Opbouw van huidmodellen voor tal van toepassingen - van tweedimensionale (2D) monocultuur tot driedimensionale (3D) multicultuur

Samenvatting

Hier presenteren we goedkope en eenvoudige procedures om verschillende 3D-huidmodellen te introduceren voor routineonderzoek in een celkweeklaboratorium. Onderzoekers kunnen modellen maken die zijn afgestemd op hun behoeften zonder afhankelijk te zijn van in de handel verkrijgbare modellen.

Samenvatting

Door de complexe structuur en belangrijke functies van de huid is het een interessant onderzoeksmodel voor de cosmetische, farmaceutische en medische industrie. In de Europese Unie is er een totaal verbod op het testen van cosmetische producten en hun ingrediënten op dieren. In het geval van medicijnen en farmaceutica is deze mogelijkheid ook voortdurend beperkt. In overeenstemming met het 3V-principe wordt het steeds gebruikelijker om zowel individuele verbindingen als hele formuleringen te testen op kunstmatig gecreëerde modellen. De goedkoopste en meest gebruikte zijn de 2D-modellen, die bestaan uit een celmonolaag maar niet de echte interacties tussen de cellen in het weefsel weerspiegelen. Hoewel de in de handel verkrijgbare 3D-modellen een betere weergave van het weefsel geven, worden ze niet op grote schaal gebruikt. Dit komt omdat ze duur zijn, de wachttijd vrij lang is en de beschikbare modellen vaak beperkt zijn tot alleen de modellen die doorgaans worden gebruikt.

Om het uitgevoerde onderzoek naar een hoger niveau te tillen, hebben we de procedures van verschillende 3D huidmodel preparaten geoptimaliseerd. De beschreven procedures zijn goedkoop en eenvoudig te bereiden, omdat ze in tal van laboratoria en door onderzoekers met verschillende ervaringen in celcultuur kunnen worden toegepast.

Inleiding

De huid is een continue structuur met meercellige interacties die de goede werking en homeostase van dit complexe orgaan onthullen. Het is opgebouwd uit morfologisch verschillende lagen: de binnenste laag - dermis en de buitenste laag - de epidermis. Bovenop de epidermis onderscheiden we bovendien het stratum corneum (bestaande uit afgeplatte dode cellen - corneocyten), dat de grootste bescherming biedt tegen de externe omgeving. Enkele van de belangrijkste passieve en actieve functies van de huid zijn lichaamsbescherming tegen externe factoren, deelname aan de immunologische processen, secretie, resorptie, thermoregulatie en detectie ^1,2,3. Omdat het wordt beschouwd als een van de grootste organen in het lichaam, is het onmogelijk om contact met verschillende ziekteverwekkers, allergenen, chemicaliën en ultraviolette (UV) straling te vermijden. Het is dus gestructureerd met vele soorten cellen met specifieke functies. De belangrijkste soorten cellen die in de epidermis aanwezig zijn, zijn keratinocyten (bijna 90% van alle cellen, met structurele en immunologische functies in de diepere delen van de epidermis, maar die later het keratinisatieproces ondergaan om te veranderen in corneocyten in de bovenste laag van de epidermis), melanocyten (slechts 3%-7% van de epidermale celpopulatie, die het UV-beschermende pigment melanine produceren) en de Langerhanscellen (van het immuunsysteem). In het geval van de dermis zijn de belangrijkste cellen fibroblasten (die groeifactoren en eiwitten produceren), dendritische cellen en mestcellen (beide celtypen van het immuunsysteem)^4,5,6. Bovendien is de huid uitgerust met verschillende extracellulaire eiwitten (zoals collageen type I en IV, fibronectine en laminine; Figuur 1) en eiwitvezels (collageen en elastine), die zorgen voor de specifieke structuur van de huid, maar ook de celbinding, celadhesie en andere interacties bevorderen⁷.

Figuur 1: Schema van de huidstructuur. De huidstructuur markeerde vier basisceltypen die in de afzonderlijke lagen voorkomen en onderscheidde eiwitten van de extracellulaire matrix. Deze figuur is gemaakt met MS PowerPoint. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De veiligheid van cosmetica en farmaceutische producten is een zeer belangrijke kwestie, en de bescherming van de gezondheid van consumenten en patiënten is een prioriteit⁸. Tot voor kort werd verondersteld dat het zou worden gegarandeerd door tal van tests, waaronder studies op dieren. Helaas vereisten deze vaak het gebruik van drastische methoden, die pijn en lijden veroorzaakten bij dieren die voor onderzoeksdoeleinden werden gebruikt (vaak muizen, ratten en varkens). In 1959 werden de principes van de humane experimentele techniek (het 3V-principe) geïntroduceerd: (1 - Vervanging) het vervangen van dieren in onderzoek door in vitro-, in sillico- of ex vivo-modellen , (2 - Vermindering) het verminderen van het aantal dieren dat voor onderzoek wordt gebruikt, en (3 - Verfijning) het verbeteren van het welzijn van de dieren die nog steeds nodig zijn voor onderzoek en tegelijkertijd het verbeteren van de ontwikkelde alternatieve methoden⁹. Bovendien zijn in de Europese Unie (EU) cosmetische dierproeven wettelijk geregeld. Vanaf 11 september 2004 is het verbod op dierproefgeteste cosmetische producten van kracht geworden. Op 11 maart 2009 verbood de EU dierproeven op cosmetische ingrediënten. De verkoop van cosmetische producten gemaakt van nieuw op dieren geteste ingrediënten was niet toegestaan; Het testen van de producten op dieren op complexe gezondheidsproblemen bij de mens, zoals toxiciteit bij herhaalde toediening, reproductietoxiciteit en toxicokinetiek, was echter nog steeds acceptabel. Vanaf 11 maart 2013 is het in de EU illegaal om cosmetica te verkopen waarvan het eindproduct of de ingrediënten ervan op dieren zijn getest¹⁰. Daarom wordt momenteel in de cosmetologie onderzoek op drie niveaus uitgevoerd: in vitro (cellen), ex vivo (echte weefsels) en in vivo (vrijwilligers)¹¹. In het geval van geneesmiddelen blijft de noodzaak van dierproeven bestaan; Het wordt echter aanzienlijk verminderd en strikt gecontroleerd¹².

Als alternatieve methoden voor dierproeven en voor de eerste beoordeling van de effectiviteit van een nieuw actief ingrediënt worden de in vitro huidcelculturen gebruikt. Isolatie van verschillende soorten huidcellen en hun kweek in steriele laboratoriumomstandigheden maakt het mogelijk om de veiligheid en toxiciteit van actieve stoffen te beoordelen. Huidcellijnen zijn ook algemeen erkende modellen voor onderzoek, aangezien de cellen worden verkocht door gecertificeerde bedrijven en de resultaten in verschillende laboratoria vergelijkbaar kunnen zijn. Deze tests worden meestal uitgevoerd op eenvoudige 2D-modellen van de monoculturen van menselijke huidcellen. Enkele van de meer geavanceerde modellen zijn hun co-culturen (zoals keratinocyten met fibroblasten en keratinocyten met melanocyten), evenals de driedimensionale modellen, waaronder steigervrije culturen (bolletjes) en op steigers gebaseerde huidequivalenten van de epidermis, dermis of zelfs de vervangingsmiddelen van de huid over de volledige dikte¹³. Het is vermeldenswaard dat, afgezien van het laatste type (huidequivalenten), de rest niet in de handel verkrijgbaar is, en indien nodig moet een wetenschapper ze zelf bereiden.

Hoewel veel van deze modellen zijn onderhouden en tegenwoordig routinematig worden verkocht (tabel 1), zijn er voortdurend extra modellen nodig om de meeste resultaten te valideren. De nieuw ontworpen modellen zouden dus beter de echte interacties moeten nabootsen die plaatsvinden in het menselijk lichaam. Wanneer een mengsel van cellen van verschillende typen wordt gebruikt om dergelijke modellen te vormen, kan de reproductie van het meercellige aspect van weefsel in vivo worden bereikt. Als gevolg hiervan wordt een organotypische cultuur ontwikkeld (Figuur 2).

	Naam		Beschrijving
Normale huid	EpiSkin		Gereconstrueerde Menselijke Epidermis - Keratinocyten op een collageenmembraan
	SkinEthic RHE		Gereconstrueerde menselijke epidermis - keratinocyten op een membraan van polycarbonaat
	SkinEthic RHE-LC		Menselijk epidermaal model Langerhans-cellen - Keratinocyten en Langerhans-cellen op een polycarbonaatmembraan
	SkinEthic RHPE		Gereconstrueerde Menselijke Gepigmenteerde Epidermis - Keratinocyten en Melanocyten op een polycarbonaatmembraan
	T-huid		Gereconstrueerd menselijk huidmodel met volledige dikte - keratinocyten op een laag fibroblasten, die op een polycarbonaatmembraan werden gekweekt
	Phenion FT Skin model		Keratinocyten en fibroblasten in hydrogel
Huid met een ziekte	Melanoom FT Huidmodel		Normale, van de mens afkomstige keratinocyten en fibroblasten met menselijke kwaadaardige melanoomcellijn A375
	Psoriasis Weefsel Model		Normale menselijke keratinocyten en fibroblasten

Tabel 1: De meest populaire commerciële huidequivalenten voor verschillende onderzoeken.

