Methodenartikel

Multiplex immunohistochemiekleuring voor in paraffine ingebed longkankerweefsel

DOI:

10.3791/65850

⸱

21 november 2023

 ,  ,  , 
1Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Center of Precision Medicine, West China Hospital, Sichuan University, 2Institute of Clinical Pathology, West China Hospital, Sichuan University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit experimentele protocol beschrijft en optimaliseert een multiplex immunohistochemie (IHC) kleuringsmethode, voornamelijk door de incubatieomstandigheden van eenkanaals antilichamen te optimaliseren en de instellingen van antilichamen en kanalen aan te passen om de problemen van autofluorescentie en kanaaloverspraak in longkankerweefsels van klinische oorsprong op te lossen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kwaadaardige tumorgerelateerde morbiditeit en mortaliteit over de hele wereld, en de complexe micro-omgeving van de tumor wordt beschouwd als de belangrijkste doodsoorzaak bij longkankerpatiënten. De complexiteit van de micro-omgeving van de tumor vereist effectieve methoden om cel-tot-celrelaties in tumorweefsels te begrijpen. De multiplex immunohistochemie (mIHC)-techniek is een belangrijk hulpmiddel geworden voor het afleiden van de relatie tussen de expressie van eiwitten stroomopwaarts en stroomafwaarts van signaalroutes in tumorweefsels en het ontwikkelen van klinische diagnoses en behandelplannen. mIHC is een multi-label immunofluorescentiekleuringsmethode op basis van Tyramine Signal Amplification (TSA)-technologie, die tegelijkertijd meerdere doelmoleculen op hetzelfde weefselsectiemonster kan detecteren om verschillende eiwitco-expressie en co-lokalisatieanalyse te bereiken. In dit experimentele protocol werden in paraffine ingebedde weefselsecties van plaveiselcelcarcinoom van klinische oorsprong onderworpen aan multiplex immunohistochemische kleuring. Door het experimentele protocol te optimaliseren, werd multiplex immunohistochemische kleuring van gelabelde doelcellen en eiwitten bereikt, waardoor het probleem van autofluorescentie en kanaaloverspraak in longweefsels werd opgelost. Bovendien wordt multiplex immunohistochemische kleuring veel gebruikt bij de experimentele validatie van tumorgerelateerde, high-throughput sequencing, waaronder single-cell sequencing, proteomics en weefselruimtesequencing, wat intuïtieve en visuele pathologievalidatieresultaten oplevert.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tyraminesignaalversterking (TSA), met een geschiedenis van meer dan 20 jaar, is een klasse van testtechnieken die mierikswortelperoxidase (HRP) gebruiken voor in-situ etikettering met hoge dichtheid van doelantigenen en wordt op grote schaal toegepast in enzymgekoppelde immunosorbenttests (ELISA's), in situ hybridisatie (ISH), immunohistochemie (IHC) en andere technieken voor de detectie van biologische antigenen, Aanzienlijke verbetering van de gevoeligheid van het gedetecteerde signaal1. Opaal polychromatische kleuring op basis van TSA-technologie is onlangs ontwikkeld en wordt veel gebruikt in verschillende onderzoeken 2,3,4,5. Traditionele immunofluorescentie (IF)-kleuring biedt onderzoekers een eenvoudig hulpmiddel voor de detectie en vergelijking van de verdeling van eiwitten in de cellen en weefsels van verschillende modelorganismen. Het is gebaseerd op antilichaam-/antigeenspecifieke binding en omvat directe en indirecte benaderingen6. Directe immunokleuring omvat het gebruik van een met fluorofoor geconjugeerd primair antilichaam tegen het betreffende antigeen, dat directe fluorescentiedetectie met behulp van een fluorescentiemicroscoop mogelijk maakt. De indirecte immunokleuringsbenadering omvat de toepassing van een fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam tegen het niet-geconjugeerde primaire antilichaam 6,7.

