Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het netwerk van microtubuli is een essentieel onderdeel van het zenuwstelsel. Mutaties in veel regulerende eiwitten van microtubuli worden geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen en neurologische aandoeningen, zoals microtubuli-geassocieerd eiwit Tau tot neurodegeneratieve ziekten, microtubuli-afsnijdend eiwit Spastin en Katanin 60 veroorzaken respectievelijk erfelijke spastische dwarslaesie en neurologische ontwikkelingsafwijkingen. Detectie van microtubuli-netwerken in neuronen is voordelig voor het ophelderen van de pathogenese van neurologische aandoeningen. De kleine omvang van neuronen en de dichte rangschikking van axonale microtubulibundels maken het visualiseren van de microtubuli-netwerken echter een uitdaging. In deze studie beschrijven we een methode voor dissectie van de larvale neuromusculaire junctie en spiercellen, evenals immunokleuring van α-tubuline en microtubuli-geassocieerd eiwit Futsch om microtubuli-netwerken in Drosophila melanogaster te visualiseren. De neuromusculaire junctie stelt ons in staat om zowel pre- als postsynaptische microtubuli te observeren, en de grote omvang van spiercellen in Drosophila-larven zorgt voor een duidelijke visualisatie van het microtubuli-netwerk. Hier, door Katanin 60 te muteren en tot overexpressie te brengen in Drosophila melanogaster, en vervolgens de microtubuli-netwerken in de neuromusculaire junctie en spiercellen te onderzoeken, onthullen we nauwkeurig de regulerende rol van Katanin 60 in de neurologische ontwikkeling. Daarom, in combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de dynamiek van microtubuli aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.
Inleiding
Microtubuli (MT's), als een van de structurele componenten van het cytoskelet, spelen een belangrijke rol in diverse biologische processen, waaronder celdeling, celgroei en -motiliteit, intracellulair transport en het behoud van de celvorm. De dynamiek en functie van microtubuli worden gemoduleerd door interacties met andere eiwitten, zoals MAP1, MAP2, Tau, Katanin en Kinesin 1,2,3,4,5.
In neuronen zijn microtubuli essentieel voor de ontwikkeling en het onderhoud van axonen en dendrieten. Afwijkingen in microtubuli leiden tot disfunctie en zelfs de dood van neuronen. In de hersenen van Alzheimerpatiënten vermindert hyperfosforylering van het Tau-eiwit bijvoorbeeld de stabiliteit van het microtubuli-netwerk, waardoor neurologische onregelmatigheden ontstaan. Het onderzoeken van microtubuli-netwerken zal dus bijdragen aan een beter begrip van de neurologische ontwikkeling en de pathogenese van neurologische aandoeningen.
De neuromusculaire junctie (NMJ) is de perifere synaps die wordt gevormd tussen een axonterminal van een motorneuron en een spiervezel, wat een uitstekend en krachtig modelsysteem is voor het bestuderen van synaptische structuur en functies7. Futsch is een eiwit in Drosophila dat homoloog is aan het microtubuli-bindende eiwit MAP1B dat wordt aangetroffen bij zoogdieren8. Het komt alleen tot expressie in neuronen en speelt een rol bij de ontwikkeling van de synaptische knoppen van het NMJ 8,9. In wild-type worden filamenteuze bundels die langs het centrum van NMJ-processen lopen, gevisualiseerd door immunokleuring met anti-Futsch. Bij het bereiken van het einde van NMJ heeft deze bundel het vermogen om ofwel een lus te vormen die bestaat uit microtubuli of om zijn filamenteuze structuur te verliezen, wat resulteert in een diffuus en puntvormig uiterlijk10. Microtubuli-lussen worden geassocieerd met gepauzeerde groeikegels, wat suggereert dat de microtubuli-array stabiel is11. Daarom kunnen we indirect de stabiele ontwikkeling van microtubuli in NMJ bepalen door Futsch-kleuring. De grote omvang van spiercellen in de larve van Drosophila zorgt voor een duidelijke visualisatie van het netwerk van microtubuli. De factoren die van invloed zijn op de stabiliteit van het netwerk van microtubuli kunnen worden gevonden door de dichtheid en vorm van microtubuli te analyseren. Tegelijkertijd kan de netwerkstatus van spiercellen in microtubuli worden geverifieerd met het resultaat van NMJ om uitgebreidere conclusies te verkrijgen.