Figuur 2: Complexiteit van verschillende in vitro modellen. De relatie tussen de complexiteit van verschillende in vitro modellen om een organisme na te bootsen en de echte interacties die direct in het menselijk lichaam plaatsvinden. De figuur is een bewerking van de set "Microbiologie en celcultuur" van Servier Medical Art van Servier (https://smart.servier.com/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een van de belangrijkste beperkingen van de commerciële equivalenten is de beschikbaarheid van alleen zeer algemene onderzoeksmodellen met een paar soorten cellen (meestal 1-2, zelden 3). Toch zijn er veel meer cellen in de huid aanwezig, en hun interactie met elkaar kan zorgen voor een betere of slechtere tolerantie van verschillende ingrediënten¹⁴. Het ontbreken van sommige immuuncomponenten kan de waarde ervan verminderen in verschillende soorten onderzoek, waaronder immunotherapie. Dit is een ernstig probleem, aangezien melanoom een levensbedreigende huidkanker is vanwege het vroege begin van metastasen en frequente resistentie tegen de toegepaste behandeling¹⁵. Om het kunstmatige huidmodel te verbeteren, proberen onderzoekers een co-cultuur van immuuncellen met cellijnen en organoïden tot stand te brengen¹⁶ en dit wordt beschouwd als een grote verbetering van de bestudeerde modellen. Mestcellen nemen bijvoorbeeld deel aan veel fysiologische (wondgenezing, weefselremodellering) en pathologische (ontsteking, angiogenese en tumorprogressie) processen in de huid¹⁷. Hun voorkomen in het model kan dus de reactie van het model op de bestudeerde verbinding aanzienlijk veranderen. Ten slotte ontbreekt er nog veel huidgerelateerde informatie, die alleen kan worden ontdekt door fundamenteel onderzoek uit te voeren. Dit is de reden waarom het creëren en verfijnen van verschillende kunstmatige huidmodellen (tabel 2) zo'n belangrijke onderneming is. In dit artikel worden verschillende procedures beschreven om geavanceerde huidmodellen te maken, waaronder bollen en huidequivalenten.

In vitro huidmodel	Probeer interacties in het weefsel na te bootsen	Voorbeelden van de gebruikte cellen
2D of 3D celcultuur	Opperhuid	Keratinocyten
		Melanocyten
		Keratinocyten + Melanocyten
	Dermis	Fibroblasten
		Mestcellen
		Fibroblasten + Mestcellen
	Huid	Keratinocyten + fibroblasten
		Keratinocyten + Mestcellen
		Melanocyten + fibroblasten
		Melanocyten + Mestcellen
		Keratinocyten + fibroblasten + melanocyten
		Keratinocyten + Fibroblasten + Mestcellen

Tabel 2: Voorbeelden van een mengsel van celtypen om huidweefsel na te bootsen in 2D- en 3D-cultuur.

Protocol

De studie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Medische Universiteit van Warschau (KB/7/2022). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen die bij het onderzoek betrokken waren.

OPMERKING: De beschreven procedures van de geavanceerde voorbereiding van het huidmodel kunnen worden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare primaire huidcellen en cellijnen of met de primaire cellen geïsoleerd van patiënten. Commerciële cellen worden voorzien van de relevante documenten en voor het gebruik ervan in onderzoek voor de meeste landen is geen aanvullende goedkeuring vereist. Voor sommige landen is het echter verplicht, dus het moet worden gecontroleerd aan de hand van de voorschriften van de Lokale Ethische Commissie. Als de primaire cellen die uit patiënten zijn geïsoleerd in het onderzoek moeten worden gebruikt, moet het onderzoek eerst worden goedgekeurd door de Lokale Ethische Commissie en moet het worden uitgevoerd volgens hun strikte richtlijnen. Bovendien moet schriftelijke geïnformeerde toestemming worden verzameld van alle huidweefseldonoren. De isolatie van primaire huidcellen was niet het onderwerp van dit artikel, maar voorbeeldige isolatieprocedures zijn te vinden bij Kosten et al. (keratinocyten)¹⁸, Ścieżyńska et al. (melanocyten)¹⁹, Kröger et al. (fibroblasten en mestcellen)²⁰. De meeste normale huidcellen en cellijnen hebben een veiligheidsniveau van BSL1-klasse; Ze vormen geen bedreigingen. De gebruikte laboratoriumapparatuur moet echter wel voldoen aan de normen voor dierlijke en menselijke celkweek onder gecontroleerde omstandigheden.

1. Cultuur van huidcellen

OPMERKING: Huidcelculturen moeten worden uitgevoerd in kolven die zijn bestemd voor aanhangende of suspensiecellen (afhankelijk van het celtype) bij 37 °C en een kooldioxidegehalte van 5% in een incubator. Activiteiten die verband houden met hun teelt en gebruik voor onderzoek vereisen steriele omstandigheden en moeten worden uitgevoerd in een laminaire kamer na blootstelling aan ultraviolette C (UVC) stralen gedurende 15-30 minuten. Het verkrijgen van celsuspensies, die vervolgens worden gebruikt om de twee- en driedimensionale modellen te maken, vereist de implementatie van procedures afhankelijk van het celtype (voor aanhangende cellen zoals keratinocyten, fibroblasten en melanocyten - stap 1.1, voor niet-hechtende cellen van mestcellen - stap 1.2) (Figuur 3). Voor verschillende grootte van de kweekkolven zijn de volumes van alle reagentia (zoals medium, fosfaatgebufferde zoutoplossing of trypsineoplossing) die in de beschreven methoden worden gebruikt, vermeld in tabel 3. Parameters die afhankelijk zijn van het type cellen (bv. concentratie en samenstelling van reagentia, centrifugatiemethode, enz.) zijn gesorteerd in tabel 4. De celdichtheden die voor het zaaien worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 5. Al deze tabellen zijn opgenomen aan het einde van dit hoofdstuk.

Figuur 3: Aanhangende en niet-hechtende celkweek. De algemene stap-voor-stap procedure van aanhangende en niet-hechtende celkweek (nummers komen overeen met de beschrijvingen van stap 1.1 en 1.2). De figuur is gemaakt met MS PowerPoint. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Het verkrijgen van een suspensie van aanhangende cellen
   1. Verwijder het medium uit de kweekkolf.
   2. Was de cellen voorzichtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, tabel 3).
   3. Voeg trypsine-oplossing toe in ethyleendiaminetetra-azijnzuur (trypsine-EDTA-oplossing, tabel 3). Incubeer de kolf bij 37 °C en controleer het loskomen van de cellen van het oppervlak op de optische microscoop.
   4. Suspendeer de losgemaakte cellen in ten minste een dubbele hoeveelheid volgroeimedium of trypsineneutralisator om trypsine te deactiveren (2:1) (zie tabel 3 voor volumes en voor reagentia zie tabel 4). Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in de buis van 15 ml.
   5. Neem een klein volume (20 μL) celsuspensie in een buisje van 1,5 ml en tel de cellen met een handmatige of automatische hemocytometer.
   6. Centrifugeer de buis (parameters in tabel 4), verwijder het grootste deel van het supernatant en resuspendeer de celpellet in de kleine hoeveelheid van de resterende vloeistof. Voeg vervolgens voldoende vers medium toe om het voorcentrifugatievolume (volume in tabel 3) te verkrijgen als de celdichtheid geschikt is om te zaaien of bereken het vereiste volume van het nieuwe medium opnieuw.
      OPMERKING: Sommige cellen, zoals melanocyten, zijn erg gevoelig voor centrifugatie, waardoor het niet nodig is om ze op korte termijn opnieuw te centrifugeren.
   7. Bereid de celsuspensie van de vereiste dichtheid (cellen/ml, celdichtheid in tabel 5) voor het experiment voor (2D/3D mono- of multiculturen van huidcellen).
      OPMERKING: Als cellen verder moeten worden gekweekt, doe dan 5.000-8.000 cellen/ml terug in een nieuwe kolf en voeg vers medium toe (volume in tabel 3).
2. Het verkrijgen van een suspensie van niet-hechtende cellen
   1. Verwijder het medium met de celsuspensie uit de kweekkolf en breng het kwantitatief over in de buis van 15 ml.
   2. Doe een klein volume (20 μL) van de celsuspensie in een nieuw buisje van 1,5 ml. Tel de cellen met een handmatige of automatische hemocytometer.
   3. Centrifugeer de buis (parameters in tabel 4), verwijder het grootste deel van het supernatant en resuspendeer de cellen in een kleine hoeveelheid van de resterende vloeistof. Voeg vervolgens vers medium toe om het voorcentrifugatievolume te verkrijgen (zoals aangegeven in tabel 3) als de celdichtheid geschikt is om te zaaien of bereken het vereiste volume van het nieuwe medium opnieuw.
   4. Bereid de celsuspensie voor met de vereiste dichtheid (cellen per ml, zoals voorgesteld in tabel 5) voor het experiment (2D/3D mono- of multiculturen van huidcellen).
      OPMERKING: Als cellen verder moeten worden gekweekt, doe dan 5.000-8.000 cellen/ml terug in een nieuwe kolf en voeg nieuw medium toe.