Traditionele, single-label, immunofluorescentiekleuringsmethoden kunnen slechts één, twee of in sommige gevallen drie antigenen in weefsels kleuren, wat een belangrijke beperking is bij het ontginnen van de rijke informatie in weefselsecties. De interpretatie van kwantitatieve resultaten is vaak afhankelijk van visuele waarneming en nauwkeurige kwantificering door beeldvormingssoftware, zoals ImageJ. Er zijn technische beperkingen, zoals beperking van antilichaamsoorten, zwakke fluorescerende labelsignalen en overlapping van fluorescerende kleurstofkleuren (tabel 1). De Opal multiplex IHC (mIHC)-techniek is gebaseerd op TSA-afleiding, die multiplexkleuring en differentiële etikettering van meer dan 7-9 antigenen op hetzelfde weefselgedeelte mogelijk maakt, zonder beperking van de oorsprong van het primaire antilichaam, maar vereist een hoge specificiteit van het overeenkomstige antilichaam tegen het antigeen. De kleuringsprocedure is vergelijkbaar met die van normale immunofluorescentiekleuring, met uitzondering van twee verschillen: bij elke kleuringsronde wordt slechts één antilichaam gebruikt en wordt een antilichaamelutiestap toegevoegd. Antilichamen die door niet-covalente bindingen aan het antigeen zijn gebonden, kunnen worden verwijderd door microgolfelutie, maar het TSA-fluorescerende signaal dat door covalente bindingen aan het oppervlak van het antigeen is gebonden, blijft behouden.

Geactiveerde tyramine (T)-moleculen die met de kleurstof zijn gelabeld, zijn sterk verrijkt bij het doelantigeen, waardoor het fluorescerende signaal efficiënt kan worden versterkt. Dit maakt directe etikettering van het antigeen mogelijk zonder interferentie van antilichamen, en vervolgens kan meerkleurige etikettering worden bereikt na meerdere kleuringscycli 8,9,10 (Figuur 1). Hoewel deze technologie betrouwbare en nauwkeurige beelden produceert voor de studie van ziekten, kan het creëren van een bruikbare multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) kleuringsstrategie tijdrovend en veeleisend zijn vanwege de noodzaak van uitgebreide optimalisatie en ontwerp. Daarom is dit multiplex paneelprotocol geoptimaliseerd in een geautomatiseerde IHC-stainer met een kortere kleurtijd dan die van het handmatige protocol. Deze aanpak kan door elke onderzoeker direct worden toegepast en aangepast voor immuno-oncologische studies op menselijke formaline-gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters11. Bovendien zullen de methoden voor preparaatheid van objectglaasjes, optimalisatie van antilichamen en multiplexontwerp nuttig zijn bij het verkrijgen van robuuste beelden die nauwkeurige cellulaire interacties in situ weergeven en om de optimalisatieperiode voor handmatige analyse te verkorten12.

De mfIHC omvat voornamelijk beeldacquisitie en data-analyse. In termen van beeldacquisitie moeten meerkleurig gelabelde complex-gekleurde monsters worden gedetecteerd met professionele spectrale beeldvormingsapparatuur om de verschillende gemengde kleursignalen te identificeren en hoge signaal-ruisbeelden te verkrijgen zonder interferentie van autofluorescentie van weefsels. De huidige apparatuur voor spectrale beeldvorming omvat voornamelijk spectrale confocale microscopen en multispectrale weefselbeeldvormingssystemen. Het multispectrale weefselbeeldvormingssysteem is een professioneel beeldvormingssysteem dat is ontworpen voor de kwantitatieve analyse van weefselsecties, en het belangrijkste kenmerk is de verwerving van spectrale beeldinformatie, die zowel morfologische structuur als optische mapping-informatie van biologische weefselmonsters biedt13,14. Elke pixel in het spectrale beeld bevat een volledige spectrale curve en elke kleurstof (inclusief autofluorescentie) heeft het bijbehorende karakteristieke spectrum, waardoor de volledige registratie en nauwkeurige identificatie van gemengde en overlappende multilabel-signalen mogelijk is.

In termen van data-analyse zijn veelkleurig gelabelde monsters uiterst complex vanwege de morfologische structuur en samenstellende cellen van de weefselmonsters. Gewone software kan niet automatisch verschillende weefseltypes identificeren. Daarom wordt intelligente kwantitatieve weefselanalysesoftware gebruikt voor kwantitatieve analyse van antigeenexpressie in specifieke regio's 15,16,17,18.

