Methodenartikel

Opzetten van een fysiologisch menselijk gevasculariseerd microtumormodel voor kankeronderzoek

DOI:

10.3791/65865

⸱

15 september 2023

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Biomedical Engineering, University of California, Irvine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een fysiologisch relevant tumor-on-a-chip-model om basis- en translationeel kankeronderzoek bij mensen met een hoge doorvoer uit te voeren, het screenen van geneesmiddelen, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen te bevorderen met een beschrijving van laad-, onderhouds- en evaluatieprocedures.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gebrek aan gevalideerde kankermodellen die de tumormicro-omgeving van solide kankers in vitro recapituleren, blijft een belangrijk knelpunt voor preklinisch kankeronderzoek en therapeutische ontwikkeling. Om dit probleem op te lossen, hebben we de gevasculariseerde microtumor (VMT) of tumorchip ontwikkeld, een microfysiologisch systeem dat de complexe micro-omgeving van de menselijke tumor realistisch modelleert. De VMT vormt zich de novo binnen een microfluïdisch platform door co-kweek van meerdere menselijke celtypen onder dynamische, fysiologische stromingsomstandigheden. Dit weefselgemanipuleerde microtumorconstruct bevat een levend doorbloed vasculair netwerk dat de groeiende tumormassa ondersteunt, net zoals nieuw gevormde bloedvaten dat in vivo doen. Belangrijk is dat medicijnen en immuuncellen de endotheellaag moeten passeren om de tumor te bereiken, waarbij in vivo fysiologische barrières voor therapeutische toediening en werkzaamheid worden gemodelleerd. Omdat het VMT-platform optisch transparant is, kan beeldvorming met hoge resolutie van dynamische processen zoals extravasatie van immuuncellen en metastase worden bereikt met directe visualisatie van fluorescerend gelabelde cellen in het weefsel. Verder behoudt de VMT in vivo tumorheterogeniteit, genexpressiehandtekeningen en geneesmiddelresponsen. Vrijwel elk tumortype kan worden aangepast aan het platform, en primaire cellen van verse chirurgische weefsels groeien en reageren op medicamenteuze behandeling in de VMT, wat de weg vrijmaakt voor echt gepersonaliseerde geneeskunde. Hier worden de methoden geschetst om de VMT op te zetten en te gebruiken voor oncologisch onderzoek. Deze innovatieve aanpak opent nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van tumoren en medicijnreacties, en biedt onderzoekers een krachtig hulpmiddel om kankeronderzoek vooruit te helpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanker blijft wereldwijd een groot gezondheidsprobleem en is de tweede belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Alleen al voor het jaar 2023 verwacht het National Center for Health Statistics meer dan 1,9 miljoen nieuwe gevallen van kanker en meer dan 600,000 sterfgevallen door kanker in de VS1, wat de dringende behoefte aan effectieve behandelingsbenaderingen benadrukt. Momenteel krijgt echter slechts 5,1% van de antikankertherapieën die aan klinische onderzoeken beginnen, uiteindelijk goedkeuring van de FDA. Het falen van veelbelovende kandidaten om met succes door klinische proeven te komen, kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan het gebruik van niet-fysiologische modelsystemen, zoals 2D- en sferoïde culturen, tijdens de preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen. Deze klassieke kankermodellen missen essentiële componenten van de micro-omgeving van de tumor, zoals een stromale niche, geassocieerde immuuncellen en doorbloede vasculatuur, die belangrijke determinanten zijn van therapeutische resistentie en ziekteprogressie. Er is dus een nieuw modelsysteem nodig dat de menselijke in vivo tumormicro-omgeving beter nabootst om de klinische vertaling van preklinische bevindingen te verbeteren.