    

	25 cm2 kweekkolven	75 cm2 kweekkolven
Kweekmedium [ml]	4–5	8–12
PBS [ml]	5	10
Trypsine-EDTA [ml]	0.5–1	1–2
Neutralisatiemiddel [ml]	1–2	2–4

Tabel 3: Hoeveelheden reagentia die worden gebruikt bij de teelt en bereiding van celsuspensies.

Monocultuur van huidcellen	Trypsine	Trypsine deactivator	Centrifugeren	Medium type voor 2D monocultuur
Keratinocyten	0.25%	met trypsineneutralisator	300 x g, 5 min, RT	Keratinocyten Groei Medium 2
Fibroblasten	0.25%	met medium	300 x g, 5 min, RT	DMEM, 10% FBS
Melanocyten	0.025%	met trypsineneutralisator	300 x g, 3 min, RT	Medium 254, PMA-vrij menselijk melanocytgroeisupplement-2
Mestcellen	Niet verplicht	Niet verplicht	300 x g, 3 min, RT	IMDM, 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuren, 226 μM α-monothioglycerol

Tabel 4: Trypsinisatie, centrifugatieparameters en type media zijn afhankelijk van het celtype.

Soort Model		Celdichtheid [cel/ml]
2D	Monolaag	Fibroblasten	2 x 105
		Mestcellen
		Keratinocyten
		Melanocyten
3D	Bol (hangende druppel methode)	Fibroblasten	5 x 105
		Mestcellen
		Keratinocyten
		Melanocyten
		Mix van cellen
	Bol (methode voor het beperken van de celadhesie)	Fibroblasten	2 x 105
		Mestcellen
		Keratinocyten
		Melanocyten
		Mix van cellen
	Equivalent	Fibroblasten	1 x 105
		Mestcellen	1 x 104
		Keratinocyten	8 x 105
		Melanocyten	5 x 104

Tabel 5: Dichtheid van celzaaien voor verschillende soorten huidmodellen.

2. Bereiding van huidcelbolletjes

OPMERKING: Om bollen te maken, wordt het gebruik van de hangende druppelmethode beschreven in stap 2.1 (Figuur 4), terwijl de benadering gericht op het beperken van celadhesie wordt weergegeven in stap 2.2 (Figuur 5). Desalniettemin, omdat bollen erg klein zijn en onstabiel kunnen zijn, vereisen activiteiten die volgens deze methoden worden uitgevoerd geduld, delicatesse en langzame acties.

1. De hanging-drop methode
   1. Gebruik een geschikte celdichtheid om de gewenste bolgrootte te bereiken (aanbevolen celdichtheid 5 x 10⁵ cellen/ml, tabel 5).
   2. Pipetteer 20 μl van de celsuspensie op het deksel van een petrischaaltje of een plaat voor meerdere putjes (figuur 4A).
   3. Bedek de schaal/het bord met het onderste deel en draai het voorzichtig om (er worden automatisch hangende druppels op de deksels gemaakt, Figuur 4B).
   4. Vul de petrischaal/putjes van de plaat met een steriel water/PBS-oplossing om verdamping van het medium uit druppeltjes te voorkomen.
   5. Incubeer de druppels gedurende 48-72 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: De zwaartekracht trekt de cellen naar beneden en het ontbreken van een toegankelijk oppervlak voorkomt celhechting aan het vat en bevordert celaggregatie. Sommige celtypen kunnen echter een langere incubatie nodig hebben.
   6. Voordat u de volgende stap uitvoert, vult u de putjes van de nieuwe plaat (of gebruik de oude plaat met verwijderd water/PBS uit de putjes) met het volledige groeimedium (100 μL).
      NOTITIE: Neem voor de volgende stap 200 μL tips, verwijder 1/5 van elk tipuiteinde en steriliseer voor gebruik.
   7. Breng de celbolletjes over naar de putjes van de multi-well-plaat met behulp van steriele pipetpunten met een afgesneden uiteinde. Neem tips van 200 μl, verwijder 1/5 van elk uiteinde van de tip en steriliseer voor gebruik (Figuur 4C).
      NOTITIE: Deze stap kan moeilijk zijn, omdat de vloeistofstroom tijdens het omdraaien van de schaal/het bord de bollen kan beschadigen.
   8. Incubeer de overgebrachte bolletjes gedurende 1 dag in de plaat met meerdere putjes bij 37 °C voordat u verdere experimenten uitvoert (bijvoorbeeld toevoeging van verbindingen, cytotoxiciteitstests, introductie van bollen tot equivalenten) (figuur 4D).
2. De methode om celadhesie te beperken
   1. Bedek vóór het zaaien van de cellen de putjes van de U-bodemplaat met een oplossing van oppervlakteactieve stoffen (bijv. Pluronic F-127, polyethyleenglycol, polyvinylalcohol)²¹. Bereid en voeg 100 μL 1% oppervlakteactieve stofoplossing in PBS toe aan elk putje. Incubeer de plaat met de oplossing gedurende 24 uur bij 37 °C (figuur 5A-C). Bewaar de plaat indien nodig langer, maar houd het vloeistofniveau op peil door meer PBS-buffer toe te voegen.
   2. Bereid de celsuspensie in de gewenste celdichtheid in 50 μL per putje (aanbevolen celdichtheid tijdens het zaaien 2 x 10⁵/ml, tabel 5).
   3. Verwijder de oppervlakteactieve oplossing uit de putjes voordat u de cellen zaait om verstoring van het celmembraan door lysis te voorkomen (Figuur 5D).
   4. Voeg de celoplossing toe aan de plaat en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C om de celaggregaten te bereiken (figuur 5E). Na ongeveer 1-3 dagen worden bollen gevormd (Figuur 5F) en zijn ze klaar voor gebruik voor verdere experimenten.

Figuur 4: De hangende druppelmethode. (A) pipetteercelsuspensie op het deksel en het deksel bedekken met het onderste deel van de schaal; (B) het draaien van de schaal om de hangende druppels te maken; (C) toevoeging van water/PBS aan het onderste deel van de schaal (beperking van de verdamping van vloeistof); (D) incubatie van de schalen met hangende druppels om celbolletjes te creëren; (E) het verzamelen van druppels met gevormde bolletjes en stabilisatie van de overgebrachte bollen in platen met meerdere putjes. De figuur is gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Stap-voor-stap voorbereiding van bollen door middel van de beperkende celadhesiemethode. (A) U-bodem put; (B,C) beperking van de celaanhechting door oplossing van oppervlakteactieve stoffen; (D) het verwijderen van de oplossing uit putten; E) zaadcellen; (F) samenvoeging van cellen en vorming van een bol. De figuur is gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Bereiding van huidequivalenten over de volledige dikte

OPMERKING: De ontwikkeling van de huidequivalenten over de volledige dikte (epidermis en dermis) kan worden onderverdeeld in drie stappen (Figuur 6): de voorbereiding van de kunstmatige dermislaag met het voorkomen van typische huidcellen (zoals fibroblasten en mestcellen, Figuur 6A), het zaaien van cellen die zijn opgenomen in de kunstmatige epidermis (meestal keratinocyten en melanocyten, Figuur 6B) en verticale groei van keratinocyten met een mogelijk keratinisatieproces (vorming van de hoornlaag, figuur 6C). De bereiding van huidequivalenten over de volledige dikte wordt beschreven in stap 3.1 (3.1.1-3.1.10). Als een minder geavanceerd huidequivalent nodig is (bijv. alleen het epidermistype), kan het geselecteerde celtype (zoals keratinocyten) rechtstreeks op de in de handel verkrijgbare collageen- of polycarbonaatmembranen worden gezaaid en ook worden gekweekt met de mogelijkheid om het keratinisatieproces te induceren (ga direct naar stap 3.1.9-3.1.10).