Er zijn veel protocollen gebruikt voor het onderzoeken van het netwerk en de dynamiek van microtubuli. Deze onderzoeken hebben zich echter vaak gericht op in vitro studies 12,13,14,15,16. Als alternatief hebben sommige in vivo experimenten elektronenmicroscopie gebruikt om het cytoskelet te detecteren17. Volgens de specifieke binding van fluorescerend gelabelde antilichamen of chemische kleurstoffen aan eiwitten of DNA, maken de hier gepresenteerde methoden de detectie van microtubuli-netwerken in NMJ op het niveau van individuele neuronen in vivo mogelijk, met resultaten die worden bevestigd door waarnemingen in spiercellen. Dit protocol is eenvoudig, stabiel en herhaalbaar in combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila melanogaster, waardoor een breed scala aan fenotypische onderzoeken en genetische screenings mogelijk is voor de rol van regulerende eiwitten van microtubuli-netwerken in het zenuwstelsel in vivo.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Dissectie van larven
OPMERKING: De ontleedoplossing hemolymfe-achtige zoutoplossing (HL3.1)18 en de fixeeroplossing 4% paraformaldehyde (PFA)19,20 worden bij kamertemperatuur gebruikt omdat de microtubuli depolymeriseren wanneer de temperatuur te laag is.
- Kies een zwervende larve van de 3einstar met een lange stompe pincet. Was het met HL3.1 en plaats het op de dissectieschaal onder de stereomicroscoop.
OPMERKING: De zwervende larve van de 3einstar is te herkennen aan de vertakte voorste spiracle en kruipt rond de buis bij ongeveer 96 uur (25 °C)21. - Plaats de larve met de dorsale of ventrale kant naar boven. Identificeer de dorsale zijde aan de hand van de twee lange luchtpijpen en de ventrale aan de hand van de abdominale denticle gordels.
- Afhankelijk van het weefsel dat u wilt observeren, kiest u voor dorsale of ventrale dissectie. Dit zal een nauwkeuriger en gedetailleerder beeld van het specifieke interessegebied mogelijk maken. Snijd voor NMJ- en spiercelobservatie respectievelijk de dorsale en ventrale gebieden van de larven open.
- Speld de mondhaken en de staart. Pas de pinnen aan om de larve in een verlengde toestand te houden. Voeg een druppel HL3.1 toe aan de larve om te voorkomen dat deze uitdroogt.
OPMERKING: Ca2+ -vrij HL 3.1 kan worden gebruikt om samentrekking van de spieren tijdens dissectie te minimaliseren. - Gebruik de ontleedschaar om een kleine dwarse snede te maken dicht bij het achterste uiteinde, maar knip het achterste uiteinde niet af. Knip vervolgens langs de ventrale middellijn naar het voorste uiteinde.
- Steek vier insectenpinnen op de vier hoeken van de larve. Stel de insectenpinnen zo af dat de larve maximaal in alle richtingen wordt uitgerekt.
- Gebruik de pincet om inwendige organen te verwijderen zonder de spieren te beschadigen.
2. Fixatie
- Voeg 100 μL PFA (4%) toe om de karkassen 40 minuten onder te dompelen terwijl de karkassen nog op de snijschaal zijn geprikt.
LET OP: Er worden effectieve beschermingsmaatregelen genomen om direct contact met de huid of inademing te voorkomen, aangezien PFA een gevaar vormt. - Demonteer de pinnen en breng het monster over in een microcentrifugebuisje van 2 ml. Spoel PFA af met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,2% Triton X-100 (0,2% PBST) om 2 ml microcentrifugebuis gedurende 10 minuten op de ontkleuringsshaker te vullen met 15 rpm. Herhaal het wasproces 5x.
3. Immunocytochemie
- Dompel de karkassen onder in blokkeringsmiddel (5% geitenserum in 0,2% PBST) en blokkeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het blokkeringsmiddel en vervang het door 200 μl van het primaire antilichaam (bijv. anti-α-tubuline, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) verdund met 0,2% PBST bij 4 °C gedurende een nacht. Visualiseer spiermicrotubuli door immunokleuring met monoklonale anti-α-tubuline. Anti-Futsch kan indirect de morfologie van microtubuli in NMJ weerspiegelen.
- Was de larven na incubatie van het primaire antilichaam met 0,2% PBST gedurende 10 min. Herhaal 5x.
- Incubeer de larven met 200 μL secundair antilichaam (bijv. geit anti-Mouse-488, 1:1000) verdund met 0,2% PBST bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur in het donker.
