren bij 200 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 500 μL kleurbuffer en zet deze opzij tot de acquisitie.
   7. Voer voor de DAPI-buis een warmteschokbehandeling uit door deze gedurende 5 minuten in een waterbad van 60 °C te incuberen, gevolgd door 15 minuten op ijs. Voeg 5 μL DAPI toe aan de suspensie en bewaar deze in het donker tot de run-acquisitie.
3. Voorbereiding van fluorescentie min één (FMO) controles
   1. Resuspendeer de laatste pellet in kleuringsbuffer (zie stap 4.1) met een celdichtheid van 0,5 ×^10,6 cellen per 50 μL voor elk buisje.
   2. Neem vijf FACS-buizen en label ze als CD44-V450-isotype, CD90-FITC, CD45-PE, CD73-PerCP Cy5.5-isotype en CD105-APC-isotype.
   3. Bereid de cel- en antilichaamsuspensie voor volgens tabel 5.
   4. Draai de buizen voorzichtig en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   5. Geef na incubatie twee wasbeurten met 1 ml kleurbuffer aan elke buis, gevolgd door een korte vortex en centrifugatie bij 200 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 500 μL kleuringsbuffer en zet deze opzij tot hij wordt verkregen.
4. Voorbereiding van monsters voor analyse
   1. Resuspendeer de laatste pellet in de kleuringsbuffer (zie stap 4.1) met een celdichtheid van 0,5 × 10⁶ cellen per 50 μl voor elke buis.
   2. Neem twee FACS-buizen en label ze als gemengde buizen 1 en 2.
   3. Bereid de cel- en antilichaamsuspensie voor volgens tabel 6.
   4. Draai de buizen voorzichtig en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   5. Geef na incubatie twee wasbeurten met 1 ml kleurbuffer aan elke buis, gevolgd door een korte vortex en centrifugatie bij 200 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 500 μL kleuringsbuffer en zet opzij tot het wordt verkregen.
5. Voorbereiding van monsters voor eencellige sortering
   1. Neem twee FACS-buisjes, voeg 1 ml FBS toe en rol het buisje rond tot er een gelijkmatige laag FBS is gevormd aan de binnenkant van elk buisje. Incubeer dit gedurende 1-2 uur terwijl u het monster verwerkt voor kleuring. Label deze buizen als Gemengde buizen 1 en 2.
   2. Resuspendeer de laatste pellet in de kleuringsbuffer (zie stap 4.1) met een celdichtheid van 2-3 × 10⁶ cellen per 50 μL voor elke buis.
   3. Bereid de cel- en antilichaamsuspensie voor in gemengde buisjes 1 en 2 volgens tabel 7.
   4. Draai de buizen voorzichtig en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   5. Geef na incubatie twee wasbeurten met 1 ml kleurbuffer aan elke buis, gevolgd door een korte vortex en centrifugatie bij 200 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 500 μL kleurbuffer en zet opzij. Voeg 15 minuten voor het sorteren 5 μL DAPI toe.
      OPMERKING: Houd er rekening mee dat voor sorteerexperimenten een hogere celdichtheid per buis wordt aanbevolen.

Type buis	Positieve Comp kralen*	Negatieve Comp kralen*	Cellen	Antilichaam toegevoegd
FITC-buis	1 druppel	1 druppel	–	Anti-humaan CD90-FITC (2 μL)
V450 buis	1 druppel	1 druppel	–	Anti-humaan CD44-V450 (2 μL)
PerCP-Cy 5.5 buis	1 druppel	1 druppel	–	Anti-humaan CD73-PerCP Cy 5.5 (2 μL)
PE-buis	1 druppel	1 druppel	–	Anti-humaan CD45-PE (2 μL)
APC-buis	1 druppel	1 druppel	–	Anti-humaan CD105-APC (2 μL)
DAPI buis	–	–	50 μL	–
Ongekleurde buis	–	–	50 μL	–
*1 druppel = 60 μL parelsuspensie

Tabel 4: Controlemonsters voor compensatie. Afkortingen: Comp = compensatie; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; APC = allofycocyanine; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit.