Figuur 6: Stap-voor-stap bereiding van huidequivalenten over de volledige dikte in inserts. (A) voorbereiding van de pseudo-dermislaag met huidcellen, (B) uitzaaiing van epidermale cellen, (C) verdere kweek van equivalent in medium, (D) lucht-vloeistof interfacecultuur bevordert de vorming van gelaagd epitheel. De figuur is gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Bereiding van huidequivalenten over de volledige dikte in een plaat met 24 putjes
   1. Plaats de buisjes met water, PBS (10x), 1 M NaOH en type I collageenoplossing op ijs.
   2. Bepaal het juiste aantal huidcellen (bijv. fibroblasten en mestcellen; in een verhouding van 10:1) dat in de hydrogel moet worden gezaaid. Breng een juist aantal huidcellen over in een buisje van 1,5 ml (500 μl fibroblasten en 500 μl mestcellen, volgens de celdichtheid in tabel 5) en centrifugeer de cellen (300 x g, 3 min, RT).
   3. Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen voorzichtig in het mengsel van 695 μL water/100 μL PBS (10x)/ 5 μL NaOH.
      OPMERKING: Als 1 ml van de totale oplossing niet voldoende is, gebruik dan tabel 6 om de volumes van elk reagens opnieuw te berekenen.
   4. Voeg 200 μL collageenoplossing toe aan het mengsel en meng het voorzichtig door te pipetteren.
      OPMERKING: Wees voorzichtig, want de consistentie van het mengsel zal dicht zijn.
   5. Voeg 200 μL van het bereide mengsel toe aan het inzetstuk in een plaat met 24 putjes. Voor een model zonder de hoornlaag voegt u 500 μL toe aan elk putje van de plaat met 24 putjes.
   6. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) en breng hem vervolgens 30 minuten over naar de incubator.
      NOTITIE: Controleer of de hydrogel is gepolymeriseerd voordat u enige andere actie onderneemt.
   7. Voordat de cel op het oppervlak van de hydrogel wordt gezaaid, spoelt u deze af met een PBS-buffer (500 μL/putje).
   8. Bepaal het juiste aantal epidermale cellen (bijv. keratinocyten en melanocyten; in een verhouding van 15:1) dat bovenop de hydrogel moet worden gezaaid. Bereid het celmengsel in 500 μl van het DMEM-medium aangevuld met 10% FBS (voeg 250 μl keratinocyten en 250 μl melanocyten toe, celdichtheden worden vermeld in tabel 4) en voeg het voorzichtig toe aan de putjes.
      OPMERKING: In sommige gevallen is het beter om eerst melanocyten te zaaien en ze goed op de hydrogel te laten verspreiden, en na nog eens 24 uur het medium en de zaadkeratinocyten te verwijderen. Voeg in dat geval 250 μL celsuspensie en 250 μL van het medium toe.
   9. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 2-5 dagen, afhankelijk van de snelheid van de celgroei, met gemiddelde uitwisseling (met een afnemende concentratie van FBS van 10% tot 1%) om de 48 uur en celbewaking uitgevoerd op de optische microscoop.
   10. Als het keratinisatieproces moet worden geïnduceerd na het verkrijgen van een monolaag keratinocyten bovenop de hydrogel, gebruik dan het FBS-vrije medium aangevuld met calciumionen en L-ascorbinezuur gedurende nog eens 2-7 weken (in de concentratie van 1,5 μM CaCl₂ en 50 μg/ml L-ascorbinezuur).
       OPMERKING: De tijd van de incubatie is afhankelijk van de gebruikte keratinocyten en hun differentiatiesnelheid.

Reagens	De vergelijking voor het berekenen van het volume van een reagens		Voorbeeld berekeningen
			(voor een eindvolume = Vtotaal van 1 ml)
type I collageen oplossing			(Ccollageen = 10 mg/ml)
			0,2 ml = 200 μl
PBS (10x)			0,1 ml = 100 μL
1 M NaOH			0.005 ml = 5 μL
steriel H2O			0.695 ml = 695 μL

Tabel 6: Berekening van de reagensvolumes die nodig zijn voor het 2 mg/ml collageen type I hydrogelpreparaat.

4. Identificatie van celtypen in een 3D-huidmodel door middel van celkleuringsmethoden

OPMERKING: Om te bevestigen dat het ontwikkelde huidmodel uit de verwachte cellen bestaat, is het goed om celkleuring uit te voeren. Het is een cruciale stap voordat er doelexperimenten kunnen worden uitgevoerd op een bepaald model²². In het geval van 3D-huidmodellen is het noodzakelijk om een bepaald model in paraffine in te bedden en microscopische objectglaasjes te maken met het kunstmatige weefsel dat op een microtoom is gesneden (stap 4.1) voordat de cellen worden gekleurd (figuur 7).

Figuur 7: Basisstappen van een 3D-huidmodelinbedding, celkleuring en microscopische observaties. De figuur is gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Inbedding van 3D-skinmodellen
   1. Was de huidequivalent met PBS gedurende 5 minuten bij RT tweemaal en fixeer het met een 3,7% paraformaldehyde-oplossing in PBS (30 min, RT). Herhaal de wasstap met PBS.
   2. Vóór het inbedden, dehydrateer het huidequivalent door te incuberen in toenemende concentraties ethanoloplossingen: 50% (15 min), 70% (15 min), 96% (2x, 30 min) en 99,8% (2x, 30 min).
   3. Doe het gefixeerde en vochtarme huidequivalent in de vorm gevuld met paraffine.
      NOTITIE: Plaats het equivalent in een geschikte richting.
   4. Bedek de vorm met de cassette en voeg meer paraffine toe. Laat het tot 30 minuten stollen bij RT.
   5. Vries het in paraffine ingebedde huidequivalent gedurende ten minste 1 uur in bij -80 °C.
   6. Zet de microtoom aan, plaats het in paraffine ingebedde huidequivalent en snijd plakjes van 5 μm. Leg de gesneden plakjes kunstweefsel op de microscopisch kleine objectglaasjes en droog ze minimaal 8 uur bij 37 °C.
   7. Dompel de objectglaasjes onder in xyleen (2x, 10 min) en hydrateer de objectglaasjes vervolgens met de afnemende ethanolconcentraties 99,8% (5 min), 96% (5 min), 70% (5 min) en 50% (5 min).
   8. Haal de objectglaasjes uit de ethanoloplossing en spoel ze twee keer af met water (5 min).
      OPMERKING: Traditionele celkleuring wordt uitgevoerd door specifieke kleurstoffen aan te brengen (Hematoxyline, Eosine²³) of door antilichamen te gebruiken die selectief gericht zijn op biomarkers (waaronder collageen 1A2 voor fibroblasten, cytokeratine 14 voor keratinocyten, melan-A of tyrosinase voor melanocyten²⁴). Een routinematige hematoxyline- en eosinekleuring kan worden gemaakt door de protocollen te volgen die door verschillende bedrijven zijn opgesteld (stap 4.2). Aan de andere kant, als immunofluorescerende of immunohistochemische kleuring vereist is, is de procedure anders en aanzienlijk langer (stappen 4.3 en 4.4). Om niet-specifieke reacties te voorkomen, gebruikt u de primaire antilichamen die in verschillende soorten worden geproduceerd en vervolgens de specifieke secundaire antilichamen.
2. Hematoxyline- en eosinekleuring van 3D-huidmodellen
   1. Kleuring het microscopisch kleine objectglaasje in hematoxyline-oplossing gedurende 3 minuten bij RT.
   2. Was de glaasjes gedurende 1 minuut in een oplossing van aangezuurde alcohol.
      OPMERKING: Bereid de aangezuurde alcoholoplossing door 2 ml 35%-38% zoutzuur te mengen met 98 ml 99,8% ethylalcohol.
   3. Was vervolgens het objectglaasje in een oplossing van 0,1% natriumbicarbonaat om een zichtbare, delicate blauwviolette kleur te verkrijgen.
      OPMERKING: Om 0,1% natriumbicarbonaatoplossing te verkrijgen, lost u 100 mg natriumbicarbonaat op in 100 ml ultrapuur water.
   4. Was de glaasjes met 95% ethanol gedurende 1 minuut.
   5. Kleuring het microscopisch kleine objectglaasje in eosine-oplossing gedurende 1 minuut bij RT.
   6. Was de glaasjes met 95% ethanol gedurende 1 minuut en 99,8% ethanol gedurende 2 minuten.
   7. Was de glaasjes twee keer met xyleen gedurende 2 minuten.
   8. Monteer in balsem en plaats een dekglaasje aan de bovenkant van de dia. De monsters zijn klaar voor microscopische observaties.
3. Immunofluorescerende kleuring van 3D-huidmodellen
   1. Spoel het glaasje af met PBS (5 min).
   2. Bereid de blokkerende oplossing (3% runderserumalbumine [BSA] of magere melk in een PBS-buffer met toevoeging van 0,1% Triton X-100 en 0,1% Tween 20) en incubeer het objectglaasje erin gedurende 1 uur bij RT.
   3. Was de glaasjes twee keer met een PBS-buffer (5 min).
   4. Verdun het primaire antilichaam in de PBS-buffer (volgens de aanbevelingen van de producent, tabel 7) en incubeer de objectglaasjes gedurende 1-2 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C.
   5. Was de glaasjes twee keer met een PBS-buffer (5 min).
   6. Verdun het secundaire antilichaam in de PBS-buffer (volgens de aanbevelingen van de producent, tabel 7) en incubeer de objectglaasjes gedurende 1 uur bij RT.
   7. Was de objectglaasjes twee keer met PBS (5 min).
   8. Bereid de kleurstofoplossing voor de kleuring van de kernen voor (bijv. Hoechst 33342 of DAPI, tabel 7) en incubeer de objectglaasjes gedurende maximaal 15 minuten bij RT.
   9. Was de glaasjes met PBS (5 min).
   10. Monteer in balsem, bedek het gedeelte met een dekglaasje en visualiseer de effecten van de celkleuring met een fluorescerende microscoop.
4. Immunohistochemische kleuring van 3D huidmodellen
   1. Voer de stappen 4.3.1-4.3.5 uit.
   2. Voer bovendien een wasstap uit met een buffer die geschikt is voor het enzym waarmee het secundaire antilichaam is geconjugeerd.
   3. Verdun het secundaire antilichaam in een buffer die geschikt is voor het geconjugeerde enzym (volgens de aanbevelingen van de producent) en incubeer de objectglaasjes gedurende 1 uur bij RT.
   4. Was de objectglaasjes twee keer met PBS (5 min).
   5. Bereid de oplossing van een geschikt substraat voor het gebruikte enzym voor en incubeer de objectglaasjes volgens de aanbevelingen van de producent.
   6. Was de glaasjes met een buffer (5 min) en monteer ze in balsem.
   7. Visualiseer de effecten van de celkleuring met behulp van helderveldmicroscopie.

