Extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest

Samenvatting

Hier beschrijven we een in-house extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest. Op activiteit gebaseerde assays en op antigeen gebaseerde assays zijn gebruikt om de weefselfactor te meten in extracellulaire blaasjes van menselijke plasmamonsters. Op activiteit gebaseerde assays hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit dan op antigeen gebaseerde assays.

Samenvatting

Weefselfactor (TF) is een transmembraanreceptor voor factor (F) VII en FVIIa. Het TF/FVIIa-complex initieert de stollingscascade door zowel FIX als FX te activeren. TF komt vrij uit cellen in de bloedsomloop in de vorm van extracellulaire blaasjes (EV's). Het niveau van TF-positieve (⁺) EV's is verhoogd bij verschillende ziekten, waaronder kanker, bacteriële en virale infecties en cirrose, en wordt geassocieerd met trombose, gedissemineerde intravasculaire coagulatie, ernst van de ziekte en mortaliteit. Er zijn twee manieren om TF⁺ EV's in plasma te meten: antigeen- en activiteitsgebaseerde assays. Gegevens geven aan dat op activiteit gebaseerde assays een hogere gevoeligheid en specificiteit hebben dan op antigeen gebaseerde assays. Dit artikel beschrijft onze interne EVTF-activiteitstest op basis van een tweetraps FXa-generatietest. FVIIa, FX en calcium worden toegevoegd aan de TF⁺ EV-bevattende monsters om FXa te genereren in de aan- en afwezigheid van anti-TF-antilichamen om TF-afhankelijke FXa-generatie te onderscheiden van TF-onafhankelijke FXa-generatie. Een chromogeen substraat dat door FXa wordt gesplitst, wordt gebruikt om het FXa-niveau te bepalen, terwijl een standaardcurve gegenereerd met een gerelipideerde recombinante TF wordt gebruikt voor de bepaling van de TF-concentratie. Deze interne EVTF-activiteitstest heeft een hogere gevoeligheid en specificiteit dan een commerciële TF-activiteitstest.

Inleiding

De bloedstolling wordt geïnitieerd met de binding van factor (F) VII/VIIa aan weefselfactor (TF)¹. Het TF/FVIIa-complex activeert zowel FIX als FX om de bloedstolling te activeren¹. Er zijn twee vormen van membraangebonden TF over de volledige lengte: versleuteld en actief. Daarnaast is er een alternatief gesplitste vorm van TF (asTF). Sfingomyeline en fosfatidylcholine in het buitenste blad van het celmembraan houden TF in een gecodeerde toestand ^2,3,4. Wanneer cellen worden geactiveerd of beschadigd, brengt fosfolipide-scramblase fosfatidylserine en andere negatief geladen fosfolipiden over naar de buitenste blaadje¹. De activering van cellen resulteert ook in de translocatie van zuur sfingomyelinase naar de buitenste blaad, waar het sfingomyeline afbreekt tot ceramide⁵. Deze twee mechanismen zetten versleutelde TF om in de actieve vorm. Er wordt ook voorgesteld dat eiwitdisulfide-isomerase de vorming van disulfidebindingen tussen Cys186 en Cys209 in gecodeerde TF bemiddelt, wat resulteert in de de-encryptie van TF ^6,7,8. asTF is ook aanwezig in de bloedsomloop, maar mist het transmembraandomein en is daarom oplosbaar ^9,10. Belangrijk is dat asTF zeer lage niveaus van procoagulantia-activiteit heeft in vergelijking met actieve TF^10,11 over de volledige lengte.