Bovenal heeft multilabel immunofluorescentiekleuring gefuseerd met multispectrale beeldvorming en kwantitatieve pathologie-analysetechnologie de voordelen van een groot aantal detectiedoelen, effectieve kleuring en nauwkeurige analyse, en kan daarom de nauwkeurigheid van histomorfologische analyse aanzienlijk verbeteren, de ruimtelijke relatie tussen eiwitten met resolutie op cellulair niveau onthullen en helpen om rijkere en betrouwbaardere informatie uit weefselsectiemonsterste halen 19 (Tabel 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol is goedgekeurd door de richtlijnen van de ethische commissie van het West China Hospital, Sichuan University, China. De longkankerweefselmonsters werden verkregen tijdens een operatie in het Centrum voor Longkanker in het West China Hospital en van elke patiënt werd geïnformeerde toestemming verkregen.

1. Voorbereiding van de weefselsectie

  1. FFPE-voorbereiding
    1. Dompel klinische weefsels gedurende meer dan 72 uur onder in een neutrale formaline-oplossing.
    2. Voltooi het proces van het uitdrogen van de weefsels met xyleen en gesorteerde alcoholische oplossingen20.
    3. Voer handmatige paraffine-inbedding en weefselsecties uit bij een sectiedikte van 4 μm. Gebruik adhesiemicroscoopglaasjes om ervoor te zorgen dat de plakjes weefsel er niet uit vallen.
    4. Bak de glaasjes 2 uur in een oven op 65 °C om ervoor te zorgen dat het zakdoekje en de glaasjes droog zijn. Bewaar in een glaasjesdoos bij kamertemperatuur.
  2. Voorbehandeling van weefselsecties
    1. Behandel de weefselglaasjes gedurende 5 minuten in een oven bij 65 °C en dompel ze vervolgens achtereenvolgens gedurende 2 x 15 minuten onder in xyleenoplossingen, 2 x 15 minuten watervrije ethanoloplossingen, 10 minuten 90% ethanoloplossing, 10 minuten 85% ethanoloplossing, 10 minuten 80% ethanoloplossing en 10 minuten 75% ethanoloplossing, gevolgd door het wassen van de glaasjes met gesteriliseerd water gedurende 3 x 1 min.
      OPMERKING: Deze experimentele techniek kan alleen worden gebruikt voor FFPE-weefsel, niet voor bevroren of vers weefsel, omdat het meervoudige antigeenherstelproces bij hoge temperatuur ervoor zorgt dat het weefsel van het objectglaasje valt.

2. Optimalisatie van primair antilichaam

OPMERKING: Conventionele IHC-experimenten werden gebruikt om de incubatieomstandigheden voor individuele antilichamen te bepalen, voornamelijk inclusief antilichaamconcentratie en antigeenherstelcondities. Raadpleeg de voorwaarden in de gebruiksaanwijzing van het antilichaam.

  1. Gebruik een antilichaamconcentratie die iets hoger is dan het aanbevolen concentratiebereik en tussenliggende waarden.
  2. Optimaliseer de bufferroutines voor het ophalen van antigeen PH6 en PH9 op basis van de locatie van eiwitexpressie. Gebruik PH9 voor eiwitten die tot expressie komen in de kern en gebruik routine (PH6 of PH9) voor andere eiwitten.

3. mIHC-kleuringsmethode

OPMERKING: Opaal mIHC-kleuring is een van de beschikbare mIHC-methoden. In dit experimentele 5-kleurenprotocol, aangezien elk weefselmonster moet worden gekleurd met vier antilichamen, zijn vier primaire antilichaamincubaties, secundaire antilichaamincubaties en TSA-signaalamplificatie chromogene incubaties nodig, evenals vijf antigeenrestauraties. Ten slotte worden 4'6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-kleuring en antifluorescerende barstmiddelafdichting uitgevoerd.

