Hier presenteren we een methode voor het bestuderen van de winterslaap van coloradokever onder de natuurlijke omstandigheden van de gematigde zone, evenals een techniek voor het verzamelen van kevers in de winter. Deze methode maakt het mogelijk om in elk stadium van de winterslaap een gewenst aantal overwinterende individuen te verkrijgen voor verschillende analyses.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een experimenteel onderzoek naar de winterslaap van coloradokever onder natuurlijke omstandigheden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een van de belangrijkste plagen van aardappel Solanum tuberosum L. in de gematigde zone is het insect coloradokever (CPB). De meeste onderzoeken naar de immuniteit en ziekten van het CPB worden uitgevoerd tijdens actieve voedingsfasen. Desalniettemin zijn er minder studies over ruststadia, hoewel deze kevers het grootste deel van hun levenscyclus in een staat van winterdiapauze (winterslaap) doorbrengen. In dit werk is een methode ontwikkeld en getest om de CPB-winterslaap onder natuurlijke omstandigheden te onderzoeken, die de mogelijkheid biedt om in de winter voldoende individuen te verzamelen. In dit artikel werd de overleving van het CPB beoordeeld en werden infectieuze agentia in verschillende stadia van de winterslaap geïdentificeerd. De CPB-sterfte nam toe tijdens de winterslaap en bereikte een maximum in april-mei. Entomopathogene schimmels (Beauveria, Isaria en Lecanicillium) en bacteriën Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas en Serratia werden geïsoleerd uit de dode insecten. Het overlevingspercentage van de kevers gedurende de gehele winterslaap was 61%. Er werden geen bevroren of uitgedroogde kevers gevonden, wat wijst op het succes van de gepresenteerde methode.
Inleiding
De coloradokever Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) is een belangrijke plaag van Solanaceae-planten, voornamelijk aardappel Solanum tuberosum L. Het geografische verspreidingsgebied van deze soort is meer dan 16 miljoenkm2 en breidt zich voortdurend uit1. Het CPB heeft facultatieve winterdiapauze en winterslaap is verplicht in de gematigde zone. De diapauze wordt geïnduceerd door een fotoperiode van een korte dag en gemoduleerd door temperatuur1. Deze kevers overwinteren in het volwassen stadium door zich in de grond in te graven. Met toenemende breedtegraden wordt de duur van de winterslaap langer. In de gematigde zone, vooral op de noordelijke gebieden van zijn verspreidingsgebied, duurt de overwintering tot 9 maanden: van augustus-september tot mei-juni (Noskov et al., persoonlijke observaties). In deze periode wordt het CPB - net als elk ander insect in de gematigde zone - blootgesteld aan ongunstige winterse omstandigheden en moet het zijn koudetolerantie verhogen. Tegelijkertijd verhoogt contact van de kevers met de bodem het risico op infectie door verschillende opportunistische en pathogene micro-organismen2. Daarom moeten deze kevers tijdens de winterslaap een bepaald niveau van activiteit van het immuunsysteem behouden, wat ook energetisch kostbaar is. Desalniettemin, zelfs als het insect een infectie overleeft, kan de ziekte zijn winterhardheid verminderen3. Opgemerkt moet worden dat lage temperatuur niet de enige reden is voor wintersterfte van het CPB. Een belangrijke rol wordt ook gespeeld door het gebrek aan zuurstof, en onder bepaalde omstandigheden zou het de belangrijkste factor kunnen zijn van wintersterfte 4,5.
Het is bekend dat de natuurlijke wintersterfte van het CPB zeer hoog kan zijn, tot 100% in kleileemgronden6. Overwinteren is dus een van de meest cruciale periodes in de levenscyclus van het CPB. Niettemin zijn gegevens over de fysiologie, de activiteit van het immuunsysteem, de overleving en andere parameters van de CPB-winterslaap onder natuurlijke omstandigheden nog steeds beperkt. Er zijn studies naar differentiële genexpressie en verschillende fysiologische parameters bij CPB-volwassenen tijdens de diapauze en als reactie op een koudeschok 7,8,9,10,11,12; Deze analyses zijn echter voornamelijk uitgevoerd door inductie van diapauze of koudestress onder laboratoriumomstandigheden zonder natuurlijke schommelingen in temperatuur, vochtigheid en inheemse pathogene belasting. Niettemin is onderzoek naar de fysiologie van deze kevers die onder natuurlijke omstandigheden uit de bodem zijn verzameld, belangrijk. In de jaren 1970-1980 werden verschillende aspecten van CPB-overwintering onder natuurlijke omstandigheden actief bestudeerd 13,14,15,16,17,18. Aan de andere kant was er bij deze onderzoeken geen sprake van CPB-ontgraving uit de bodem in de winter. Daarnaast wordt een techniek voor gecontroleerde winterslaap van het CPB en een beschrijving van de kooien niet in detail gegeven. Onderzoek naar de fysiologie van CPB's die in natuurlijke omgevingen overwinteren is dus nodig19.