Gedetecteerd celtype/celorganoïde	Kleurstof			Verdunning / Concentratie
Mestcellen	Avidine-Sulforhodamine 101			1 μg/ml
Fibroblasten	Col1A2-antilichaam geproduceerd bij konijn			1:50
	Geiten anti-konijn secundair antilichaam geconjugeerd met FITC			1:250
Keratinocyten	Cytokeratine 14-antilichaam geproduceerd bij muizen			1:50
	Geit anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met FITC			1:250
Melanocyten	Melan-A-antilichaam geproduceerd in muizen			1:50
	Geit anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met FITC			1:250
Kernen	Hoechst 33342			1 μg/ml
	DAPI			1 μg/ml

Tabel 7: Concentraties en verdunningen van de reagentia die worden gebruikt voor celkleuring.

Resultaten

Voordat u begint met het maken van huidmodellen in het laboratorium, moet een beslissing worden genomen over het type cellen dat moet worden gebruikt (primaire/cellijn) en de selectie van een geschikt medium voor deze cellen. De meeste celbanken bevelen media aan en kunnen deze leveren voor alle soorten celcultuur. In het geval van een multicultuurmodel is het noodzakelijk om één medium te kiezen dat geschikt is voor alle celtypen die in de cultuur aanwezig zijn. Enkele typische celmedia die worden gebruikt voor zowel de primaire huidcelcultuur als de meest voorkomende huidcellijnen werden verzameld in Tabel 8 18,19,20,25,26,27. Typische media die worden gebruikt voor de primaire celculturen zijn vrij duur en hun samenstelling is complex. Aan de andere kant zijn cellijnen meestal tevreden met media met een eenvoudige samenstelling. Sommige celtypen (voornamelijk fibroblasten en mestcellen) kunnen factoren produceren en afscheiden die de groei van andere cellen stimuleren (zoals keratinocyten en melanocyten)^28,29. Als hun aanwezigheid in een model is gepland, is extra suppletie van het medium niet nodig.

Celtype	Naam van de cel		Gemiddeld				Referentie
Keratinocyten	HaCaT cellijn		DMEM, 10% FBS, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine				Volgens de verkoper
	primaire normale menselijke epidermale keratinocyten (NHEK)		Keratinocyten Groeimedium 2 (basaal medium + supplementenmix)				Volgens de verkoper
	primaire menselijke epidermale keratinocyten; Normaal, Volwassenheid (HEKa)		Dermale cel basaal medium, 0,4% runderhypofyse-extract, 0,5 ng/ml rh-transformerende groeifactor-alfa, 6 mM L-glutamine, 100 ng/ml hydrocortison hemisuccinaat, 5 mg/ml rh-insuline, 1 mM epinefrine, 5 mg/ml Apo-transferrine, 100 E/ml penicilline (indien nodig), 100 μg/ml streptomycine (indien nodig)				Volgens de verkoper
	Primaire keratinocyten		DMEM/F-12 (3:1), 1% Ultroser G, 1 μM hydrocortison, 1 μM isoproterenol, 0,1 μM insuline, 1 ng/ml keratinocytgroeifactor, 1% penicilline-streptomycine				18
Melanocyten	Primaire melanocyten		Medium 254, PMA-vrij menselijk melanocytgroeisupplement-2, 1% antibiotische oplossing				19
	Primaire melanocyten		RPMI-1640, 10% FBS, 14,7 μg/ml fenolrode oplossing, 1% L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine				27
	HEMa-LP cellijn		Medium 254, 5 μg/ml rh-insuline, 50 μg/ml ascorbinezuur, 6 mM L-glutamine, 1 μM epinefrine, 1,5 mM calciumchloride, 100 E/ml penicilline (indien nodig), 100 μg/ml streptomycine (indien nodig)				Volgens de verkoper
	primaire normale menselijke epidermale melanocyten (NHEM)		Melanocyt Growth Medium (basaal medium + supplementenmix)				Volgens de verkoper
Fibroblasten	primaire menselijke tenonfibroblasten (HTF's)		EMEM, 5% FBS, 5 ng/ml rh-basische fibroblastgroeifactor, 5 μg/ml rh-insuline, 50 μg/ml ascorbinezuur, 7 mM L-glutamine, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,25 μg/ml amfotericine B				28
	primaire HTF's, en		DMEM, 10% FBS, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,25 μg/ml amfotericine B				20.28
	primaire menselijke dermale fibroblasten
	HFF-1 cellijn		DMEM, 15% FBS, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine				Volgens de verkoper
	BJ-cellijn		EMEM, 10% FBS, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine				Volgens de verkoper
Mestcellen	primaire mestcellen van de menselijke huid (hsMC's)		IMDM, 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuren, 226 μM α-monothioglycerol, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine				20
	LAD2 cellijn		StemPro-34, 2,5% StemPro-34 voedingssupplement, 2 mM L-glutamine, 100 ng/ml rh-stamcelfactor, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine				29
	HMC-1.1 en 1.2 cellijnen		IMDM, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 25 mM HEPES, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine				29

Tabel 8: Een overzicht van de meest gebruikte media voor het kweken van primaire huidcellen en cellijnen.
Legende: Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), Foetaal runderserum (FBS), Nutrient Mixture Ham's F-12 (F12), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), recombinant menselijk (rh), Roswell Park Memorial Institute (RPMI).

In dit artikel zijn huidmodellen gemaakt met de primaire cellen van keratinocyten, melanocyten, fibroblasten en mestcellen. Ze zijn iets veeleisender dan de cellijnen, en de aanbevolen media voor hun kweek, die werden gebruikt voor eencellige cultuur, zijn: aangevuld Keratinocyten Groeimedium 2 (voor keratinocyten), aangevuld Medium 254 (voor melanocyten), aangevuld DMEM-medium (voor fibroblasten) en aangevuld IMDM-medium (voor mestcellen). Op deze media vertonen de cellen hun typische morfologie die aan hun type is toegewezen (representatieve afbeeldingen worden weergegeven in figuur 8). In het geval van multiculturen van twee of meer celtypen was het belangrijk om een medium te kiezen waarin alle gekweekte celtypen kunnen groeien. Na enkele tests werd een DMEM-medium met 10% FBS en een 1% antibioticamengsel geselecteerd voor het bereiden van de meer geavanceerde 3D-modellen van bollen en equivalenten.

Figuur 8: Huidcellen vertonen verschillende morfologie die is waargenomen tijdens de 2D-monocultuur. Schaal balken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bollen (gewoonlijk sferoïden genoemd) zijn een van de eenvoudigste 3D-modellen die zijn ontwikkeld door onderzoekers op het gebied van cel- en weefselmanipulatie, hoewel bollen gemaakt van huidcellen niet zo populair zijn. Binnen dit model is het mogelijk om zowel mono- als multicultuur van sferen te creëren. In de literatuur zijn meerdere methoden beschreven voor de bereiding van bollen (bijv. met een hangende druppel, beperking van de celadhesie, magnetische levitatie, rotatie, microfluïdica, enz.)³⁰. Vanwege het gemak van de voorbereiding, de lage kosten, gemakkelijk verkrijgbare materialen en apparatuur, worden de eerste twee methoden aanbevolen voor beginners in driedimensionale (3D) celmodellen en protocollen voor hun prestaties zijn hierboven te vinden (stap 2.1 en 2.2). Volgens literatuur^31,32 zijn de belangrijkste parameters in deze methoden het celaantal, het volume van de celsuspensie en de incubatietijd.

Bollen kunnen worden gemaakt met verschillende aantallen cellen, maar de celdichtheid voor zaaien moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype afzonderlijk, evenals voor celcoculturen. Uit het uitgevoerde optimalisatieproces voor monoculturen van keratinocyten en fibroblasten bleek dat het zaaien van 1 x 10⁴ cellen per put de beste resultaten opleverde voor beide celtypen. De bollen in figuur 9 zijn geprepareerd met behulp van de methode om de celadhesie in de U-bodemplaten te beperken (stap 2.2). Het wordt geadviseerd om ten minste 4 putjes voor te bereiden met technische herhalingen (optimaal is 6 putjes). Bollen bestaande uit 1 x 10⁴ cellen waren gemakkelijker te manipuleren omdat ze zichtbaar waren in de putjes. Als gevolg hiervan was het zelfs mogelijk om het oude medium tijdens analyses uit putten te verwijderen zonder de bollen af te tappen. Na de beschreven bewerkingen waren de vormen van de bollen grotendeels ongewijzigd en herhaalbaar. De stabiliteit van grotere bollen was tijdens het proces laag. Het is ook vermeldenswaard dat verschillende celtypen bolletjes van verschillende kleuren kunnen vormen ( keratinocyten vormen bijvoorbeeld donkerdere bolletjes, terwijl fibroblastbolletjes aanzienlijk lichter zijn).