Het gebied van weefselmanipulatie gaat snel vooruit en biedt verbeterde methoden voor het bestuderen van ziekten bij de mens in laboratoriumomgevingen. Een belangrijke ontwikkeling is de opkomst van microfysiologische systemen (MPS), ook bekend als orgaanchips of weefselchips, dit zijn functionele, geminiaturiseerde menselijke organen die in staat zijn om gezonde of zieke aandoeningen na te bootsen 3,4,5. In deze context zijn tumorchips, driedimensionale microfluïdische in vitro menselijke tumormodellen, ontwikkeld voor oncologisch onderzoek 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Deze geavanceerde modellen bevatten biochemische en biofysische signalen binnen een dynamische tumormicro-omgeving, waardoor onderzoekers tumorgedrag en reacties op behandelingen in een meer fysiologisch relevante context kunnen bestuderen. Ondanks deze vooruitgang zijn er echter maar weinig groepen die met succes een levend, functioneel vaatstelsel hebben opgenomen, met name een die zichzelf patronen geeft als reactie op fysiologische stroom 3,4,5,6. De opname van een functioneel vasculair netwerk is cruciaal omdat het het mogelijk maakt om fysieke barrières te modelleren die van invloed zijn op de afgifte van geneesmiddelen of cellen, celhoming naar verschillende micro-omgevingen en transendotheliale migratie van tumor-, stromale en immuuncellen. Door deze functie op te nemen, kan de tumorchip de complexiteit die wordt waargenomen in de in vivo tumormicro-omgeving beter weergeven.

Om aan deze onvervulde behoefte te voldoen, hebben we een nieuw platform voor het screenen van geneesmiddelen ontwikkeld waarmee netwerken van microbloedvaten kunnen worden gevormd binnen een microfluïdisch apparaat 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Dit basisorgaanchipplatform, het gevasculariseerde micro-orgaan (VMO) genoemd, kan worden aangepast aan vrijwel elk orgaansysteem om de oorspronkelijke weefselfysiologie na te bootsen voor ziektemodellering, medicijnscreening en gepersonaliseerde geneeskundetoepassingen. VMO's worden tot stand gebracht door het samen kweken van endotheelkolonievormende cel-afgeleide endotheelcellen (ECFC-EC), HUVEC of iPSC-EC (hierna EC) en meerdere stromale cellen in de kamer, waaronder normale menselijke longfibroblasten (NHLF), die de matrix hermodelleren, en pericyten die de bloedvaten omhullen en stabiliseren. De VMO kan ook worden opgezet als een kankermodelsysteem door tumorcellen samen te kweken met het bijbehorende stroma om een gevasculariseerde microtumor (VMT)8,9,10,11,12,13 of tumorchipmodel te creëren. Door de co-kweek van meerdere celtypen in een dynamische stroomomgeving, vormen geperfuseerde microvasculaire netwerken de novo in de weefselkamers van het apparaat, waar de vasculogenese nauw wordt gereguleerd door interstitiële stroomsnelheden14,15. Het medium wordt door de microfluïdische kanalen van het apparaat aangedreven door een hydrostatische drukkop die de omringende cellen van de weefselkamer uitsluitend via de microvaten van voedingsstoffen voorziet, met een permeabiliteitscoëfficiënt van 1,2 x 10-7 cm/s, vergelijkbaar met wat wordt gezien voor haarvaten in vivo8.

De integratie van zelforganiserende microvaten in het VMT-model vertegenwoordigt een belangrijke doorbraak omdat het: 1) de structuur en functie van gevasculariseerde tumormassa's in vivo nabootst; 2) kan belangrijke stappen van metastase modelleren, inclusief tumor-endotheliale en stromale celinteracties; 3) stelt fysiologisch selectieve barrières vast voor de afgifte van voedingsstoffen en geneesmiddelen, waardoor de farmaceutische screening wordt verbeterd; en 4) maakt directe beoordeling mogelijk van geneesmiddelen met anti-angiogene en anti-metastatische eigenschappen. Door de in vivo toediening van voedingsstoffen, medicijnen en immuuncellen in een complexe 3D-micro-omgeving na te bootsen, is het VMO/VMT-platform een fysiologisch relevant model dat kan worden gebruikt om geneesmiddelenscreening uit te voeren en kanker-, vasculaire of orgaanspecifieke biologie te bestuderen. Belangrijk is dat de VMT de groei van verschillende soorten tumoren ondersteunt, waaronder darmkanker, melanoom, borstkanker, glioblastoom, longkanker, peritoneale carcinomatose, eierstokkanker en alvleesklierkanker 8,9,10,11,12,13. Het microfluïdische platform is niet alleen goedkoop, gemakkelijk op te zetten en geschikt voor experimenten met een hoge doorvoer, maar is ook volledig optisch compatibel voor real-time beeldanalyse van tumor-stromale interacties en respons op stimuli of therapieën. Elk celtype in het systeem is gelabeld met een andere fluorescerende marker om directe visualisatie en tracking van celgedrag gedurende het hele experiment mogelijk te maken, waardoor een venster ontstaat op de dynamische micro-omgeving van de tumor. We hebben eerder aangetoond dat de VMT in vivo tumorgroei, architectuur, heterogeniteit, genexpressiehandtekeningen en geneesmiddelresponsen getrouwer modelleert dan standaard kweekmodaliteiten10. Belangrijk is dat de VMT de groei en studie van van patiënten afgeleide cellen, waaronder kankercellen, ondersteunt, waardoor de pathologie van de oudertumoren beter wordt gemodelleerd dan standaard sferoïde culturen en de inspanningen op het gebied van gepersonaliseerde geneeskunde verder worden bevorderd11. Dit manuscript schetst de methoden voor het opzetten van de VMT en toont het nut ervan voor het bestuderen van menselijke kankers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ontwerp en fabricage

