Dit protocol schetst de procedure voor het induceren van acne-ontsteking in de huid van ratten met oliezuur en Cutibacterium acnes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een rattenmodel van samengestelde acne
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Acne vulgaris is een veel voorkomende chronische huidaandoening die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van comedonen, papels en puisten op het gezicht, de nek en de borst. Om de ontsteking van acne vulgaris te simuleren, beschrijft dit protocol een aanpak om een samengesteld acne-knaagdiermodel op te zetten door acne-ontsteking in rattenoren te induceren met behulp van oliezuur en Cutibacterium acnes (C. acnes). Ratten werden willekeurig verdeeld in vier groepen: de normale controlegroep (NC), oren behandeld met oliezuurgroep (OA), oren behandeld met C. acnes-groep (C. acnes), oren behandeld met oliezuur en C. acnes (OA + C. acnes). Om overmatige talgproductie na te bootsen, werd oliezuur gedurende 25 dagen op de oren van ratten gesmeerd in de groepen OA en OA + C. acnes .
Van dag 21 tot 25 werd C. acnes-suspensie intradermaal geïnjecteerd in de oren van ratten in de groepen C. acnes en OA + C. acnes om de acne-ontsteking te verergeren. De oordikte werd wekelijks gemeten als maatstaf voor de ernst van de ontsteking. Grove observatie, hematoxyline- en eosinekleuring en immunohistochemie (IHC) werden uitgevoerd en de resultaten toonden aan dat de oren van de OA-groep en de OA + C. acnes-groep verdikt en verhard waren, vergezeld van erytheem en de aanwezigheid van comedonen. Daarnaast werden papels waargenomen in de groepen C. acnes en OA + C. acnes . De histopathologie vertoonde hyperkeratinisatie en uitgebreid infundibulum van de haarzakjes in OA en OA + C. acnes groepen. Infiltratie van ontstekingscellen en abcessen werd gevonden in de dermis van C. acnes en OA + C. acnes groepen. De IHC-resultaten bevestigden verhoogde niveaus van tumornecrosefactor (TNF)-α in de dermis van C. acnes - en OA + C. acnes-groepen . Alle bovenstaande resultaten duidden gezamenlijk op de succesvolle oprichting van het samengestelde acne knaagdiermodel.
Inleiding
Acne vulgaris is een veel voorkomende chronische huidziekte die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van comedonen, papels en puisten op het gezicht, de nek en de borst, die in ernstige gevallen kunnen evolueren naar knobbeltjes, cysten enpermanente littekens. Epidemiologische studies melden dat acne 9,4% van de wereldbevolking treft, terwijl de daaruit voortvloeiende symptomen ernstige fysieke en psychosociale uitdagingen met zich meebrengen 2,3.
De pathogenese van acne is multifactorieel, waaronder vier kritieke processen: overmatige talgproductie, vorming van comedonen, folliculaire kolonisatie door huidmicrobiota en de afgifte van ontstekingsmediatoren rond de talgkliereenheid 4,5. Verhoogde talgafscheiding, resulterend in de ophoping van overtollige onverzadigde vrije vetzuren (UFFA's), draagt bij aan de abnormale reproductie van huidmicrobiota, waaronder Cutibacterium acnes, zoals aangetoond in genomische studies6. Ondertussen breekt de huidmicrobiota de talg af en verhoogt de concentratie van UFFA's, wat leidt tot een vicieuze cirkel7. Bovendien veroorzaken overtollige UFFA's hyperkeratinisatie in de haarzakjes, wat op zijn beurt acne veroorzaakt8. Huidmicrobiota en verhoogd talg activeren beide Toll-like receptoren (TLR's) om meerdere pro-inflammatoire cytokines te produceren, zoals interleukine (IL)-1 en TNF-α 9,10. Deze cascade van ontstekingen, in combinatie met verhoogde talg en microbiële overgroei, culmineert in uitgesproken hyperkeratose van de haarfollikel en het ontstaan van acne11.