Figuur 9: Schepping van bollen. Bollen gemaakt door verschillende soorten en aantallen huidcellen met behulp van de beperkende celadhesiemethode. Schaalbalken (bovenste paneel): 200 μm. Schaalbalken (onderste paneel): 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zoals vermeld in de hangende druppelmethode (stap 2.1), moeten bollen op een gegeven moment van het deksel naar de put worden overgebracht. Dit proces kan mogelijk schadelijk zijn voor de bollen. Voor deze stap is dus een hoge nauwkeurigheid van het werk essentieel. De gecreëerde bollen hebben de neiging om de juiste vorm te verliezen als ze niet zorgvuldig worden behandeld (Figuur 10). De eerste afbeelding (figuur 10A) toont een goede bol die aan alle kanten gelijk afgerond is. In de tweede en derde afbeelding (Figuur 10B,C) werd een licht vormverlies door de bol waargenomen, maar het celaggregaat blijft afgerond. De laatste drie afbeeldingen (Figuur 10D-F) tonen verschillende fasen van bolschade. Ervaring opdoen is nodig om herhaalbaarheid van de gecreëerde bolvormen en -structuren te verkrijgen. Bij de eerste pogingen om de bolletjes te ontwikkelen, wordt aanbevolen om de methode van het beperken van celadhesie voor onervaren onderzoekers te gebruiken (stap 2.2), omdat deze meer vergelijkbare resultaten oplevert met de beperkte invloed van de activiteit van de onderzoeker.

Figuur 10: Mogelijke moeilijkheden bij het overbrengen van de bol van het deksel naar de put - de hangende druppelmethode. (A) een goede bol, (B,C) licht beschadigde bollen, (D-F) sterk beschadigde bollen. De foto's werden 24 uur na de overdracht gemaakt. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Equivalenten zijn veel geavanceerdere 3D-modellen van kunstmatige huid dan bollen. Tijdens het bouwproces van een huidmodel moet met verschillende aspecten rekening worden gehouden, waaronder het aantal lagen in het model (alleen epidermis, alleen dermis, dermis met epidermis en stratum corneum), gebruikte celtypen, toegepaste materialen, voorkeursgrootte van het equivalent, type onderzoek waarin het verder zal worden gebruikt, ^enz.14. De huidequivalenten kunnen worden gerangschikt in speciale inzetstukken die in de standaard multi-well-platen van een gewenste grootte worden geplaatst (96-, 48-, 24-wells, enz.). Hoewel inzetstukken gemakkelijker van de ene put naar de andere kunnen worden overgebracht en tijdens de mediumwisseling, kan het equivalent niet worden beschadigd; Ze zijn vrij duur. Als het model de aanwezigheid van het stratum corneum niet vereist, is een goedkopere oplossing om het equivalent in een putje van de multi-well-plaat te bereiden.

De kunstmatige dermislaag wordt meestal geconstrueerd als een model op basis van een steiger door gebruik te maken van natuurlijke (gelatine, collageen, fibrine, hyaluronzuur, chitosan-alginaat, enz.) of synthetische (polyethyleenglycoldiacrylaat en polymelkzuur) hydrogels³³. Om vergelijkbaar te zijn met de echte huiddermis, moet deze laag voornamelijk water bevatten met enkele extracellulaire matrix (ECM) -componenten (waaronder collageen of fibronectine), die celbinding, cel-celinteracties en andere celacties bemiddelen^. In dit onderzoek werd type I collageen geselecteerd omdat het gemakkelijk te bereiden is in de vorm van hydrogel en de flexibele structuur zorgt voor het gemak van verdere potentiële onderzoeksactiviteiten (bijv. overdracht van het equivalent van het ene gerecht naar het andere). De oplossing van type I collageen verkregen uit rattenstaart wordt normaal gesproken bereid door poederoplossing in 20 mM azijnzuur. Om de collageenpolymerisatiestap te bereiken, is het noodzakelijk om de juiste pH-omstandigheden te bieden, variërend van 6,5-7,5. Dit kan worden gewaarborgd door de toevoeging van een strikte hoeveelheid natriumhydroxide. Voor het gemak hebben sommige bedrijven specifieke berekeningen ingevoerd, die kunnen helpen bij het bepalen van de exacte volumes die nodig zijn om dergelijke hydrogels te bereiden (tabel 6). Hoewel in de literatuur verschillende concentraties collageen in de hydrogels kunnen worden aangetroffen (bijvoorbeeld 0,5-2 mg/ml³⁵; 5-30 mg/ml³⁶; laag en hoog collageengehalte³⁷), werd in het beschreven model de oplossing van 2 mg/ml gebruikt omdat de hydrogel nog steeds een flexibele structuur had, maar compact genoeg was om indien nodig uit de put te worden gehaald.

Om een vrij realistische huid van volledige dikte te bereiden, moeten equivalente cellen worden gezaaid in een verhouding die mogelijk zo dicht mogelijk bij deze in ons lichaam ligt. In het geval van de epidermis is, afhankelijk van de plaats van het lichaam, de relatie tussen een melanocyt en een pool van geassocieerde keratinocyten een verhouding van ongeveer 1:36, die wordt gedefinieerd als de epidermale melanine-eenheid (EMU)³⁸. De aangebrachte verhouding in de kunstmatige epidermis was dus 1 melanocyt op 15 keratinocyten (tabel 5). Om een kunstmatige dermislaag te creëren, werd de collageen type 1 hydrogel gebruikt waarin fibroblasten en mestcellen werden opgenomen in de verhouding van 1 mestcel tot 10 fibroblasten. Elke laag van het geconstrueerde equivalent kan in real-time worden gecontroleerd op de omgekeerde optische microscoop door de diepte van het waargenomen monster te veranderen (voorbeeldbeelden worden weergegeven in figuur 11).

Figuur 11: Real-time observatie van verschillende cellen in bepaalde lagen van het gecreëerde huidequivalent van volledige dikte. (A) pseudo-dermis en (B) pseudo-epidermis) zoals gevisualiseerd door de helderveldmicroscopie. Schaal balken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Nauwkeurigere waarnemingen met de bevestiging van het verkrijgen van de beoogde structuur van het model kunnen worden gedaan door de kleuring van het equivalent uit te voeren. Het vaste equivalent moet eerst in paraffine worden ingebed en vervolgens op een microtoom worden gesneden. De objectglaasjes met dun kunstmatig weefsel kunnen later worden gekleurd met verschillende kleurstoffen, waaronder hematoxyline en eosine (basiskleuring uitgevoerd in medische laboratoria). Dankzij die actie is het mogelijk om de kunstmatige dermis en epidermis in de equivalenten te onderscheiden en om individuele huidcellen te identificeren (figuur 12). In figuur 12 zijn niet alleen de specifieke celtypen weergegeven, maar is het ook mogelijk om de keratinocyten in verschillende fasen van het celdelingsproces (telofase en metafase) te zien. In het geval van mestcellen zijn specifieke korrels goed herkenbaar in de cel. Deze beelden bevestigen in eerste instantie dat het gecreëerde huidequivalent leeft (de cellen groeien erin) en dat ze normaal kunnen functioneren in het ontwikkelde model. Bij de 3D-epidermis en modellen van de volledige dikte van de huid is het echter vooral belangrijk om de kwaliteit en functionaliteit van de verkregen constructie te controleren. Om de doorlaatbaarheid van de hoornlaag te controleren, moeten de metingen van de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) of Lucifer-geelkleuring worden toegepast^39,40. Bovendien moeten in een goed samengestelde kunsthuid specifieke markers aanwezig zijn, waaronder differentiatiemarkers (bijv. Filaggrin, Involucrin, Loricrin, Keratine 10, Keratine 5, lipidenklassen bestaande uit ceramiden), dermale-epidermale junctiemarkers (bijv. Type IV collageen, laminine V, Alpha6Beta4-integrine, BP-antigeen)⁴¹, tight-junction markers in de epidermale lagen (bijv. claudine-1, occludine, zonula occludens-eiwit (ZO)-1)⁴² evenals markers voor proliferatie van de basale laag (Ki67)⁴¹.

