Hier beschrijven we een tweestaps celverteringsprotocol voor het bereiden van een eencellige suspensie van de halsslagaders van muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Halsslagaders zijn belangrijke bloedvaten in de nek die bloed en zuurstof naar de hersenen voeren, maar halsslagaderstenose treedt op wanneer halsslagaders verstopt zijn door plaque. Het onthullen van de cellulaire samenstelling van de halsslagader op het niveau van één cel is essentieel voor de behandeling van atherosclerose van de halsslagader. Er is echter geen kant-en-klaar protocol voor de bereiding van eencellige suspensies uit halsslagaders. Om een geschikt protocol te verkrijgen voor de dissociatie van normale halsslagaders op het niveau van één cel met minder schade aan cellen, ontwierpen we een verteringsmethode in twee stappen door het verteringsproces van collagenase/DNase en trypsine te integreren. Acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI) dubbele fluorescentietelling werd gebruikt om de levensvatbaarheid en concentratie van cellen te detecteren, en er werd vastgesteld dat de eencellige suspensie voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Na verwerking van gegevens met één cel werd een mediaan van ~2500 transcripten per cel gedetecteerd in elke cel van de halsslagader. Met name een verscheidenheid aan celtypen van de normale halsslagader, waaronder vasculaire gladde spiercellen (VSMC's), fibroblasten, endotheelcellen (EC's) en macrofagen en dendritische cellen (Mφ/DC's), waren gelijktijdig detecteerbaar. Dit protocol kan worden toegepast om een eencellige suspensie van bloedvaten uit andere weefsels te bereiden met de nodige aanpassingen.
Inleiding
Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte die gepaard gaat met risicofactoren zoals hoge bloeddruk, hyperlipidemie en hemodynamica. Bifurcaties van de halsslagader zijn vatbaar voor hemodynamische veranderingen en leiden tot de vorming van plaque in de halsslagader. De klinische presentatie van atherosclerose van de halsslagader kan acuut zijn, zoals beroerte en voorbijgaande cerebrale ischemie, of chronisch, zoals recidiverende voorbijgaande cerebrale ischemie en vasculaire dementie2. Mechanisch gezien is halsslagaderplaque het resultaat van de interactie tussen verschillende vaatwandcellen en verschillende bloedcellen onder pathologische omstandigheden. Daarom is het onthullen van de eencellige atlas van halsslagaders onder fysiologische en pathologische omstandigheden bijzonder belangrijk voor het voorkomen en behandelen van de ontwikkeling van halsslagaderplaques.
Single-cell RNA-sequencing is een van de krachtigste technologieën van biologisch onderzoek vanwege de ultrahoge resolutie en detectie van celheterogeniteit van hetzelfde celtype organismen 3,4. Onderzoekers hebben single-cell RNA-sequencing gebruikt om onderzoek te doen op vele gebieden, zoals hart- en vaatziekten5 en kanker6. Het snel en nauwkeurig scheiden van weefsels in afzonderlijke cellen is echter nog steeds een van de grootste uitdagingen. Enzymatische dissociatie is een veelgebruikte methode die voornamelijk collagenase, papaïne, trypsine, DNase en hyaluronidase omvat. In het bijzonder zijn collagenasen de belangrijkste enzymsoorten voor de vertering van eencellige cellen, voornamelijk hydrolyserende collageencomponenten in bindweefsels. Verschillende soorten collagenase zijn toepasbaar voor de dissociatie van verschillende weefsels, zoals de borstklier7, glomerulus8, iridocorneale hoek9, kniegewricht 10, aorta11 en long12. Vanwege de unieke fysiologische eigenschappen van verschillende weefsels, kan dissociatie met dezelfde methode veel problemen veroorzaken bij het verkrijgen van afzonderlijke cellen, zoals een lage levensvatbaarheid van cellen, een laag aantal cellen en groot celafval. Daarom is de uitvinding van verteringsmethoden voor verschillende weefsels essentieel voor het bereiden van hoogwaardige eencellige suspensies.