De snelle ontwikkeling op het gebied van acneonderzoek en gerelateerde klinische vereisten heeft geleid tot de creatie van een reeks diermodellen van acne-ontsteking op het oor van ratten, de ruggen van ratten of muizen en konijnenoor 12,13,14,15. De methoden omvatten intradermale injectie van C. acnes, het aanbrengen van oliën op de huid om de abnormale afscheiding van de talgklieren en hyperkeratinisatie te simuleren, of een combinatie van beide om de huidontsteking te versnellen om acne te vormen 16,17,18,19. Het gebruik en de dosering van chemische middelen en biologische agentia variëren echter tussen eerdere studies, wat onderzoekers die van plan zijn een geschikt acnemodel op te stellen, in verwarring kan brengen. Deze studie had tot doel een eenvoudig te bedienen en effectieve methode vast te stellen om een samengesteld acne-knaagdiermodel te vormen en een modelreferentie te bieden voor onderzoekers die acne vulgaris bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol heeft ethische goedkeuring gekregen van de Beijing University of Chinese Medicine (nr. 2023033103-1183). Twaalf mannelijke Sprague-Dawley-ratten (gewicht, 208 g ± 5 g) werden in dit protocol gebruikt en verdeeld in vier groepen: NC-groep (n = 3), OA-groep (n = 3), C. acnes-groep (n = 3) en OA + C. acnes-groep (n = 3).
1. Ontwikkeling van het acnemodel
- Meet en registreer de dikte van rattenoren met behulp van een elektronische schuifmaat (zie Materiaaltabel) voordat u gaat modelleren.
- Plaats de buitenkaak van de elektronische schuifmaat in het midden van de buitenrand van het oor en steek deze uit in de gehoorgang. Noteer de dikte van 2/3 punten en de dikte van 1/2 punt langs de lijn. Meet elk punt 3x en bereken de gemiddelde waarden van de dikte van twee punten die als de dikte van het oor moeten worden beschouwd.
- Kantel de kop van de rat naar één kant, maak het oor naar boven gericht en breng 50 μl oliezuur (zie materiaaltabel) gelijkmatig aan op de ventrale en dorsale zijden van het oor, eenmaal per dag, gedurende 25 dagen.
- Van dag 21 tot dag 25, dagelijks voorafgaand aan het aanbrengen van oliezuur, de ratten verdoven met 4% isofluraan en vervolgens 50 μL 1 ×10 7 CFU C. acnes suspensie (zie Materiaaltabel) intradermaal in het ventrale oppervlak van het oor injecteren met behulp van een spuit van 1 ml uitgerust met een naald van 34 G of 36 G (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u bloedvaten in het oor vermijdt wanneer u intradermaal injecteert. Een microspuit met een naald van 34 G of 36 G (zie Materiaaltabel) is vereist. Om een goede intradermale injectie te garanderen, moet de naald onder een hoek van 10 tot 15 graden worden doorboord, met een diepte van ongeveer 1 mm. - Meet en noteer op dag 25 de dikte van de oren, zoals beschreven in stap 1.1.
OPMERKING: De OA-groep werd alleen ingesmeerd met oliezuur zoals beschreven in stap 1.2 en geïnjecteerd met zoutoplossing van de 21e tot de 25e dag. De C. acnes-groep werd alleen intradermaal geïnjecteerd met C. acnes-suspensie , zoals beschreven in stap 1.3. De OA + C. acnes groep werd behandeld met oliezuur en C. acnes suspensie, zoals beschreven in stap 1.2 en 1.3.
2. Weefselverzameling en -analyse
- Op dag 26, nadat de ratten op humane wijze zijn geëuthanaseerd met behulp van een institutioneel goedgekeurde methode, boort u een vaste maat op bilaterale oren met een ringboor van 8 mm.
- Dompel de oorweefsels gedurende 24 uur onder in 4% paraformaldehyde, gevolgd door paraffine-inbedding en in plakjes van 5 μm dik voor hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring20. Observeer de secties onder een lichtmicroscoop en noteer de pathologische veranderingen voor vervolgevaluatie door een patholoog. Ken scores toe aan de pathologische veranderingen volgens Tabel 1 (zie ook Figuur 1).