BUIS TYPE	ANTILICHAAM TEGEN POSITIEVE MARKER (2 μL)			ANTILICHAAM TEGEN NEGATIEVE MARKER (2 μL)	ISOTYPE ANTILICHAMEN TOEGEVOEGD (2 μL)	TOTAAL VOLUME ANTILICHAMEN	VOLUME VAN CELSUSPENSIE TOEGEVOEGD	VOLUME VAN DE TOEGEVOEGDE KLEURINGSBUFFER
CD90-FITC FMO buis	- Anti-menselijke CD44-V450			Anti-humaan CD45-PE	FITC IgG1 isotype	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anti-menselijk CD73 PerCP Cy 5.5
	- Anti-menselijk CD105-APC
CD73-PerCP Cy5.5 FMO-buis	- Anti-menselijke CD44-V450			Anti-humaan CD45-PE	PerCP Cy 5.5 IgG1 isotype	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anti-menselijk CD90-FITC
	- Anti-menselijk CD105-APC
CD44-V450 FMO buis	- Anti-menselijk CD90-FITC			Anti-humaan CD45-PE	V450 IgG1 isotype	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anti-humaan CD73-PerCP Cy 5.5
	- Anti-menselijk CD105-APC
CD105-APC FMO-buis	- Anti-menselijke CD44-V450			Anti-humaan CD45-PE	APC IgG1 isotype	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anti-menselijk CD90-FITC
	- Anti-humaan CD73-PerCP Cy 5.5
CD45-PE FMO-buis	- Anti-menselijke CD44-V450			-	PE IgG1 isotype	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anti-menselijk CD90-FITC
	- Anti-humaan CD73-PerCP Cy 5.5
	- Anti-menselijk CD105-APC

Tabel 5: FMO-controlemonsters. Afkortingen: FMO = fluorescentie min één; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; APC = allofycocyanine; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit.

BUIS TYPE	ANTILICHAAM TEGEN POSITIEVE MARKER (2 μL)		ANTILICHAAM TEGEN NEGATIEVE MARKER (2 μL)	TOTAAL VOLUME ANTILICHAMEN	VOLUME VAN CELSUSPENSIE TOEGEVOEGD	VOLUME VAN DE TOEGEVOEGDE KLEURINGSBUFFER
Gemengde buis 1	- Anti-menselijke CD44-V450		Anti-humaan CD45-PE	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anti-menselijk CD90-FITC
	- Anti-menselijk CD73-PerCP Cy5.5
	- Anti-menselijk CD105-APC
Gemengde buis 2	- Anti-menselijke CD44-V450		Anti-humaan CD45-PE	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anti-menselijk CD90-FITC
	- Anti-menselijk CD73-PerCP Cy5.5
	- Anti-menselijk CD105-APC

Tabel 6: Monsterbuisjes voor meerkleurige immunofenotypering van SHED's. Afkortingen: SHEDs = stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden; PE = fycoerythrine.

BUIS TYPE	ANTILICHAAM TEGEN POSITIEVE MARKER (3 μL)		ANTILICHAAM TEGEN NEGATIEVE MARKER (3 μL)	TOTAAL VOLUME ANTILICHAMEN	VOLUME VAN CELSUSPENSIE TOEGEVOEGD	VOLUME VAN VLEKBUFFER TOEGEVOEGD
Gemengde buis 1	- Anti-menselijk CD90-FITC		Anti-humaan CD45-PE	9 μL	50 μL	41 μL
	- Anti-menselijk CD73-PerCP Cy5.5
Gemengde buis 2	- Anti-menselijk CD90-FITC		Anti-humaan CD45-PE	9 μL	50 μL	41 μL
	- Anti-menselijk CD73-PerCP Cy5.5

Tabel 7: Eencellige sorteerreactiebuisjes. Afkortingen: FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit.