Figuur 12: Morfologie en werking van huidcellen. Overzicht van de morfologie en werking van huidcellen (observatie van celdelingen) in het huidequivalent van volledige dikte gekleurd met hematoxyline en eosine. Schaalbalken: 100 μm (bovenste paneel), 50 μm (middelste paneel, links), 100 μm (middelste paneel, rechts), 50 μm (onderste paneel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De meest gebruikte manier om de aanwezigheid van een biomarker te bevestigen, is door specifieke kleuring uit te voeren, zoals immunohistochemisch of immunofluorescerend. Verschillende antilichamen en fluorescerende kleurstoffen kunnen worden toegepast voor microscopische visualisatie van bepaalde cellen in de modellen. Het resultaat van voorbeeldige kleuring van cellen in cultuur is te zien in figuur 13. Om keratinocyten te observeren, werd een antilichaam tegen cytokeratine 14 gebruikt. In het geval van melanocyten was het melan-A-specifiek antilichaam. Collageen 1A2-antilichaam werd gebruikt om fibroblasten te kleuren en het fluorescerende sulforhodamine 101 geconjugeerd met avidine detecteerde heparine aanwezig in mestcellen.

Figuur 13: Resultaten van de kleuring van fluorescerende cellen. (A) Cytokeratine 14 in keratinocyten. Schaalbalk: 50 μm. (B) Melan-A in melanocyten. Schaalbalk: 50 μm. (C) Collageen 1A2 in fibroblasten. Schaalverdeling: 100 μm. (D) Heparine in mestcellen. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit artikel presenteert de methodologie die kan worden toegepast om de eigen geavanceerde kunstmatige huidmodellen voor te bereiden. Het is een goede oplossing wanneer het geplande onderzoek strikt gedefinieerde onderzoeksmodellen vereist die mogelijk niet beschikbaar of erg duur op de markt blijken te zijn. Zoals eerder vermeld, zijn er verschillende commerciële huidequivalenten op de markt (bijv. EpiSkin, EpiDerm FT). Hun kosten (€100-€400 per stuk) en levertijd (enkele dagen-weken) kunnen de onderzoeker er echter toe aanzetten om te proberen zelf een dergelijk model voor te bereiden. De voorgestelde procedures zijn gemakkelijk uit te voeren, zelfs voor onervaren wetenschappers, en maken het tegelijkertijd mogelijk om zeer geavanceerde huidmodellen te verkrijgen. Het is de moeite waard om te benadrukken dat de beslissing over de cellulaire samenstelling van een bepaald model volledig afhankelijk is van de onderzoeker. Afgezien van het gecreëerde model, kan het verder worden ontwikkeld en verbeterd, wat volledig nieuwe onderzoeksperspectieven opent. In het geval van commerciële modellen is het noodzakelijk om een ander equivalent te kopen.

Hoewel de 3D-celculturen geavanceerd zijn met meerdere celtypen, gemakkelijk te hanteren en toegankelijk zijn, zijn het nog steeds slechts kunstmatige modellen die de complexiteit en functionaliteit van het weefsel (bijv. immunologische functies, vascularisatie) niet volledig kunnen nabootsen. Daarom zijn in de meeste onderzoeken meerdere modellen nodig om de verkregen resultaten te bevestigen. Enkele voor- en nadelen van deze modellen werden verzameld in Tabel 9, evenals hun beperkingen. Aan de andere kant garanderen commerciële modellen hoge kwalitatieve normen met reproduceerbaarheid van experimenten en vergelijkbaarheid van gegevens tussen de laboratoria. Om het gebruik van een nieuwe verbinding voor onderzoek te implementeren, zal het zeker nodig zijn om het juiste commerciële equivalent aan te schaffen. Maar in de voorbereidende fase kan zo'n zelfgemaakt 3D-model van de huid (bol van het type multicell of equivalent) helpen om het aantal experimenten dat op een commercieel equivalent moet worden uitgevoerd, te verminderen. Het doel van het produceren en gebruiken van de beschreven modellen is niet om de noodzaak om gecertificeerde onderzoeksmodellen toe te passen te omzeilen, maar om onderzoek te vergemakkelijken en de daarmee samenhangende kosten te verminderen.

Vergeleken paar modellen	Voordelen			Nadelen
Celcultuur vs. dieren	Minimaal dierenleed			Beperkte informatie over de invloed van een geteste factor op het hele lichaam
	Hoge standaardisatie van experimenten - betere reproduceerbaarheid van de resultaten			Een enkel model is niet voldoende om de processen in het lichaam weer te geven
	Geen bijwerkingen voor het hele organisme			-
	Betere controle over de omstandigheden van het experiment			-
	Mogelijkheid tot automatisering (bijv. bioprinting)			-
	Lagere kosten			-
	De kleine omvang van het benodigde monster			-
	Beperkte hoeveelheid geproduceerd afval			-
3D vs. 2D culturen	Beter het volledige organisme weerspiegelen			Tijdrovende cultuur
	Mogelijkheid om een functioneel weefsel te creëren			Hogere kosten
	Mogelijkheid om een model te maken dat is afgestemd op de behoeften van het uitgevoerde onderzoek			Spontane vorming van een 3D-structuur is bijna niet mogelijk
	-			Gebrek aan gestandaardiseerde tests om de effecten van verschillende verbindingen te kwantificeren
	-			Beperkte toegang tot verschillende 3D-culturen die op de markt verkrijgbaar zijn
Cellijn vs. primaire cellen	Gecertificeerde en goedgekeurde modellen			Er is slechts een beperkt aantal cellijnen beschikbaar
	Hoge standaardisatie van experimenten - betere reproduceerbaarheid van de resultaten			Beperkte mogelijkheid om meerdere soorten cellen van dezelfde donor te verkrijgen
	Langere levensduur			Kan andere eigenschappen bezitten dan de oorspronkelijke cellen
	Vrij snelle proliferatie			Vaak verstoorde functionaliteit van cellen
	Minder gevoelig voor verschillende activiteiten (bijv. invriezen, centrifugeren)			-

Tabel 9: Vergelijking van het gebruik van verschillende modellen in onderzoek - voordelen versus nadelen

Verschillende artikelen beschrijven hoe 3D-huidmodellen moeten worden voorbereid (afgezien van overzichtsartikelen die in de handel verkrijgbare modellen samenvatten 14,43,44, zijn ze meestal gericht op een enkele methodologie om bollen 45 of equivalenten ⁴⁶ te verkrijgen).

In dit artikel zijn twee methodieken beschreven voor de bolvorming met huidcellen. De hangende druppelmethode wordt veel gebruikt, maar de herhaalbaarheid en stabiliteit ervan kunnen in sommige gevallen onvoldoende zijn. De meeste stappen vereisen specifieke handelingen, zoals werken op hoge snelheid door de verdamping van water uit druppels tijdens het overbrengen. Zachte bewegingen worden ook aanbevolen, omdat het ontbreken van een dergelijke vaardigheid kan leiden tot schade aan het celaggregaat^31,32. Een eenvoudigere methode voor bolvoorbereiding is dus gericht op het beperken van de celadhesie. De afwezigheid van een goed oppervlak voor celaanhechting bevordert hogere interacties tussen cellen. Als gevolg hiervan worden celaggregaten gegenereerd. De herhaalbaarheid is veel hoger omdat er geen noodzaak is voor het overbrengen van de bol. Met deze methoden werd het optimale aantal huidcellen om een bol te maken vastgesteld op 1 x 10⁴ cellen/bol.