- Deparaffineer, rehydrateer en verwarm de secties voor het ophalen van antigeen. Inactiveer endogene peroxidasen door te incuberen met 0,3% H2O2 in methanol gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de secties met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en incubeer ze vervolgens met 3% BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de coupes met TNF-α monoklonaal antilichaam (verdunning 1:800) (zie materiaaltabel) bij 4 °C gedurende een nacht.
- Was de secties opnieuw met PBS en incubeer met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (zie Materiaaltabel) gedurende 50 minuten.
- Breng na nog een PBS-wasbeurt het 3,3'-diaminobenzidine (DAB)-mengsel aan op de objectglaasjes en controleer het kleuringsproces onder een microscoop, waarbij de reactie met PBS wordt gestopt wanneer de gewenste intensiteit is bereikt.
- Bestkleur de secties gedurende 1 minuut met Meyer's hematoxyline, spoel ze af met stromend water en dehydrateer en monteer de secties. Observeer de secties onder een microscoop en noteer de pathologische veranderingen voor vervolgevaluatie door een patholoog.
3. Statistische analyse
- Statistische analyse uitvoeren.
- Presenteer gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie. Krijg toegang tot de normaliteit van alle gegevens met behulp van de Shapro-Wilke-test. Als het een normale verdeling volgt, gebruik dan eenrichtings-ANOVA om significante verschillen te beoordelen. Voor niet-normaal verdeelde gegevens past u de Kruskal-Wallis-test toe, gevolgd door de meervoudige vergelijkingen van Dunn. Een p-waarde kleiner dan 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dikte en uiterlijk van de huid
Van dag 7 tot dag 21 waren de oren in de OA-groep en de OA + C. acnes-groep significant dikker dan die van de NC- en C. acnes-groepen . Op dag 25 waren de oren in de OA-groep, de C. acnes-groep en de OA + C. acnes-groep significant dikker dan die van de NC-groep (p < 0,05). De gemiddelde dikte van de oren tijdens het experiment is weergegeven in figuur 2 en
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Omdat de methodologie en evaluatiecriteria voor een acnemodel niet duidelijk waren, was dit protocol bedoeld om een referentie te bieden voor onderzoekers die acne bestuderen. Vanwege het kleine formaat van het muizenoor en de interferentie veroorzaakt door groeiend haar op de rug, het gebruik van ontharingscrème en een scheerapparaat, kan het oor van de rat een beter alternatief zijn om een knaagdiermodel van acne vast te stellen. We hadden geprobeerd het acnemodel op de achterhuid van ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de National Nature Science Foundation of China (nr. 81974572 en nr. 82274523) en de Beijing University of Chinese Medicine (nr. 202310026002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anaero-indicator | Mitsubishi, Japan | C-22 | |
| AnaeroPack | Mitsubishi, Japan | C-11, C-41 | |
| Columbia blood agar plate | BeNa Cuture Collection, China | BNCC330605 | |
| Constant temperature incubator | SHANGCHENG, China | 303-0 | |
| Cotton swab | HYNAUT, China | _ | |
| Cutibacterium acnes | BeNa Cuture Collection, China | BNCC330605 | |
| Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse | DAKO, Denmark | K5007 | |
| disposable sterile injection needle | Zhejiang Oujian Medical Apparatus, China | _ | |
| Electronic scale | JINXUAN, China | A017 | |
| Electronic vernier caliper | Deli, China | DL90150 | |
| Oleic acid (Analytical reagent, AR) | Fangzheng, China | _ | |
| Sodium chloride injection | CR Double CRANE, China | Y2212241 | |
| SPSS Statistics | IBM, USA | 26.0 | |
| sterile hypodermic syringes | Shandong weigao group medical polymer, China | _ | |
| TNF Alpha Monoclonal antibody | Proteintech Group,int, USA | 60291-1-lg |
Referenties
- Cooper, A. J., Harris, V. R. Modern management of acne. The Medical Journal of Australia. 206 (1), 41-45 (2017).
- Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), London, England. 2163-2196 (2012).
- Layton, A. M., Thiboutot, D., Tan, J. Reviewing the global burden of acne: how could we improve care to reduce the burden. The British Journal of Dermatology. 184 (2), 219-225 (2021).
- Hazarika, N. Acne vulgaris: new evidence in pathogenesis and future modalities of treatment. Journal of Dermatological Treatment. 32 (3), 277-285 (2021).