Dit protocol heeft tot doel een tweestaps celverteringsmethode te ontwikkelen om een eencellige suspensie van de halsslagader van wildtype muizen te bereiden. Volgens de kenmerken van de halsslagader hebben we collagenase/DNase gecombineerd met trypsine om een hoogwaardige eencellige suspensie van de halsslagader van de muis te verkrijgen, omdat collagenase collageen van de halsslagaderweefsels kan hydrolyseren, dat verder werd verteerd door trypsine tot een eencellige suspensie. Acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI) dubbele fluorescentietelling werd gebruikt om de levensvatbaarheid en concentratie van cellen te detecteren, en er werd vastgesteld dat de eencellige suspensie voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Na verwerking van eencellige gegevens werden vier celtypen, waaronder vasculaire gladde spiercellen (VSMC's), fibroblasten, endotheelcellen (EC's) en macrofagen en dendritische cellen (Mφ/DC's), geïdentificeerd in normale halsslagaders van muizen na vertering. De voordelen van dit protocol zijn dat: 1) meerdere celtypen in de halsslagader kunnen worden geïdentificeerd, 2) de levensvatbaarheid van de cellen goed behouden blijft en 3) het gemakkelijk kan worden herhaald zonder speciale apparatuur. Dit protocol is geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van eencellige multiomics van de halsslagaders van muizen. Dit protocol kan ook nuttig zijn bij de dissociatie van andere bloedvaten met de juiste aanpassingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hieronder beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Soochow University.
1. Reagentia en materiaalvoorbereiding
- Gebruik 1x PBS zonder calcium en magnesium en 2,5 E/ml heparinenatriumzout om de perfusieoplossing te bereiden. Bewaren bij 4 °C en bij gebruik voorkoelen op ijs.
- Bereid dissociatiereagens A dat 125 CDU/ml collagenase II en 60 E/ml DNase I bevat door 1250 CDU/ml collagenase II en 3000 E/ml DNase I te verdunnen met HBSS. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
- Bereid dissociatiereagens B met een eindconcentratie van 0,12% trypsine door 1 ml 0,25% EDTA-vrij trypsine (zonder fenolrood) te verdunnen tot 1 ml 1x PBS. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
- Bereid 10 ml 1,5% FBS en 10 ml 5% FBS in 1x PBS. Gebruik 1,5% FBS om de halsslagaders te bundelen en bewaar het voor gebruik op ijs. Gebruik 5% FBS om de spijsvertering te neutraliseren en bewaar bij kamertemperatuur (RT).
- Koop de experimentele materialen, waaronder spuiten van 1 ml, spuiten van 20 ml met naalden van 26 G, celkweekplaten met zes putjes, centrifugebuisjes van 1,5 ml, steriele celzeven van 40 μm en ijscontainers.
2. Voorbereiding van de apparatuur
- Steriliseer alle chirurgische apparatuur, inclusief een stereoscopische microscoop, ontleedschaar, micro-ontleedschaar en pincet met fijne punt.
- Schakel de geautomatiseerde celteller in en houd deze op RT.
- Zet het waterbad van tevoren aan op 37 °C.
- Koel de microcentrifuge voor gebruik af tot 4 °C.
3. Isolatie van de halsslagader van de muis
- Verdoof de muis met 1,25% tribroomethanol door middel van intraperitoneale injectie (0,24 ml voor elke 10 g lichaamsgewicht) en draai de muis om om te controleren of er na 3 minuten een oprichtende reflex is. Euthanaseer vervolgens de muis door cervicale dislocatie en leg hem op zijn rug. Spray de huid van de muis in met 75% alcohol.
- Gebruik een gesteriliseerde ontleedschaar om de huid te openen en de borstholte bloot te leggen. Snijd het diafragma open.
- Blijf omhoog snijden naar de onderkaak en verwijder voorzichtig overtollig bindweefsel en vet, waardoor de halsslagader bloot komt te liggen.
- Snijd de inferieure vena cava van de muis door om het bloed uit de gesloten bloedsomloop te laten stromen.