- Voeg vervolgens een nucleaire kleurstof zoals TO-PRO(R) 3-jodide (T3605) in een concentratie van 1:1000 toe aan de incubatiebuis gedurende 30 minuten bij het kleuren van de microtubuli in het donker20,22.
- Spoel het secundaire antilichaam en de nucleaire kleurstof af met 0,2% PBST gedurende 10 minuten. Herhaal dit 5x in het donker.
4. Montage
- Plaats het larvale karkas in 0,2% PBST op een glasplaatje en pas het aan onder de stereomicroscoop. Zorg ervoor dat het binnenoppervlak van het larvale karkas naar boven wijst en dat alle larvale karkassen naar wens zijn gerangschikt.
- Absorbeer overtollige PBST-oplossing met een doekje en voeg voorzichtig een druppel antifade-montagemedium toe.
- Plaats een dekglaasje op het glaasje om de ontlede larven langzaam en voorzichtig af te dekken om luchtbellen te voorkomen.
- Breng nagellak aan rond het dekglaasje. Plaats het glaasje in de donkere ruimte om fluorescerende demping te verminderen.
5. Beeldacquisitie
- Om de beelden te verkrijgen, gebruikt u een confocale laserscanmicroscoop, selecteert u het 60x olie-immersieobjectief (numerieke apertuur 1,42) of iets dergelijks, en past u het laservermogen en de golflengte aan op basis van het experiment.
- Om de NMJ te identificeren, maakt u beelden in spier 4 in segment A3 (zoals weergegeven op de locatie in figuur 1F). Selecteer een laser van 488 nm om de α-tubuline of Futsch te activeren en 543 nm om de HRP-beeldvormingstrack te activeren. Stel de parameters in op een framegrootte van 800 x 800 pixels, een digitale zoom van 2,0 en een beeldinterval van 0,8 μm in NMJ's (Afbeelding 2).
- Om de microtubuli in de spier te identificeren, maakt u beelden van spier 2 in segment A3-A5 (zoals weergegeven op de locatie in figuur 1G), aangezien deze minder tracheale takken heeft. Kies een laser van 488 nm voor het activeren van α-tubuline en een laser van 635 nm voor het activeren van de T3605-beeldvormingsbaan. Stel de parameters in op een framegrootte van 1024 pixels x 1024 pixels, een digitale zoom van 3,0 en een beeldvormingsinterval van 0,4 μm in spiercellen (Afbeelding 3).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We demonstreerden een stap-voor-stap procedure voor het visualiseren van het microtubuli-netwerk in zowel neuromusculaire juncties (NMJ's) als spiercellen. Na dissectie volgens het schematische diagram (Figuur 1A-E) wordt immunokleuring uitgevoerd en worden vervolgens beelden waargenomen en verzameld onder een confocale lasermicroscoop of een stereoscopische fluorescentiemicroscoop (Figuur 1F,G).
Zowe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een protocol beschreven voor de dissectie en immunokleuring van Drosophila larvale neuromusculaire juncties en spiercellen. Er zijn verschillende essentiële punten om rekening mee te houden. Ten eerste is het voorkomen van letsel aan de waargenomen spieren cruciaal tijdens het dissectieproces. Het kan de moeite waard zijn om de filet te fixeren voordat u inwendige organen verwijdert om direct contact tussen de tang en de spieren te voorkomen. Om spierbeschadiging of scheiding van de larvale epidermis ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Ying Xiong voor de discussies en commentaren op het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation of China (NSFC) aan C. M. (31500839).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilueren 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocale microscoop | Olympus | ||
| Geit anti-Muis antilichaam, Alexa Fluor 488 geconjugeerd | Thermo Fisher | A-11001 | dilueren 1:1.000 |
| Laser confocale microscoop LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Schaar | 66vision | 54138B | |
| Muis anti-Futsch antilichaam | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilueren 1:50 |
| Muis anti-α-tubuline antilichaam | Sigma | T5168 | dilueren 1:1.000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Eindconcentratie: 4% in PB Buffer |
| Roestvrijstalen Minutien Pins | Entomoravia | 0,1 mm Diam | |
| Stereomicroscoop SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopische fluorescentiemicroscoop BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-geconjugeerd geit anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilueren 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 jodide | Invitrogen | T3605 | dilueren 1:1.000 |
| Transfer ontkleuring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instrumenten | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Pincet | dumont | 500342 |
Referenties
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224(2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204(2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488(2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202(2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