Vervolgens werden procedures getoond die de bereiding van huidequivalenten beschrijven. Hun uiterlijk en functionaliteit in onderzoek kunnen sterk afhangen van de elementen waaruit ze zijn opgebouwd, waaronder cellen (tabel 2), steigers en media. De 3D-steigers die worden gebruikt voor de bereiding van kunsthuid kunnen worden onderverdeeld in synthetische hydrogels en hydrogels gevormd uit natuurlijke bronnen. Afhankelijk van het gebruikte materiaal en de eigenschappen ervan om de hydrogel samen te stellen, kan de noodzaak ontstaan om het medium extra aan te vullen. Synthetische hydrogels vereisen de opname van bioactieve moleculen (eiwitten, enzymen en groeifactoren) in het synthetische hydrogelnetwerk om specifieke celfuncties te bemiddelen⁴⁷. De belangrijkste benaderingen die in de literatuur worden gepresenteerd voor het bereiken van gecontroleerde afgifte van groeifactoren aan hydrogels zijn onder meer directe belasting, elektrostatische interactie, covalente binding en het gebruik van dragers⁴⁸. Hydrogels gevormd uit natuurlijke bronnen zoals ECM-eiwitten en polymeren kunnen vloeistofroutes door de 3D-steiger genereren, waardoor de distributie van voedingsstoffen wordt versneld; Er is dus geen extra suppletie van het medium nodig. Onderzoek heeft aangetoond dat kleine moleculen (zoals cytokinen en groeifactoren) en macromoleculen (waaronder glycosaminoglycanen en proteoglycanen) door diffusie door de ECM kunnen worden getransporteerd⁴⁷. De moleculaire diffusie van zuurstof, voedingsstoffen en andere bioactieve moleculen kan echter worden belemmerd door de eigenschappen van de ECM-hydrogel zelf. Een lagere diffusie was gecorreleerd met de hogere dikte van de hydrogel, maar ook met een zeer hoge concentratie collageen³⁷. In deze studie werd, om het huidequivalent te creëren, een lage collageenconcentratie gelijk aan 2 mg/ml gebruikt, wat suggereert dat de moleculaire diffusie door de hydrogel goed en snel zou moeten zijn. Er werd in dit stadium dus geen extra aanvulling aan het medium of aan de hydrogel zelf gegeven. Om de dermis na te bootsen, werden mestcellen en fibroblasten (1:10) ingebed in de collageenhydrogel. Vervolgens werden melanocyten en keratinocyten (1:15) op de hydrogel gezaaid en het hele equivalent werd in het medium gekweekt. Het is vermeldenswaard dat het basismedium is samengesteld uit verschillende aminozuren, anorganische zuren en vitamines, en het wordt bovendien aangevuld met serum (bestaande uit meerdere: groei- en hechtingsfactoren voor cellen, lipiden, hormonen, voedingsstoffen en energiebronnen, dragers, bindings- en overdrachtseiwitten, enz.). Om de juiste structuur van de opperhuid te bereiken, moeten op een bepaald moment verschillende supplementen aan het medium worden toegevoegd. De belangrijkste stimulator om epidermale differentiatie op gang te brengen is calcium, omdat het de intracellulaire signalering activeert. Ascorbinezuur stimuleert een vergelijkbare signaalroute als die gemedieerd door calcium, maar het effect ervan gaat ook gepaard met een verbeterd ascorbaattransport en preventie van uitputting van hydrofiele antioxidanten⁴¹. Bovendien werd de differentiatie van cellen verbeterd wanneer andere componenten aan het medium werden toegevoegd (zoals cafeïne, hydrocortison, triiodothyronine, adenine en choleratoxine)^41,44. Het is belangrijk dat de voorbereide modellen altijd worden gecontroleerd op de aanwezigheid van een bepaald celtype in de juiste laag. De aanwezigheid van alle vier de soorten huidcellen werd bevestigd in de structuur van het door H&E gecreëerde equivalent kleuring.

Het meest voorkomende probleem is de delicatesse en intuïtie bij het hanteren van de verkregen modellen. Sommige problemen kunnen verband houden met de vorming van de celbol en met het hydrogelpreparaat. Tijdens de celkweek kunnen zich ook verschillende andere problemen voordoen; deze omvatten microbiële infecties, lage proliferatiesnelheid van cellen, veroudering van primaire cellen die in de modellen worden gebruikt, maximale kweektijd van 2D- en 3D-modellen gereconstrueerd uit primaire cellen versus cellijnen, enz. In tabel 10 zijn enkele praktische adviezen verzameld over wat te doen wanneer een van de volgende problemen zich voordoet.

Veelvoorkomende problemen bij celkweek	Suggesties
Microbiële infectie	Als er een microbiële infectie optreedt in een van de kolven/schaaltjes met cellen, is het beter om de geïnfecteerde cultuur zo snel mogelijk te verwijderen (om de resterende kolven/schaaltjes niet met cellen te besmetten). Vries een nieuwe injectieflacon met cellen opnieuw in.  Als de infectie terugkeert, is het goed om te proberen de spectra van de toegepaste antibiotica te verbreden en de concentratie ervan te verhogen.
Lage proliferatiesnelheid van cellen	Sommige cellen hebben een lange verdubbelingstijd. Om hun proliferatie te stimuleren, kunnen verschillende celspecifieke groeifactoren aan het basismedium worden toegevoegd. Ook het verhogen van de concentratie van FBS of L-glutamine in het basale medium kan helpen om de groei van de cellen te stimuleren.
Veroudering van primaire cellen die in de modellen worden gebruikt	Na een paar passages gaan de primaire cellen in veroudering en stoppen ze met delen. Om dit probleem in de modellen op te lossen, wordt aanbevolen om de cellen vanaf een zo vroeg mogelijke passage te gebruiken om het model te bouwen.
Maximale kweektijd van 2D- en 3D-modellen gereconstrueerd uit primaire cellen vs. cellijnen	Het tijdstip van kweken van een model is sterk afhankelijk van het type cellen dat wordt gebruikt. Bij primaire cellen zal de kweektijd korter zijn vanwege hun korte levensduur.
Moeilijkheden bij de vorming van de celbol	Sommige cellen kunnen een langere tijd nodig hebben voor de vorming van bollen. Als de bolletjes na nog een paar dagen niet zijn gevormd, verzamel dan de cellen uit het monster en controleer hun levensvatbaarheid met bijvoorbeeld trypan-blauwkleuring.
Problemen met de stabiliteit van de bol	Als de bollen niet stabiel zijn en tijdens het hanteren worden vernietigd, probeer dan bollen te maken van een lager aantal cellen. Zorg ervoor dat u de schalen waarin de bollen groeien altijd voorzichtig overbrengt.
Moeilijkheden met het hydrogelpreparaat	Controleer of de verhouding van de ingrediënten (water, PBS [10x], NaOH, collageen type 1) correct was. De standaardoplossing van collageen is meestal erg dicht, dus zorg ervoor dat u deze langzaam pipettert. Luchtbellen verstoren de morfologie van de hydrogel, dus omgekeerd pipetteren van de gel kan helpen bij dit probleem.

Tabel 10: Problemen met celcultuur oplossen

De gevestigde modellen na fabricage kunnen op meerdere gebieden worden gebruikt, te beginnen met (1) cytotoxiciteits- en genotoxiciteitsexperimenten van nieuwe verbindingen met biologische activiteit voor gebruik in geneesmiddelen en cosmetica⁴⁹, (2) experimenten met verschillende factorstimulatie⁵⁰, (3) fundamenteel onderzoek dat onze kennis over huidcellen, hun biologische functies, interacties met andere cellen en het milieu vergroot^{51, 52}, (4) onderzoek naar geselecteerde ziekte-entiteiten waarbij een specifiek type cel in het gecreëerde model kan worden geïntroduceerd (kankercellen, cellen met een mutatie in een bepaald gen, ^enz.14,53) en nog veel meer. Het spreekt voor zich dat de toepassing van deze modellen in overeenstemming blijft met het 3V-principe voor een ethischer gebruik van dieren bij het testen van producten en wetenschappelijk onderzoek en niet in strijd is met de verbodswet op het testen van cosmetische producten op dieren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
24-well plate for adherent cell culture	Biologix Europe GmbH	07-6024	-
35%–38% HCL	Chempur	115752837	-
60 mm cell culture Petri dish	Nest	705001	-
Avidin−Sulforhodamine 101	Sigma Aldrich	A2348-5MG	-
Bright-field inverted microscope	Olympus	CKX41	-
Calcium chloride	Avantor	874870116	-
Cell culture flask T75 for adherent cells	Genoplast	G77080033	-
Centrifuge tube 15 mL	GoogLab Scientific	G66010522	-
CO2 Incubator	Heal Force	Galaxy 170R	-
Col1A2 antibody produced in rabbit	Novus	NBP2-92790	-
Corning(R) Transwell(R) Polycarbonate	Corning	CLS3422-48EA	-
Cytokeratin 14 antibody produced in mouse	Novus	NBP1-79069	-
DPX Mountant for histology	Sigma Aldrich	06522-100ML	-
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	VWR Chemicals	L0102-500	-
Eosine Y	Kolchem	-	0.5 % waterige oplossing
Eppendorf tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001	-
Eppendorf tube 2 mL	Sarstedt	72.691	-
Ethyl alcohol absolute 99.8%	Avantor	396480111	verdund in ultrapuur water tot de benodigde concentraties
Fetal bovine serum	Gibco	10270106	-
Fluorescent inverted microscope	Olympus	IX71	-
Goat anti-mouse secondary antibody conjugated with FITC	Sigma Aldrich	F0257-1mL
Goat anti-rabbit secondary antibody conjugated with FITC	Novus	NB7159	-
Harris Hematoxylin	Kolchem	-	1 mg/mL in 95% ethanol
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	-
Laminar chamber	Heal Force	HFSafe-1200	-
Melan-A antibody produced in mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-20032	-
Microtome	Microm	HM355S	-
NaOH	Avantor	810981997	-
Paraffin pastilles	Sigma Aldrich	1.07164	-
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	1581227	-
Penicillin/Streptomycin solution	Sigma Aldrich	P4333	-
Pipette tip, 1000 µL	Sarstedt	70.305	-
Pipette tip, 20 µL	Sarstedt	70.3021	-
Pipette tip, 200 µL	Sarstedt	70.303	-
Pluronic F-127	BASF	50401036	-
Serological pipette 10 mL	GoogLab Scientific	G33270011	-
Serological pipette 25 mL	GoogLab Scientific	G33280011	-
Serological pipette 5 mL	GoogLab Scientific	G33260011	-
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	-
Sodium bicarbonate	Chempur	118105307
Trypsin-EDTA 0.25% solution, phenol red	Sigma Aldrich	25200072	-
Type 1 collagen	IBIDI	50201	-
U-bottom 96-well plate	Sarstedt	83.3925500	-
Xylene	Sigma Aldrich	534056	-