Extracellulaire blaasjes (EV's) komen vrij uit rustende, geactiveerde en stervende gastheercellen, evenals kankercellen¹². EV's brengen eiwitten tot expressie uit hun oudercellen¹². Actieve TF-dragende EV's komen vrij uit geactiveerde monocyten, endotheelcellen en tumorcellen in de bloedsomloop 13,14,15. Niveaus van TF in plasma kunnen worden gemeten door middel van activiteits- en antigeengebaseerde assays. Op antigeen gebaseerde assays omvatten ELISA en flowcytometrie¹⁶. Er zijn twee verschillende op activiteit gebaseerde tests: één- en tweetraps TF-activiteitstests. De eentrapstest is gebaseerd op een op plasma gebaseerde stollingstest. Het TF-bevattende monster wordt aan plasma toegevoegd en de tijd om een stolsel te vormen wordt gemeten na herverkalking. De tweetrapstest meet FXa-generatie van monsters door FVII of FVIIa, FX en calcium toe te voegen. FXa-niveaus worden bepaald met behulp van een substraat dat door FXa wordt gesplitst.

In zowel de een- als de tweetraps TF-activiteitsassays wordt de TF-concentratie bepaald met behulp van een standaardcurve die wordt gegenereerd met recombinant TF. Tweetrapstesten hebben een hogere sensitiviteit en specificiteit dan de eentrapstest. Veel onderzoeken hebben bevestigd dat op activiteit gebaseerde assays een hogere gevoeligheid en specificiteit hebben dan op antigeen gebaseerde assays 17,18,19,20,21. Bovendien heeft onze interne activiteitstest een hogere sensitiviteit en specificiteit dan een commerciële activiteitstest²². Gezonde personen hebben zeer lage of niet-detecteerbare niveaus van EVTF-activiteit in plasma. Daarentegen hebben personen met pathologische aandoeningen, zoals kanker, cirrose, sepsis en virale infectie, detecteerbare niveaus van EVTF-activiteit en dit wordt geassocieerd met trombose, gedissemineerde intravasculaire coagulatie, ernst van de ziekte en mortaliteit 23,24,25,26,27,28. Hier zullen we deze interne tweetraps EVTF-activiteitstest beschrijven.

Protocol

Het onderzoek werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of North Carolina in Chapel Hill (protocolnummer: 14-2108).

1. Bloedafname bij donoren

1. Verzamel volbloed met behulp van een schone venapunctie in de antecubitale ader met een naald van 21 G. Gooi de eerste 3 ml bloed weg, omdat dit deel van het bloed TF van perivasculaire cellen kan bevatten.
2. Zuig 2,7 of 1,8 ml (afhankelijk van de grootte van de buisjes) bloed op in een vacutainer met 3,2% natriumcitraat (0,109 mol/l). Vul de buizen niet te veel of te weinig in. Keer de buisjes onmiddellijk na bloedafname voorzichtig om om het natriumcitraat te dispergeren.
3. Vermijd roeren als de buizen vóór de verwerking worden getransporteerd. Bereid plasma binnen 2 uur na bloedafname.

2. Bereiding van negatief controleplasma

OPMERKING: Monsters mogen op geen enkel moment vóór de definitieve bevriezing op ijs worden geplaatst.

1. Bereid negatief controleplasma met volbloed van gezonde vrijwilligers. Bereid onmiddellijk na bloedafname bloedplaatjesvrij plasma als volgt.
   1. Breng bloedmonsters over van de vacutainerbuisjes naar buisjes van 15 ml.
   2. Centrifugeer bloedmonsters bij 2.500 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (20-24 °C) zonder rem.
   3. Breng het supernatans (bloedplaatjesarm plasma) over in een nieuwe buis en herhaal het centrifugeren onder dezelfde omstandigheden.
   4. Breng het supernatans (bloedplaatjesarm plasma) over in een nieuw buisje.
   5. Aliquot het monster in aliquots van ≥100 μl. Laat ongeveer 100 μL op de bodem van de buis liggen.
   6. Vries het bloedplaatjesarme plasma onmiddellijk in bij −80 °C (Figuur 1).

3. Bereiding van plasma met positieve controle

OPMERKING: De respons op lipopolysaccharide varieert van persoon tot persoon.