Het doel van dit onderzoek was het ontwikkelen en testen van een methode voor gecontroleerde winterslaap van CPB-volwassenen onder natuurlijke omstandigheden. De voorgestelde methode maakt het mogelijk om een gewenst aantal CPB-individuen te verkrijgen voor microbiologische, immunologische en andere tests tijdens de winterslaap onder veldomstandigheden van een continentaal klimaat. Deze methode kan worden aangepast en toegepast op andere insectensoorten die overwinteren in grond onder sneeuw.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Beschrijving van de kooien voor de winterslaap
OPMERKING: Afhankelijk van de doelstellingen van het experiment varieert het aantal kooien. Gebruik ten minste drie kooien per bemonsteringsdatum. Om het aantal kevers dat tevoorschijn zal komen te schatten, bereidt u ten minste drie extra kooien voor, die pas in het voorjaar uit de grond worden gehaald.
- Gebruik kooien gemaakt van een stijf houten frame met een afmeting van 25 × 25 × 40 cm (L × B × H).
- Gebruik voor het bouwen van een frame voor de kooi houten latten van minimaal 2 cm dik en 4 cm breed.
- Bedek de binnenkant van de kooi met een roestvrijstalen gaas met openingen van niet meer dan 5 mm × 3 mm. Gebruik een houtnietmachine om het gaas te bevestigen.
- Bevestig het roestvrijstalen gaas met de nietmachine aan de buitenkant van de bodem.
- Bekleed de binnenkant van de kooi met een zwart synthetisch geotextiel met een dichtheid van 60 g/m2.
OPMERKING: Het geotextiel dient als een extra barrière om te voorkomen dat de kevers ontsnappen. Gebruik het niet in experimenten met betrekking tot actief bewegende entomopathogenen en parasitoïden. - Bevestig een buis van synthetische, doorschijnende, ademende stof van ongeveer 60 cm hoog stevig aan de bovenkant van de kooi.
- Kruis en bevestig twee sterke touwen aan de bodem van de kooi om hem indien nodig uit de grond te trekken.
2. Installatie van de kooien
- Graaf een gat van 40 cm diep in de grond en plaats de kooi erin.
- Leg droog gras of hooi op het gat.
- Plaats de kooi zo dat het hooi of het droge gras zich tussen de wanden van de kooi en de grond bevindt.
- Vul de kooien met aarde van hetzelfde aardappelveld waar de insecten worden verzameld.
- Installeer waterdichte temperatuur- en vochtigheidsdataloggers in de kooien op de vereiste diepten.
NOTITIE: Dataloggers van elke fabrikant mogen worden gebruikt en moeten bij lage temperaturen kunnen werken. - Plant aardappelzaailingen 3-4 weken voor de introductie van de kevers in elke kooi en geef ze matig water.
- Bevestig een buis van synthetisch weefsel verticaal aan een stok van een materiaal dat aan de buitenkant van de kooi is geïnstalleerd.
3. Kweek van insecten voor overwintering
- Verzamel handmatig volwassen kevers in pesticidevrije aardappelvelden tegen het einde van de aardappelvegetatie.
OPMERKING: Volwassen kevers verschillen aanzienlijk van larven en worden gekenmerkt door gestreepte dekschilden, terwijl larven rood zijn. - Bewaar de verzamelde kevers in plastic emmers van 15-20 L (maximaal 200 stuks per emmer) met aardappeltoppen om de insecten te voeren voordat u ze in de kooien plaatst.
- Bedek de emmers met ademende stof.
NOTITIE: Bewaar insecten niet langer dan 12 uur in emmers. Gebruik aardappeltoppen die groot genoeg zijn om de ophoping van kevers op de bodem van de emmers te voorkomen. - Plaats niet meer dan 200 CPB-individuen op de aardappelplanten bedekt met het synthetische weefselgaas.
- Wanneer de aardappeltoppen zijn geconsumeerd, voeg je verse toe in een plastic pot met water en vervang je de aardappeltoppen daarna dagelijks.
NOTITIE: Gebruik watten en parafilm om stengels in een pot te fixeren. Controleer oude stengels zorgvuldig op de kevers wanneer u ze verwijdert. - Zodra alle kevers in de grond zijn ingegraven om te overwinteren, maakt u de buis van synthetische stof los van de stok en legt u de stof neer.
4. Verzameling insecten tijdens het winterseizoen
- Verwijder sneeuw boven het oppervlak van de kooi.
- Maak de kooi aan elke kant los met een sterke schop.
- Trek de kooi met behulp van de touwen uit de grond.
- Breng de kooi naar het lab.
OPMERKING: Afhankelijk van de doelstellingen van het experiment kan het zijn dat overwinterende kevers voorafgaand aan de analyse inactief moeten zijn. In dit geval moet de temperatuur in het laboratorium tijdens de isolatie van kevers uit de grond ~2-5 °C zijn. - Verwijder de aarde in kleine porties uit de doos, breek voorzichtig grote stukken aarde en isoleer kevers met een pincet.
