Bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing

Samenvatting

Hier beschrijven we een tweestaps celverteringsprotocol voor het bereiden van een eencellige suspensie van de halsslagaders van muizen.

Samenvatting

Halsslagaders zijn belangrijke bloedvaten in de nek die bloed en zuurstof naar de hersenen voeren, maar halsslagaderstenose treedt op wanneer halsslagaders verstopt zijn door plaque. Het onthullen van de cellulaire samenstelling van de halsslagader op het niveau van één cel is essentieel voor de behandeling van atherosclerose van de halsslagader. Er is echter geen kant-en-klaar protocol voor de bereiding van eencellige suspensies uit halsslagaders. Om een geschikt protocol te verkrijgen voor de dissociatie van normale halsslagaders op het niveau van één cel met minder schade aan cellen, ontwierpen we een verteringsmethode in twee stappen door het verteringsproces van collagenase/DNase en trypsine te integreren. Acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI) dubbele fluorescentietelling werd gebruikt om de levensvatbaarheid en concentratie van cellen te detecteren, en er werd vastgesteld dat de eencellige suspensie voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Na verwerking van gegevens met één cel werd een mediaan van ~2500 transcripten per cel gedetecteerd in elke cel van de halsslagader. Met name een verscheidenheid aan celtypen van de normale halsslagader, waaronder vasculaire gladde spiercellen (VSMC's), fibroblasten, endotheelcellen (EC's) en macrofagen en dendritische cellen (Mφ/DC's), waren gelijktijdig detecteerbaar. Dit protocol kan worden toegepast om een eencellige suspensie van bloedvaten uit andere weefsels te bereiden met de nodige aanpassingen.

Inleiding

Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte die gepaard gaat met risicofactoren zoals hoge bloeddruk, hyperlipidemie en hemodynamica^. Bifurcaties van de halsslagader zijn vatbaar voor hemodynamische veranderingen en leiden tot de vorming van plaque in de halsslagader. De klinische presentatie van atherosclerose van de halsslagader kan acuut zijn, zoals beroerte en voorbijgaande cerebrale ischemie, of chronisch, zoals recidiverende voorbijgaande cerebrale ischemie en vasculaire dementie². Mechanisch gezien is halsslagaderplaque het resultaat van de interactie tussen verschillende vaatwandcellen en verschillende blo....

Protocol

Alle hieronder beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Soochow University.

1. Reagentia en materiaalvoorbereiding

1. Gebruik 1x PBS zonder calcium en magnesium en 2,5 E/ml heparinenatriumzout om de perfusieoplossing te bereiden. Bewaren bij 4 °C en bij gebruik voorkoelen op ijs.
2. Bereid dissociatiereagens A dat 125 CDU/ml collagenase II en 60 E/ml DNase I bevat door 1250 CDU/ml collagenase II en 3000 E/ml DNase I te verdunnen met HBSS. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
3. Bereid dissociatiereagens B met een eindconcentratie van 0,12% trypsine door 1 ....

Resultaten

Dit protocol beschrijft een tweestaps celverteringsmethode voor het bereiden van een eencellige suspensie van halsslagaders van muizen (Figuur 1). Deze tweestaps celverteringsmethode combineert collagenase/DNase met trypsine om de vasculaire wand van de halsslagader van de muis effectief te dissociëren om hoogwaardige eencellige suspensies te verkrijgen voor sequencing van één cel. Na dissociatie werden de celconcentratie en cellevensvatbaarheid berekend door een geautomatiseerde celteller. .......

Discussie

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de halsslagader van wildtype muizen, waarin een tweestaps verteringsmethode werd geconstrueerd die het verteringsproces van collagenase/DNase en trypsine integreert. Na de kwaliteitscontrole van de eencellige suspensie stelden we vast dat deze voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Bovendien werden verschillende celtypen.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25% EDTA-vrije trypsine	Beyotime	C0205	Verdun 1 mL van 0.25% EDTA-vrije trypsine tot 1 mL van 1x PBS.
0.9% NaCl zoutoplossing	Beyotime	ST341	Verdun de heparine-natriumoplossing tot een eindconcentratie van 10 mg/mL
1 mL spuiten	SKJYLEAN	sk-r009	Voor het uitvoeren van hartperfusie
1.5 mL centrifugebuizen	KIRGEN	KG2211W	Om het weefselstuk en de celsuspensie te centrifugeren
20 mL spuiten	SKJYLEAN	sk-r013	Voor het uitvoeren van hartperfusie
40 µm celzeef	JETBIOFIL	css010040	Om onverteerde weefselfragmenten te filteren
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	Om te identificeren of de cel levend of dood is
Automatische celteller	Countstar	Mira FL	Om de celmorfologie en celviabiliteit van verteerde carotide vasculaire cellen te analyseren
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	Om Chromium single-cell RNA-seq-uitvoer te verwerken en clustering en genexpressieanalyse uit te voeren
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	Om single-cell RNA-seq bibliotheken van single-cell suspensie voor te bereiden
Collageenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Verdun met HBSS tot een eindconcentratie van 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Verdun met HBSS tot een eindconcentratie van 60 U/mL
Foetaal bovien serum	HyClone	SH30088.03	Beëindiging van de verteringsreactie
Hank's evenwichtige zout oplossing	Gibco	14175095	Bewaar bij kamertemperatuur
Heparine natriumzout	Solarbio Life Science	H8060	Verdun met 0.9% NaCl tot een eindconcentratie van 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Toegepast voor het neerzetten van de weefsels en celpelletten
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Solarbio Life Science	P1000	Gebaat voor hartperfusie en herophanging van cellen
Seurat pakket - R	Satija Lab	3.1.2	Om dimensionaliteitsreductie, visualisatie en analyse van scRNA-sequencing data uit te voeren
Zes-wells cel kweek platen	NEST	703002	Plaats het vasculaire weefsel
Waterbad	Jinghong	DK-S22	Houd de verteringstemperatuur op 37 °C