1. Breng bloedmonsters van de vacutainers over naar buisjes van 15 ml.
2. Bereid plasma voor positieve controle met volbloed van gezonde vrijwilligers gestimuleerd met lipopolysaccharide (LPS) van Escherichia coli O111:B4 (10 μg/ml) gedurende 5 uur bij 37 °C met agitatie.
3. Volg na 5 uur incubatie de stappen 2.1.2 tot en met 2.1.6.

4. Isolatie van extracellulaire blaasjes uit plasma

NOTITIE: EV-pellets zijn mogelijk niet zichtbaar. De ontdooitijd is afhankelijk van het monstervolume, maar we ontdooien gewoonlijk 100 μL plasma gedurende 30 minuten bij 37 °C.

1. Ontdooi plasmamonsters bij 37 °C.
2. Voeg 1 ml HBSA zonder calciumbuffer [HBSA-Ca(-)] buffer [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM glucose, 10 mM HEPES, 0,1% (w/v) runderserumalbumine] toe aan elk 100 μL plasmamonster in een buisje van 1,5 ml.
3. Centrifugeer plasmamonsters bij 20.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
4. Zuig het supernatans op tot 20 μL zonder de EV-pellet te verstoren.
5. Reconstitueer de EV-pellet door 1 ml HBSA-Ca(-)-buffer toe te voegen aan elke buis, pipetteer op en neer op de plaats van de EV-pellet en draai elke buis voor de tweede keer bij 20.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
6. Zuig het supernatans op tot 20 μL zonder de EV-pellet te verstoren.
7. Reconstitueer de EV-pellet in 80 μL HBSA-Ca(-) en pipetteer op en neer op de plaats van de EV-pellet (figuur 2).

5. Optie: Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes met behulp van ultracentrifuge

1. Vang na stap 4.3 het supernatans op en ultracentrifugeer het gedurende 70 minuten bij 4 °C bij 100.000 × g .
2. Zuig het supernatans op tot 20 μL zonder de EV-pellet te verstoren.
3. Reconstitueer de EV-pellet door 1 ml HBSA-Ca(-)-buffer toe te voegen aan elke buis en draai elke buis voor de tweede keer te ultracentrifugeren bij 100.000 × g gedurende 70 minuten bij 4 °C.
4. Zuig het supernatans op tot 20 μL zonder de EV-pellet te verstoren.
5. Reconstitueer de EV-pellet in 80 μL HBSA-Ca(-).

6. Meting van de activiteit van extracellulaire vesikelweefselfactoren

OPMERKING: EV-monsters moeten goed worden gepipetteerd en gewerveld om te mengen voordat ze aan putten worden toegevoegd. EDTA-dinatrium remt het vermogen van FXa om het chromogene substraat te splitsen. Daarom kan EDTA-dinatrium niet worden gebruikt als vervanging voor EDTA-tetranatrium in stap 6.7.

1. Voeg 40 μL van een EV-monster toe aan twee putjes van een plaat met 96 putjes.
2. Voeg 11 μl van een remmend antihumaan TF-IgG bij muizen [(36,4 μg/ml, eindconcentratie 7,8 μg/ml)] toe aan een putje van een EV-monster en 11 μl controlemuis-IgG [(36,4 μg/ml, eindconcentratie 7,8 μg/ml)] aan het andere putje.
3. Incubeer de plaat met 96 putjes gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Bereid tijdens de incubatietijd 50 μL/putje TF-standaarden (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 en 20 pg/ml) in tweevoud met behulp van gerelipideerde recombinant TF.
5. Bereid het factormengsel door 4 ml HBSA te mengen met calcium [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl₂, eindconcentratie 10 mM], 800 μL 900 nM FX in HBSA-Ca(+) (eindconcentratie: 146,4 nM) en 120 μL 200 nM FVIIa in HBSA-CA(+) (eindconcentratie: 4,8 nM).
6. Voeg 50 μl van de factormixoplossing toe aan elk putje, bedek de plaat met folie en incubeer gedurende 2 uur in een incubator bij 37 °C.
7. Stop na 2 uur de productie van FXa door 25 μL HBSA-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-buffer [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetranatrium, eindconcentratie 5 mM] toe te voegen en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
8. Reconstitueer het chromogene substraat dat door FXa wordt gesplitst tot 4 mM (voeg 8,7 ml gedestilleerd water toe aan een injectieflacon van 25 mg).
9. Voeg 25 μL van de chromogene substraatoplossing toe aan elk putje, bedek de plaat met folie en vervolgens met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen, en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
10. Verwijder na 15 minuten incubatie de luchtbellen met een naald of door centrifugeren bij 1.500 × g gedurende 1 minuut.
11. Lees de plaat af bij 405 nm met behulp van een plaatlezer met één mengsel voordat u gaat lezen.
12. Converteer de FXa-generatie van elk putje naar TF-activiteit met behulp van de standaardcurve die wordt gegenereerd met behulp van gerelipideerde recombinant TF.
13. Bereken TF-afhankelijke FXa-generatie (EVTF-activiteit) met behulp van vergelijking (1):
    TF-afhankelijke FXa-generatie (EVTF-activiteit [pg/ml]) = Totale FXa-generatie (controleer IgG-put) - TF-onafhankelijke FXa-generatie (anti-TF IgG-put) (Figuur 3) (1)