5. Sorteren in één cel

1. Voorbereiding van de celsorteerder
   1. Installeer een mondstuk van 100 μm in de sorteerder.
      OPMERKING: Het juiste mondstuk is ten minste vijf keer de diameter van het te sorteren deeltje. De voor het sorteren te gebruiken omhulselvloeistof moet worden bepaald op basis van het type monster en de gevoeligheid van het experiment; Voor dit experiment is gepatenteerde omhulselvloeistof gebruikt.
   2. Voer de dagelijkse kwaliteitscontrole van het instrument (QC) uit en stel de sorteerder in voor het experiment. Raadpleeg de handleiding van het instrument voor een gedetailleerde handleiding voor het instellen van het instrument.
2. Opstellen van de compensatiematrix
   1. Stel de compensatiematrix in met behulp van enkelvoudige compensatiebuisjes uit stap 4.2.
   2. Selecteer in de propriëtaire software Experiment in de werkbalk en klik op Compensatie instellen. Open Compensatiebesturingselementen maken.
   3. Controleer de markeringen en bevestig. Er wordt een nieuw preparaat toegevoegd met de naam "Compensatie", waarbij nieuwe buisjes, de markercontroles genaamd, automatisch door de software worden toegevoegd.
   4. Selecteer de Onbevlekte buis en voer deze uit om 5.000 gebeurtenissen op te nemen. Sleep de poort naar de celpopulatie en pas deze toe op alle compensatiebesturingselementen. Dit is om de spanningen en negatieve poort voor elke fluorescerende parameter in te stellen.
   5. Laad op dezelfde manier de compensatiebuizen voor één vlek afzonderlijk en registreer en bewaar de gegevens. Selecteer de poort die de populatie van belang afbakent en pas deze toe op alle compensatiecontroles. Dit is om de positieve poorten voor elke fluorescerende parameter in te stellen.
   6. Selecteer Experiment in de werkbalk en klik op Compensatiewaarden berekenen | link en opslaan.
      NOTITIE: Zodra de auto-comp-matrix is gegenereerd met behulp van de software, kunnen de spanningsparameters van de fluorochromen niet worden gewijzigd voor een van de kanalen in de gemengde buizen.
3. Data-acquisitie
   1. Noteer 10.000 cellen in elke buis uit stap 4.3. en 4.4 om gegevens te verzamelen voor analyse van het immunofenotype van de cellen.
4. Voorbereiding van de inzamelingsapparaten
   1. Afhankelijk van het doel van de gesorteerde celpopulaties, kunt u kiezen tussen platen met 6 putjes, 24 putjes, 48 putjes of 96 putjes.
   2. Smeer de putjes in met 200-500 μL FBS en houd de platen 2 uur ongemoeid.
   3. Verwijder na 2 uur de resterende FBS en voeg 200-500 μL 10% MSC-kweekmedia toe.
5. Cellen sorteren in de sorteermodus voor één cel
   1. Voer Mixed tube 1 uit (vanaf stap 4.5) en noteer 10.000 gebeurtenissen om de poorten in te stellen op de populatie van belang die moet worden gesorteerd, met behulp van de juiste poortstrategie.
   2. Laad een verzamelplaat en stel het aantal doelcellen in tussen 2.500 en 5.000 cellen/put en selecteer het eencellige sorteerzuiverheidsmasker.
   3. Verzamel de gesorteerde populaties in het verzamelapparaat en bewaar ze op ijs tot het einde van het sorteerexperiment.
   4. Als u klaar bent, brengt u de platen over naar de 5% CO₂ -incubator om de culturen op 37 °C te houden.
      OPMERKING: Na de acquisitie werden onbewerkte gegevensbestanden geëxporteerd als .fcs-bestandsindeling (v.3.0. en hoger). De sorteerrapporten die na elk experiment werden gegenereerd, registreerden het aantal gebeurtenissen/cellen, gesorteerd op toegewezen put, en gaven het aantal conflicten aan dat werd afgebroken.

Results

De SHED's werden gekarakteriseerd met standaard immunofluorescentietesten die de expressie van vimentine (rode, type III intermediaire filamenten), actinefilamenten (Alexa fluor 488 phalloidine probes) en kernen gekleurd met DAPI (Figuur 1A) aantoonden. Om hun proliferatieve en kolonievormende capaciteiten te schatten, werden standaard kortetermijncelgroeitesten uitgevoerd. Een 14,3-voudige toename van de proliferatiesnelheid van dag 2 tot dag 8 is aangetoond in figuur 1...

Discussion

Op het gebied van weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde, onder de postnatale bronnen, hebben MSC's afkomstig van oraal weefsel grote belangstelling gewekt vanwege hun minimale ethische verplichtingen en opmerkelijk differentiatiepotentieel voor meerdere afstammingslijnen²¹. Tandpulpstamcellen (DPSC's) van de getroffen derde kies en SHED's hebben de meeste aandacht gekregen onder tandheelkundige MSC's vanwege hun therapeutisch potentieel bij neurodegeneratieve en traumatische

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Wordt gebruikt om de laservertraging in te stellen wanneer het sorteermodule wordt geopend.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Wordt gebruikt als omhulselvloeistof voor zowel analyse- als sorteerexperimenten in de BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Wordt gebruikt voor instrumentconfiguratie, afhankelijk van de mondstukgrootte.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stockoplossing van 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS gebruikt voor kweekwerk en onderhoud.
Ethanol	---	---	Wordt gebruikt voor algemene sterilisa.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium voor ongedifferentieerde hESC's, gebruikt bij de bereiding van kweekmedia
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	----	Het werd bereid met behulp van 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media voor adipogene media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Inductiemedia voor adipogene media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Inductiemedia voor chondrogene media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Inductiemedia voor osteogene media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media voor zowel osteogene als chondrogene media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5