  1. Ontwerp van het apparaat
    1. Voor de fabricage van microfluïdische apparaten maakt u een SU-8-mal met behulp van een laag van 200 μm SU-8 spin-coated op een Si-wafer (RCA-1 gereinigd en 2% waterstoffluoride (HF) behandeld), gevolgd door een enkele fotolithografiestap met een masker zoals eerder beschreven 8,9.
    2. Giet een 4 mm dikke polydimethylsiloxaan (PDMS) replica van de SU-8 mal om een duurzame polyurethaan mal te genereren voor stroomafwaartse fabricagestappen. Verschillende ontwerpiteraties kunnen worden gebruikt 8,9,10,11,12,13,14,15.
    3. Ontwerp in de huidige iteratie het microfluïdische apparaat dat op maat wordt gemaakt in een standaard plaatformaat met 96 putjes en bestaat uit een 2 mm dikke PDMS-functielaag met 12 microfluïdische apparaateenheden omsloten door een dunne (1/16 inch) transparante polymeermembraanlaag aan de onderkant (Figuur 1A).
    4. Zorg ervoor dat individuele weefseleenheden bestaan uit een weefselkamer geflankeerd door gellaadinlaat (L1) en -uitlaat (L2), een drukregelaar (PR)16 en ontkoppelde microfluïdische kanalen die zijn aangesloten op 2 media-inlaten en -uitgangen aan elke kant (M1-M2, M3-M4; Figuur 1B).
    5. Plaats elke inlaat en uitlaat in een enkele put die dient als een middelgroot reservoir om hydrostatische druk (10 mm H2O) over het microfluïdische kanaal tot stand te brengen. Om vasculaire netwerkanastomosen met de buitenste kanalen mogelijk te maken, verbindt u microfluïdische kanalen met de weefselkamer via 50 μm brede communicatieporiën (6 bovenaan, 6 onder).
      OPMERKING: Microfluïdische weerstanden creëren een interstitiële drukgradiënt van 5 mm H2O over de weefselkamer die intraluminaal wordt zodra het vasculaire netwerk volledig is gevormd 8,10. De volgende procedures beginnen met een volledig geassembleerde plaat met hoge doorvoer.

figure-protocol-1
Figuur 1. Microfluïdisch platformontwerp. (A) Het schema van de platformassemblage toont de PDMS-functielaag met 12 apparaateenheden die zijn gebonden aan een bodemloze plaat met 96 putjes en verzegeld met een dun transparant polymeermembraan. Elke apparaateenheid neemt een kolom met putjes op de plaat in beslag. De rood omlijnde eenheid van één apparaat wordt weergegeven met details in (B). (B) Schema van één apparaateenheid toont een enkele weefselkamer die zich in één put van de plaat met 96 putjes bevindt en twee laadpoorten met een inlaat- en uitlaatgat (L1-L2) dat is geperforeerd om het cel-matrixmengsel te kunnen inbrengen. Middelgrote inlaten en uitlaten (M1-M2, M3-M4) zijn geperforeerd en geplaatst in putten die dienen als mediareservoirs. Verschillende mediavolumes zorgen voor een hydrostatische drukgradiënt over de weefselkamer via ontkoppelde microfluïdische kanalen. De drukregelaar (PR) dient als een gelbarstventiel om het laadgemak te vergroten. Merk op dat het apparaat 200 μm diep is en dat de weefselkamer 2 mm x 6 mm is. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Voorbereidingen voor het laden