- Scheid levende kevers van kadavers. Levende gezonde kevers creëren compacte grond om zich heen, vormen een luchtholte (een zogenaamde wieg) en zijn daarom gemakkelijk te scheiden van de grond. Kevers die door schimmels worden gedood, worden gemummificeerd of hebben zichtbaar mycelium op het oppervlak. Bacterieel ontbindende insecten zijn donker.
- Zeef de grond door een zeef om er zeker van te zijn dat alle kevers geïsoleerd en niet beschadigd zijn.
- Plaats kadavers met symptomen van een schimmelinfectie of bacteriële afbraak in een individuele steriele centrifugebuis van 15 ml voor toekomstige identificatie.
- Bewaar levende kevers in de koelkast bij een temperatuur van 0-2 °C tot de analyse in een gesloten geventileerde container met een vochtig watje.
5. Bereiding van orgaan- en weefselmonsters
- Om hemolymfe te verzamelen, maakt u een punctie in het laterale deel van de buik onder de dekschilden met behulp van een insulinenaald.
OPMERKING: Tijdens de overwintering wordt de hoeveelheid hemolymfe aanzienlijk verminderd, waardoor het moeilijk is om deze vloeistof op te vangen. - Om de darm te isoleren, snijdt u de hoofdcapsule af, knijpt u alle inhoud uit een petrischaal met fosfaatbuffer, scheidt u de darm en reinigt u deze van vet en Malpighiaanse vaten.
- Scheid een gewenst deel van de darm, zoals de voordarm, middendarm of achterdarm.
- Om het vetlichaam te isoleren, scheidt u het van andere weefsels na de isolatie van de darm.
OPMERKING: De geïsoleerde weefsels kunnen worden gebruikt voor het meten van de activiteit van antioxiderende en ontgiftende enzymen (een voorbeeld: aanvullende figuur 1), analyse van de regulatie van genen voor immuunsignaleringsroutes (een voorbeeld: aanvullende figuur 2), of metabarcoding van de darminhoud van insecten, enz.
6. Isolatie van micro-organismen uit de kadavers
- Om entomopathogene schimmels uit de kadavers te isoleren, plaatst u de gemummificeerde insecten in een steriele vochtigheidskamer.
- Gebruik luchtconidia (indien beschikbaar) of sclerotia uit de inwendige inhoud van de kevers voor het uitplateren op Sabouraud-dextrose-agar met 0,4% melkzuur.
OPMERKING: Gebruik kevers met mycelium en conidia voor het onmiddellijk plateren (zonder ze in vochtigheidskamers te plaatsen). - Isoleer bacteriën uit de kadavers met symptomen van bacteriële afbraak.
- Snijd de kop van een kever af, knijp de interne inhoud eruit en verzamel ze in buizen om vervolgens op media te worden geplateerd voor bacteriën (Luria-Bertani-agar, endo-agar en galesculine-agar).
OPMERKING: Gebruik microscopie en moleculaire methoden om geslachten en soorten van de ziekteverwekkers te identificeren. Indien nodig kan een analyse op de aanwezigheid van andere parasieten worden uitgevoerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De onderstaande resultaten over overwinterende CPB's tonen bodemtemperatuur, overleving en infecties.
Dynamiek van de bodemtemperatuur.
Van eind november tot begin april werden temperaturen onder nul in de kooien op een diepte van 30 cm geregistreerd (Figuur 1). De gemiddelde temperatuur in deze periode was min 3,3 ± 0,1 °C (gemiddelde ± standaardfout). De laagst gemeten temperatuur was min 7,9 °C medio februari.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie laat zien dat de voorgestelde methode voor het bestuderen van de overwintering van CPB's ons in staat stelt om voldoende insecten te verkrijgen in verschillende winterslaapperiodes. Het succes van de gepresenteerde techniek hangt af van verschillende onafhankelijke factoren, waarvan de weersomstandigheden de belangrijkste zijn. In een koude, sneeuwloze winter kan de grond tot de gehele diepte van de kooi bevriezen. In dit geval neemt het risico op overlijden van alle kevers aanzienlijk toe18...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Dankbetuigingen
We danken onze collega's Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova en Oksana Tomilova voor hun hulp bij het organiseren en uitvoeren van de veld- en laboratoriumprocedures.
Het onderzoek werd ondersteund door de Russian Science Foundation, project nr. 22-14-00309.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar-agar bacteriologisch gezuiverd | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydraat-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Melkzuur | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani vloeibaar medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conische centrifugeerbuisjes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Pepton | FBIS SRCAMB | M 030/O61 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Medigen | PBS500 | |
| Temperatuur- en vochtigheidsdatalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterdichte datalogger |
Referenties
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
- Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, In Russian 194-215 (1973).
- Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
- Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
- Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
- Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
- Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
- Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617(2020).
- Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906(2021).
- Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
- Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6(1986).
- Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
- Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
- Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
- Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
- Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549(2021).
- Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
- Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488(2023).
- McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