Resultaten

Een succesvol resultaat geeft een positieve controlewaarde van ≥0,5 pg/ml en een negatieve controlewaarde van <0,5 pg/ml. Het is het beste om een hoge LPS-responder te vinden met >1,0 pg/ml EVTF-activiteit voor een positieve controle. Het representatieve resultaat toont de EVTF-activiteit van EV's geïsoleerd uit plasma uit het volbloed van 11 gezonde donoren, met en zonder LPS-activering (Figuur 4). Zes van de elf donoren (donoren 2, 4, 5, 8, 10, 11) waren gemiddelde tot hoge LPS-responders,...

Discussie

Hier wordt het protocol van onze interne EVTF-activiteitstest gepresenteerd. Er zijn drie cruciale stappen in het protocol. Bij het reconstitueren van de EV-pellet is het belangrijk om op en neer te pipetten op de plaats van de EV-pellet, zelfs als deze niet zichtbaar is. Onvolledige reconstitutie van de EV-pellet zal resulteren in een vals-negatief of onderschatting van de EVTF-activiteitswaarden van de monsters. Ten tweede is het gebruik van HBSA-Ca(+) van cruciaal belang in protocolstap 6.5, omdat FXa-generatie niet k...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL tube voor 20.000 x g centrifuge	elk bedrijf	N/A	We gebruiken degene van Fisher Scientific (Catalogusnummer: 05-408-129).
1.5 mL buis voor ultracentrifuge	elk bedrijf	N/A	We gebruiken degene van Beckman Coulter (Catalogusnummer: 357448)
15 mL buis	elk bedrijf	N/A	We gebruiken degene van VWR (Catalogusnummer: 89039-666)
21 G x.75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Bloedopvangset met 12 in. slang en luer-adapter	BD	367281
96-well plate	elk bedrijf	N/A	We gebruiken degene van Globe Scientific (Catalogusnummer: 120338).
BD Vacutainer Citraatbuisjes	BD	363083
Bovine serumalbumine	Sigma Aldrich	A9418
Calciumchloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge voor 1.5 mL buis	elk bedrijf	N/A	We gebruiken de Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge voor 15 mL buis	elk bedrijf	N/A	We gebruiken de Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraazijnzuur tetranatriumzout dihydraat	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Humaan FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	De oplossing moet worden verdund met HBSA-Ca(+).
Humaan FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	De oplossing moet worden verdund met HBSA-Ca(+).
Remmende muis anti-menselijke weefselfactor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysacharide uit Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	Er zijn verschillende lipopolysachariden van verschillende E. coli. Verschillende lipopolysachariden hebben een verschillend potentieel om monocyten te activeren.
Muis IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	elk bedrijf	N/A	We gebruiken de SpectraMax i3x van Molecular Devices
Re-lipideerde recombinante weefselfactor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Natriumchloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55