  1. Celkweek
    1. Onderhoud de cellen volgens de aanbevelingen van de fabrikant in een bevochtigde incubator van 37 °C en 5% CO2 .
    2. Plaat T75-kolven met getransduceerde EC-, NHLF- of andere fibroblast-/stromale cellen en gewenste kankercellen 3-4 dagen voorafgaand aan het laden met een dichtheid die is gebaseerd op de protocollen van de fabrikant en de gebruiker. Voor dit protocol 1 x 106 cellen per kolf voor elk celtype. Kweek EC in Endothelial Growth Media 2 (EGM2) complete media, NHLF in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% FBS, en kankercellen in geschikte media, afhankelijk van het celtype.
    3. Onderhoud cellen door elke 2-3 dagen te voeden met de respectievelijke media en bevestig de transductie- of labelefficiëntie opnieuw door cellen onder een fluorescerende microscoop te visualiseren. Zorg er op de dag van laden voor dat EC voor 80%-100% confluent is, terwijl NHLF voor 70%-80% subconfluent is.
  2. Bereiding van fibrinogeen
    1. Bereid de fibrinogeenoplossing voor tot de gewenste concentratie (doorgaans ondersteunt 5-8 mg/ml robuuste vasculaire netwerkvorming), rekening houdend met het percentage stolling van fibrinogeen. Bereken de benodigde hoeveelheid fibrinogeen met de volgende vergelijking:
      Fibrinogeen (mg) = (volume (ml)) x (concentratie (mg/ml))/ (stolling%)
    2. Los het fibrinogeen op in een geschikt volume endotheliale basale media 2 (EBM2), opgewarmd tot 37 °C, door zachtjes op de buis te tikken (niet vortex). Incubeer fibrinogeen in een waterbad van 37 °C om het volledig in oplossing te laten gaan. Belangrijk is dat u geen volledig medium gebruikt.
    3. Steriele filterfibrinogeenoplossing met een filter van 0,22 μm en aliquot tot het gewenste volume, meestal 400 μl per microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Andere matrixeiwitten (bijv. collagenen, fibronectine of laminine) kunnen in de fibrinogeenmix worden toegevoegd.

3. Laden van monsters

OPMERKING: Het laden is tijdgevoelig en moet van het begin (celliften) tot het einde (toevoegen van media aan apparaten) binnen ongeveer 1.5-1.75 uur worden voltooid om optimale resultaten te garanderen. Elke stap wordt genoteerd met een voorgestelde timer om de gebruiker op het goede spoor te houden.