  1. Bereiding van het belangrijkste reagens
    OPMERKING: Bepaal de hoeveelheid reagens die moet worden toegevoegd op basis van de grootte van de weefselglaasjes. Gebruik voldoende volume om het weefselgedeelte volledig te bedekken (over het algemeen 50-150 μL per objectglaasje). De werkoplossingen die nodig zijn voor het experiment worden als volgt voorbereid:
    1. Wasbuffer werkoplossing: 20x wasbuffer verdunnen op 1:20 met dubbel gedestilleerd water, en bewaren bij kamertemperatuur.
    2. PH6 buffer werkoplossing: Verdun 100x PH6 buffer op 1:100 met dubbel gedestilleerd water. Voorbereiden voor gebruik en bewaren bij kamertemperatuur.
    3. PH9 buffer werkoplossing: Verdun 50x PH9 buffer op 1:50 met dubbel gedestilleerd water. Voorbereiden voor gebruik en bewaren bij kamertemperatuur.
    4. Polymeer HRP: Bereid deze kant-en-klare oplossing alleen voor primaire antilichamen van konijnen- en muizenoorsprong.
    5. Fluorofoor werkoplossing: Reconstitueer elk fluorofoorpoeder (behalve fluorofoor 780) in 75 μL DMSO. Verdun voor elke procedure de fluorofoor in 1x amplificatieverdunningsmiddel op 1:100. Gooi elk ongebruikt deel van de fluorofoor-werkoplossing weg.
    6. Fluorofoor 780 werkoplossing: Reconstitueer TSA-DIG in 75 μL DMSO en het fluorofoorpoeder 780 in 300 μL dubbel gedestilleerd water. Verdun vóór de procedure TSA-DIG in 1x amplificatieverdunningsmiddel bij 1:100 en verdun fluorofoor 780 met Ab-verdunningsmiddel bij 1:25.
    7. DAPI-werkoplossing: Verdun de DAPI-oplossing bij 1:50 met dubbel gedestilleerd water of PBS. Voor gebruik voorbereiden en niet langer dan 48 uur bij 4 °C bewaren.
      NOTITIE. Was de objectglaasjes alleen met dubbel gedestilleerd water en vers bereide wasbuffer-werkoplossing tijdens dit multilabel-fluorescentiekleuringsexperiment. Weefselsecties mogen niet in contact komen met leidingwater; Verontreinigingen in het leidingwater kunnen zich hechten aan de weefselsecties en autofluorescentie veroorzaken. Houd de monsters tijdens het experiment uit de buurt van licht.
  2. Antigeen ophalen
    1. Plaats de objectglaasjes in een kleur- en reparatiedoos en vul deze met PH6 of PH9 bufferwerkoplossing, dek af met het deksel en verwarm in een magnetron gedurende 2 x 8 minuten op 100% vermogen.
      NOTITIE: Voeg tijdens het verwarmingsproces dubbel gedestilleerd water toe aan de reparatiedoos om overmatige verdamping te voorkomen waardoor de plakjes kunnen uitdrogen.
    2. Laat de glaasjes afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat (30-60 min).
    3. Was de glaasjes 3 x 2 min met dubbel gedestilleerd water. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om het weefselgedeelte op het objectglaasje te omcirkelen.
  3. Blokkeren
    1. Dompel weefselsecties onder in wasbuffer, dek af met blokkeeroplossing en incubeer objectglaasjes gedurende 10 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.
  4. Primaire incubatie van antilichamen
    1. Verwijder de blokkerende oplossing van de objectglaasjes en bedek de weefselsecties met de primaire antilichaamwerkoplossing. Incubeer de objectglaasjes in een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij 37 °C in de incubator of een nacht bij 4 °C in de koelkast.
      NOTITIE: Laat de glaasjes niet uitdrogen.
  5. Introductie van polymeer HRP
    1. Was de objectglaasjes in de wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 min. Voeg polymeer HRP direct druppelsgewijs toe aan weefselsecties en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      NOTITIE: Voor objectglaasjes die in de koelkast worden bewaard, bewaar ze ongeveer 30 minuten op kamertemperatuur voordat u ze wast om het primaire antilichaam te verwijderen.
  6. Genereren van tyraminesignaalversterking (TSA)
    1. Was het glaasje met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 minuten, voeg fluorofoor werkoplossing direct druppelsgewijs toe aan de weefselsecties en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was het glaasje met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 min.
  7. Speciale procedure voor fluorofoor 780
    OPMERKING: Fluorofoor 780 is zwak en wordt routinematig als laatste geplaatst in het kleurafstemmingsschema van het hele experiment. Fluorofoor 780 wordt normaal gesproken niet gebruikt in dit experimentele protocol, maar vanwege zijn specificiteit worden de experimentele stappen vermeld.
    1. Introductie van TSA-DIG
      1. Was het glaasje met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 minuten, voeg TSA-Drg-werkoplossing druppelsgewijs toe aan de weefselsecties en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Microgolf-behandeling
      1. Was de objectglaasjes met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 min.
      2. Plaats de glaasjes in een kleur- en reparatiedoos, vul deze met reparatieoplossing, dek af met het deksel en verwarm in een magnetron gedurende 2 x 8 minuten op 100% vermogen. Laat de glaasjes afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat (30-60 min).
      3. Was de glijbanen 3 x 2 min met dubbel gedestilleerd water.
    3. Fluorofoor 780 signaalgeneratie
      1. Dompel de secties onder in een wasbuffer, bedek ze met fluorofoor 780 werkoplossing en incubeer de objectglaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
      2. Was de objectglaasjes met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 min.
        OPMERKING: Voer na deze stap GEEN microgolfbehandeling uit.
    4. Gebruik fluorofoor 780 als laatste stap van de gehele workflow en kleur vervolgens kernen rechtstreeks met de DAPI-werkoplossing.
      NOTITIE: Sla stap 3.7 over als u geen fluorofoor 780 gebruikt.
  8. Microgolf-behandeling
    OPMERKING: Deze microgolfstap stript het primaire-secundaire HRP-complex en legt antigenen opnieuw bloot, waardoor de introductie van het volgende primaire antilichaam mogelijk wordt.
    1. Plaats de objectglaasjes in een kleur- en reparatiedoos, vul deze met PH6 of PH9 bufferwerkoplossing, dek af met het deksel en verwarm in een magnetron gedurende 2 x 8 minuten op 100% vermogen.
    2. Laat de glaasjes afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat (30-60 min). Was de glaasjes 3 x 1 min met dubbel gedestilleerd water.
    3. Dompel de glaasjes gedurende 2 minuten in de wasbuffer werkoplossing. Voer de volgende incubatie van antilichamen uit.
  9. Volgende incubatie van antilichamen
    1. Herhaal stap 3.2-3.8 (behalve stap 3.7).
  10. Celnucleaire kleuring en weefselafdichting
    1. Bedek de weefselsecties met de DAPI-werkoplossing en incubeer de objectglaasjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Was de glijbanen 3 x 2 min met dubbel gedestilleerd water.
    2. Verwijder waterdruppels van de objectglaasjes, voeg 10-20 μL antifluorescentiebluser toe aan elk glaasje en sluit de glaasjes af met een microscoopafdekglas.
    3. Bewaar de afgewerkte objectglaasjes langer dan 1 maand bij 4 °C, beschermd tegen licht.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u geen luchtbellen krijgt.