- Injecteer langzaam en continu 20 ml voorgekoelde perfusieoplossing in de linker hartkamer met een spuit.
OPMERKING: Als de perfusie succesvol is, zullen bloedrijke organen zoals de lever, milt en nieren grijswit worden. - Verwijder al het vet en bindweefsel rond de halsslagader met een micro-ontleedschaar onder een stereoscopische microscoop.
NOTITIE: Deze stap moet langzaam en voorzichtig worden uitgevoerd om schade aan de halsslagader te voorkomen. - Isoleer de halsslagader van de muis, was met 1x PBS om het bloed opnieuw te spoelen en breng over naar platen met zes putjes die 1,5% FBS op ijs bevatten.
4. Vertering van de halsslagader tot eencellige suspensie
- Gebruik een micro-ontleedschaar om de halsslagader in de lengterichting te ontleden en leg plat in een andere celkweekplaat met 6 putjes die 1 ml 1,5% FBS op ijs bevat.
- Spoel de intima voorzichtig met 1,5% FBS om het resterende bloed te verwijderen.
OPMERKING: Het spoelen moet voorzichtig en langzaam zijn om beschadiging van endotheelcellen te voorkomen. - Knip elke halsslagader in ongeveer 2 mm2 stukjes weefsel met behulp van een microontleedschaar in 1,5% FBS.
- Breng deze weefselstukjes over in een centrifugebuis van 1,5 ml met tips van 1 ml met een brede boring, centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de weefsels naar de bodem te laten zinken.
- Gooi het supernatans weg en resuspendeer de weefsels in 500 μl dissociatiereagens A.
- Plaats de tube gedurende 1 uur in een waterbad van 37 °C. Pipetteer voorzichtig met een pipet van 1 ml om de 10 minuten.
- Voeg 500 μL 5% FBS toe aan de tube en meng goed met een pipet van 1 ml.
- Filtreer de celsuspensie door een steriele celzeef van 40 μm in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 400 x g.
- Verwijder het supernatans voorzichtig en resuspendeer de celpellet in 200 μl dissociatiereagens B.
- Plaats in een waterbad van 37 °C en verteer nog eens 5 minuten. Pipetteer tijdens de spijsvertering elke 2 minuten voorzichtig om volledig te dissociëren in een eencellige suspensie.
- Gebruik 200 μL 5% FBS om de verteringsreactie te beëindigen en centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 100 μL 1x PBS op ijs.
5. Onderzoek naar celsuspensie en sequencing van eencellig RNA
- Voeg 10 μL AO/PI-oplossing toe aan 10 μL eencellige suspensie en meng voorzichtig met een pipet van 20 μL.
- Pipetteer 20 μL van het mengsel in de kamer, schuif en wacht 1 minuut.
- Laad het glaasje in het geautomatiseerde celtellerinstrument.
- Selecteer de AO/PI-levensvatbaarheidstest en wacht op het kwaliteitsrapport.
- Gebruik een eencellige 3ʹ-reagenskit om eencellige gelkorrels te genereren in de emulsie op een eencellige controller en amplificeer het cDNA met streepjescode in een thermische cycler volgens het protocol van de fabrikant.
OPMERKING: Hier werd Chromium Single Cell 3ʹReagens Kits v3 gebruikt. - Voer sequencing uit op een sequencer met een paired-end 150 bp (PE150) leesstrategie. Gebruik een softwaretoepassing (Cell Ranger) om onbewerkte basisoproepbestanden te converteren naar fastq-bestanden met behulp van de mkfastq-pijplijn . Gebruik vervolgens de Count Pipeline van Cell Ranger voor het uitvoeren van uitlijning, filtering, barcodetelling en unieke moleculaire identificatie (UMI) tellen om feature-barcodematrices13 te genereren.
- Voer reductie en visualisatie van gegevensdimensionaliteit uit met het R-pakket Seurat14.