  1. Voorbereiding van materialen (dag van laden)
    1. Plaats het volgende gedurende 10-15 minuten in een waterbad van 37 °C: Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor het wassen van cellen, celdissociatiereagens, media (bijv. EGM2, DMEM)
    2. Bewaar de volgende reagentia tot gebruik in een koelkast van 4 °C: trombine, laminine (een nacht ontdooien bij 4 °C).
    3. Ontdooi fibrinogeen aliquot bij kamertemperatuur. Bereid aliquots trombine van 1,5 μl in microcentrifugebuisjes van 500 μl, met één buisje per apparaateenheid. Zorg ervoor dat het trombine-aliquot zich aan de onderkant van elke buis bevindt om het laden te vergemakkelijken.
    4. Plaats UV-gesteriliseerde platen met een hoge doorvoer gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan het laden in een exsiccator om de lucht te verwijderen die in de microfluïdica is opgesloten.
  2. Celvoorbereiding (Timerstart = begin bij 0 min)
    1. Controleer cellen onder de microscoop met een vergroting van 4x om de samenvloeiing en transductie-efficiëntie te bevestigen.
    2. Was elke T75-kolf met cellen 2x met 5 ml HBSS en zuig volledig op. Voeg 1 ml dissociatiereagens toe aan elke kolf en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 1-2 min.
    3. Tik zachtjes met de palm van je hand op de plaat en controleer of alle cellen zijn opgetild.
    4. Was de cellen van de kolf met 9 ml geschikt medium en vang ze op in een conische kolf van 15 ml. Verwijder onmiddellijk een kleine aliquot voor het tellen van cellen.
    5. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 3-5 minuten bij 4 °C. Tel tijdens het centrifugeren van cellen de cellen. Een confluente T75-kolf van EC of NHLF moet ten minste 2 x 106 cellen opleveren.
    6. Na het centrifugeren het materiaal opzuigen en de pellet resuspenderen in geschikte media in een concentratie van 1 x 106 cellen/ml. Houd cellen op ijs.
  3. Bereiding van het mengsel van cel en fibrinogeen (Timer = begin op 20 min)
    1. Bepaal hoeveel apparaten er worden geladen, voeg er 1-2 toe om rekening te houden met pipetteerverlies en vermenigvuldig dit met het volume van de benodigde cel/fibrinogeenmix per apparaat. Dit is afhankelijk van de configuratie van het apparaat, maar voor het apparaatontwerp dat in dit artikel wordt gepresenteerd, is 6 μL per apparaat vereist.
    2. De concentratie van elk celtype moet experimenteel worden bepaald. Om te beginnen belast u EC met een concentratie van ongeveer 7 x 106 cellen/ml en NHLF met een concentratie van 3,5 x 106 cellen/ml. De concentratie van kankercellen kan aanzienlijk variëren op basis van hun groeisnelheid, maar ligt meestal binnen het bereik van 0,5-2 x 10,6 cellen/ml. Gebruik deze vergelijking om het aantal benodigde cellen te berekenen:
      Aantal benodigde cellen = (volume fibrine (μL))/1000 μL x (concentratie van cellen)
    3. Resuspendeer de cellen in een concentratie van 1 x 106 cellen/ml en gebruik de volgende vergelijking om het benodigde celvolume te bepalen:
      Volume benodigde cellen (μL) = (aantal benodigde cellen)/1000
    4. Meng de respectievelijke volumes EC-, NHLF- en kankercellen (alleen voor VMT) in een conische buis en centrifugeer bij 300 x g gedurende 3-5 minuten bij 4 °C.
    5. Zuig na het centrifugeren voorzichtig de media op en spuit eventuele resterende media in de buurt van de pellet weg. Breng de pellet voorzichtig maar grondig opnieuw in het berekende volume fibrinogeen en let er extra op dat er geen luchtbellen ontstaan. Blijf op ijs.
    6. Breng gesteriliseerde platen en trombinealiquots in de weefselkweekkap.
  4. Laadapparaten (Timer = begin bij 30-35 min)
    1. Pipetteer met een P20-pipet 6 μL volume uit het cel/fibrinemengsel. Zorg ervoor dat u het mengsel minstens 5x op en neer spuit om een uniforme celsuspensie te garanderen. Bewaar het mengsel op ijs om de stolling te vertragen.
    2. Meng de cel/fibrine voorzichtig in een buis met trombine door de pipetpunt rechtstreeks in het trombine-aliquot aan de onderkant van de buis te steken. Onmiddellijk minstens 2x op en neer spuiten, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan. Het fibrine begint te stollen zodra het zich met trombine heeft vermengd, dus voltooi snel maar opzettelijk stap 3.4.3. en 3.4.4. voordat de fibrine gelt in de pipetpunt (~3 s).