- Das, S., Reynolds, R. V. Recent advances in acne pathogenesis: implications for therapy. American Journal of Clinical Dermatology. 15 (6), 479-488 (2014).
- Dréno, B., et al. Cutibacterium acnes (Propionibacterium acnes) and acne vulgaris: a brief look at the latest updates. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology: JEADV. 32, Suppl 2 5-14 (2018).
- Marples, R. R., Downing, D. T., Kligman, A. M. Control of free fatty acids in human surface lipids by Corynebacterium acnes. The Journal of Investigative Dermatology. 56 (2), 127-131 (1971).
- Katsuta, Y., Iida, T., Hasegawa, K., Inomata, S., Denda, M. Function of oleic acid on epidermal barrier and calcium influx into keratinocytes is associated with N-methyl D-aspartate-type glutamate receptors. The British Journal of Dermatology. 160 (1), 69-74 (2009).
- Kurokawa, I., et al. New developments in our understanding of acne pathogenesis and treatment. Experimental Dermatology. 18 (10), 821-832 (2009).
- Clayton, R. W., et al. Homeostasis of the sebaceous gland and mechanisms of acne pathogenesis. The British Journal of Dermatology. 181 (4), 677-690 (2019).
- Cong, T. X., et al. From pathogenesis of acne vulgaris to anti-acne agents. Archives of dermatological research. 311 (5), 337-349 (2019).
- Ji, J., et al. Analgesic and anti-inflammatory effects and mechanism of action of borneol on photodynamic therapy of acne. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103329(2020).
- Ou-Yang, X. L., et al. Nontargeted metabolomics to characterize the effects of isotretinoin on skin metabolism in rabbit with acne. Frontiers in Pharmacology. 13, 963472(2022).
- Zhu, Z., et al. Skin microbiome reconstruction and lipid metabolism profile alteration reveal the treatment mechanism of Cryptotanshinone in the acne rat. Phytomedicine. 101, 154101(2022).
- Jang, Y. H., et al. HR-1 mice: A new inflammatory acne mouse model. Annals of Dermatology. 27 (3), 257-264 (2015).
- De Young, L. M., Young, J. M., Ballaron, S. J., Spires, D. A., Puhvel, S. M. Intradermal injection of Propionibacterium acnes: a model of inflammation relevant to acne. The Journal of Investigative Dermatology. 83 (5), 394-398 (1984).
- Chen, T., et al. A skin lipidomics study reveals the therapeutic effects of Tanshinones in a rat model of acne. Frontiers in Pharmacology. 12, 675659(2021).
- Cao, J., Xu, M., Zhu, L., Xiao, S. Viaminate ameliorates Propionibacterium acnes-induced acne via inhibition of the TLR2/NF-κB and MAPK pathways in rats. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 396 (7), 1487-1500 (2023).
- Kolar, S. L., et al. Propionibacterium acnes-induced immunopathology correlates with health and disease association. JCI insight. 4 (5), e124687(2019).
- Zhong, C., et al. Inhibition of protein glycosylation is a novel pro-angiogenic strategy that acts via activation of stress pathways. Nature Communications. 11 (1), 6330(2020).
- O'Neill, A. M., Gallo, R. L. Host-microbiome interactions and recent progress into understanding the biology of acne vulgaris. Microbiome. 6 (1), 177(2018).
- Moradi Tuchayi, S., et al. Acne vulgaris. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15029(2015).
- American Academy of Dermatology. American Academy of Dermatology invitational symposium on comedogenicity. Journal of the American Academy of Dermatology. 20 (2), Pt 1 272-277 (1989).
- Katsambas, A. D., Cunliffe, W. J., Zoubolis, C. C. Clinical aspects of acne vulgaris. Pathogenesis and treatment of acne and rosacea. Zouboulis, C. C., Katsambas, A. D., Kligman, A. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 213-221 (2014).
- Williams, H. C., Dellavalle, R. P., Garner, S. Acne vulgaris. Lancet. 379 (9813), London, England. 361-372 (2012).
- Rocha, M. A., Bagatin, E. Skin barrier and microbiome in acne. Archives of Dermatological Research. 310 (3), 181-185 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