4. Stel de negatieve controle in

  1. Verwerk de negatieve controleglaasjes zoals de weefselbevattende objectglaasjes, maar zonder toevoeging van reagentia zoals primaire antilichamen, secundaire antilichamen, TSA-reagentia en DAPI, die worden gebruikt om weefselautofluorescentie te verwijderen bij het scannen van de film.

5. Volautomatisch scannen van weefselglaasjes

OPMERKING: De apparatuur die wordt gebruikt voor spectrale beeldvorming is een volledig geautomatiseerde multispectrale weefselkwantificeringsanalysator, en beeldvormings- en analysevisualisatie van 5-kleurenobjectglaasjes kan worden uitgevoerd met behulp van het systeem waarnaar wordt verwezen (zie Materiaaltabel). Het systeem maakt gebruik van multispectrale beeldvorming voor het kwantitatief ontmengen van meerdere fluoroforen en weefselautofluorescentie.

  1. Stel handmatig de belichtingstijd en het scanprogramma in voor elk fluorescentiekanaal en bevestig dat het instrument de volautomatische belichting en het scannen van de weefselglaasjes heeft voltooid.
    NOTITIE: Het oppervlak van de dia moet schoon en vrij van waterfilm zijn. Wees voorzichtig met de hoeveelheid sealer: te veel zal ervoor zorgen dat het dekglaasje wegglijdt en het instrument een fout meldt.