- Eerst leest de Read10X() functie van Seurat de uitvoer van de Cell Ranger pipeline in en gebruikt vervolgens de count matrix om een Seurat object te maken. Filter vervolgens de cellen uit met expressie van <200 of >4000 genen of een mitochondriale genverhouding die meer dan 10% was door de subset() -functie van Seurat.
- Gebruik NormalizeData () en FindVariableFeatures() om de gegevens te normaliseren en respectievelijk 2000 zeer variabele functies te identificeren.
- Voer een hoofdcomponentanalyse (PCA) uit op de geschaalde gegevens en cluster de cellen met dims = 30 en resolutie = 0,5. Gebruik ten slotte de functie RunUMAP () om de gegevenssets met één cel te visualiseren en FindAllMarkers() om elke clusterbiomarker te vinden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft een tweestaps celverteringsmethode voor het bereiden van een eencellige suspensie van halsslagaders van muizen (Figuur 1). Deze tweestaps celverteringsmethode combineert collagenase/DNase met trypsine om de vasculaire wand van de halsslagader van de muis effectief te dissociëren om hoogwaardige eencellige suspensies te verkrijgen voor sequencing van één cel. Na dissociatie werden de celconcentratie en cellevensvatbaarheid berekend door een geautomatiseerde celteller. ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de halsslagader van wildtype muizen, waarin een tweestaps verteringsmethode werd geconstrueerd die het verteringsproces van collagenase/DNase en trypsine integreert. Na de kwaliteitscontrole van de eencellige suspensie stelden we vast dat deze voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Bovendien werden verschillende celtypen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation of China (82070450 aan C.T. en 82170466 aan L.Z.) en de fellowship van China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 aan F.L.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% EDTA-vrije trypsine | Beyotime | C0205 | Verdun 1 mL van 0.25% EDTA-vrije trypsine tot 1 mL van 1x PBS. |
| 0.9% NaCl zoutoplossing | Beyotime | ST341 | Verdun de heparine-natriumoplossing tot een eindconcentratie van 10 mg/mL |
| 1 mL spuiten | SKJYLEAN | sk-r009 | Voor het uitvoeren van hartperfusie |
| 1.5 mL centrifugebuizen | KIRGEN | KG2211W | Om het weefselstuk en de celsuspensie te centrifugeren |
| 20 mL spuiten | SKJYLEAN | sk-r013 | Voor het uitvoeren van hartperfusie |
| 40 µm celzeef | JETBIOFIL | css010040 | Om onverteerde weefselfragmenten te filteren |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | Om te identificeren of de cel levend of dood is |
| Automatische celteller | Countstar | Mira FL | Om de celmorfologie en celviabiliteit van verteerde carotide vasculaire cellen te analyseren |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | Om Chromium single-cell RNA-seq-uitvoer te verwerken en clustering en genexpressieanalyse uit te voeren |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | Om single-cell RNA-seq bibliotheken van single-cell suspensie voor te bereiden |
| Collageenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Verdun met HBSS tot een eindconcentratie van 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Verdun met HBSS tot een eindconcentratie van 60 U/mL |
| Foetaal bovien serum | HyClone | SH30088.03 | Beëindiging van de verteringsreactie |
| Hank's evenwichtige zout oplossing | Gibco | 14175095 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| Heparine natriumzout | Solarbio Life Science | H8060 | Verdun met 0.9% NaCl tot een eindconcentratie van 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Toegepast voor het neerzetten van de weefsels en celpelletten |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Solarbio Life Science | P1000 | Gebaat voor hartperfusie en herophanging van cellen |
| Seurat pakket - R | Satija Lab | 3.1.2 | Om dimensionaliteitsreductie, visualisatie en analyse van scRNA-sequencing data uit te voeren |
| Zes-wells cel kweek platen | NEST | 703002 | Plaats het vasculaire weefsel |
| Waterbad | Jinghong | DK-S22 | Houd de verteringstemperatuur op 37 °C |
Referenties
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694(2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180(2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530(2020).
- Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426(2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321(2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832(2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266(2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339(2021).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152(2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