6. Analyse van fluorescentie

  1. Dubbelklik op de software (zie de Materiaaltabel), sleep het meerkleurige fluorescentiebeeldbestand dat u van de originele scan hebt verkregen naar de software en stel het afbeeldingstype in op fluorescentie.
  2. Klik op de knop Helderheid en contrast en controleer de kanalen op het paneel. Klik buiten en vervolgens op het kanaal om het gewenste fluorescentiekanaal te selecteren. Sleep de Min-weergave en de Max-weergave om de helderheid en het contrast van elk kanaal aan te passen.
  3. Bepaal na analyse de weergave die moet worden opgeslagen, klik op Diaoverzicht weergeven en Cursorlocatie weergeven om deze twee inhoud te verwijderen, de schaalbalk behouden en klik op Bestand | Momentopname exporteren | Huidige viewerinhoud om een png-bestand te exporteren.
    OPMERKING: Elk fluorescentiekanaal en een samengevoegd cijfer moeten worden geëxporteerd voor toekomstige analyse.
  4. Gebruik voor verdere analyse van de positiviteit van doelcellen celidentificatie- en segmentatiesoftware21 (zie Materiaaltabel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben het matchingschema van CD8 primaire antilichamen en fluoroforen geoptimaliseerd. Beide sets fluorescentieresultaten kwamen overeen met exact dezelfde incubatieomstandigheden van antilichamen in de experimentele groep, behalve de verandering in de antilichaam-gematchte fluorofoor. Zoals te zien is in figuur 2, was er een significant verschil in de kanaalmatching van CD8+ T-cellen met fluorofoor 480 en fluorofoor 690. Het kanaal met fluorofoor 690 vertoont een extreem sterke fluoresc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mIHC is een onmisbare experimentele techniek op het gebied van wetenschappelijk onderzoek voor de kwantitatieve en ruimtelijke analyse van meerdere eiwitmarkers op het niveau van één cel in een enkele weefselsectie, die intuïtieve en nauwkeurige gegevens oplevert voor de studie van ziektepathologie door zich te concentreren op de gedetailleerde weefselstructuur en cellulaire interacties in de context van het oorspronkelijke weefsel. De wijdverbreide acceptatie van mIHC-technologie vereist geoptimaliseerde en effectieve e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag de leden van het Clinical Pathology Research Institute West China Hospital erkennen, die technische begeleiding hebben bijgedragen voor hoogwaardige multiplex immunofluorescentie en IHC-verwerking. Dit protocol werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82200078).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia
Anti-CD8Abcamab237709Primair antilichaam, 1/100, PH9
Anti-CD68Abcamab955Primair antilichaam, 1/300, PH9
Anti-CK5/6MilliporeMAB1620Primair antilichaam, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1GeneTexGTX112346Primair antilichaam, 1/300, PH6
Dierlijk nonimmuun serumMXB BiotechnologiesSP KIT-B3Antigeen blokkering
Fluormount-GSouthernBiotech0100-01Anti-fluorescente burst
Opal PolarisTM 7-Kleurs Handmatig IHC KitAkoyaNEL861001KTOpal mIHC Kleuring
WasbufferDakoK8000/K8002/K8007/K8023Het wassen van de weefsel slides
Software
HALOintelligente kwantitatieve weefselanalyse software, betaalde software
inFormintelligente kwantitatieve weefselanalyse software, betaalde software
PerkinElmer Vectramultispectrale weefselbeeldvormingssystemen, volledig automatisch scannen van weefsel slides.
QuPath 0.3.2intelligente kwantitatieve weefselanalyse software, open source software, gebruikt in dit experiment.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
  2. Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).
  3. Nghiem, P. T., et al. PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  4. Zaretsky, J. M., et al. Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma. The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).
  5. Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289(2022).
  6. Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count. Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).
  7. Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development. Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).
  8. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  9. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  10. Meany, D. L., Hackler, L. Jr, Zhang, H., Chan, D. W. Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).
  11. Surace, M., et al. Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390(2019).
  12. Lazarus, J., et al. Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915(2019).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Mansfield, J. R. Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).
  15. Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
  16. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  17. Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).
  18. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 16878(2017).
  19. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  20. Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System. Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).
  21. Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031(2021).
  22. Mori, H., et al. Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).
  23. Mansfield, J. R. Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets. Methods. 52 (4), 271-280 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In paraffine ingebed weefseltumoromgevingimmunofluorescentiekleuringtyramine signaalversterkingantigeenherstelkanaalkruisspraakeiwitcolocalisatieCD8 positieve T cellen

Gerelateerde artikelen