    3. Til de plaat met hoge doorvoer schuin op en steek de pipetpunt snel in een van de laadpoorten van het apparaat (L1 of L2). Zie figuur 2A voor het schema.
    4. Duw de pipetzuiger met een soepele, vloeiende beweging naar beneden tot aan de eerste stop om het cel/fibrinemengsel in de weefselkamer te injecteren. Kijk of de gel volledig door de kamer gaat.
      OPMERKING: Als u tijdens deze stap te veel druk uitoefent, kan dit leiden tot barsten van de gel in de microfluïdische kanalen aan de boven- en/of onderkant van de weefselkamers.
    5. Plaats de plaat voorzichtig weer plat in de weefselkweekkap zonder de pipetpunt te verwijderen, de pipetzuiger los te laten of de pipet te verstoren. Gebruik uw hand om de pipetpunt van de P20 te draaien en te verwijderen en in het gat van de laadpoort te laten. Gebruik de uitwerpknop niet om de punt te verwijderen, omdat dit te veel druk zal veroorzaken.
    6. Ga verder met de stappen 3.4.1-3.4.5 voor de overige apparaten.
    7. Wanneer het laden is voltooid, laat u de plaat 2 minuten ongestoord in de weefselkweekkap zitten.
    8. Verwijder de pipetpunten door ze voorzichtig te draaien en uit de laadpoorten te trekken. Plaats het deksel terug op de plaat.
    9. Incubeer de hele plaat gedurende 15-20 minuten in een incubator van 37 °C om de gel volledig te laten polymeriseren.
    10. Controleer na het incuberen elke apparaateenheid onder de microscoop. Controleer of de cellen gelijkmatig over de kamer zijn verdeeld zonder luchtbellen en of er een duidelijk zichtbare gelinterface is tussen de weefselkamer en de microfluïdische kanalen, zoals in figuur 2B-C.
  5. Kanaalcoating met laminine (Timer = begin bij 45-50 min)
    1. Nadat de gels volledig stevig zijn, introduceert u laminine in de microfluïdische kanalen om vasculaire anastomose te bevorderen.
    2. Breng met behulp van een P20 4 μL laminine in elk microfluïdisch kanaal (boven en onder) van het apparaat. Steek de pipetpunt in M1 of M3 en verwijder het laminaat langzaam, let erop dat het laminaat het hele bovenste kanaal bedekt en herhaal dit voor M2 of M4 om het hele onderste kanaal te coaten.
    3. Bepaal de oriëntatie door laminine te pipetteren vanaf de kant tegenover de drukregelaar om voldoende druk te laten om het erdoor te duwen. Als laminine echter niet gemakkelijk van de ene kant reist, verwijder dan de punt van de ene kant en duw het laminine van de andere kant. Het kan nodig zijn om naar de tweede stop van de pipet te gaan (d.w.z. de zuiger helemaal naar beneden te duwen) om voldoende druk te genereren om het laminine door het hele kanaal te duwen.
    4. Verwijder de punt voorzichtig van de media-inlaat/-uitlaat. Gebruik de uitwerpknop op de P20 niet.
    5. Herhaal stap 3.5.1-3.5.4 voor elk apparaat en incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 10 min.
  6. Media toevoegen (Timer = beginnen op ongeveer 1 h 10 min)
    1. Voeg 275 μL EGM2 complete media toe aan de ontkoppelde mediareservoirs van putten in rijen A en B of G en H. Dit zal de hoge kant zijn, en de oriëntatie moet worden bepaald door de putten aan de kant tegenover de drukregelaar hoog volume te maken om te beginnen. Media worden door de zwaartekracht van de hoge kant geduwd.
    2. Breng met behulp van een P200-pipet 75 μl media in de mediuminlaten/-uitlaten van de putjes die de 275 μl EGM2 bevatten. Steek de punt in het media-inlaatgat en verdrijf het medium langzaam, waarbij u ziet dat het medium door het kanaal reist en aan de andere kant opborrelt.
    3. Verwijder de pipetpunt en duw het resterende medium van de punt in het mediareservoir, zodat het totale volume aan de hoge kant 350 μL bedraagt.
    4. Herhaal stap 3.6.1-3.6.3 voor elke apparaateenheid, boven- en onderkanaal.
    5. Voeg 50 μL media toe om de lage kant volledig te bedekken, putjes in rijen A en B of G en H, afhankelijk van de hierboven beschreven oriëntatie. Zorg ervoor dat er een gelijkmatige laag media op de bodem van de put ligt. Zie afbeelding 2D voor een schema met de mediavolumes in de reservoirs.
  7. Luchtbellen verwijderen (naladen)
    NOTITIE: Het verwijderen van luchtbellen is een cruciale stap om een goede doorstroming in elk apparaat te garanderen. Op dag 2 beginnen endotheelcellen en fibroblasten zich uit te strekken als reactie op de stroming (Figuur 2E).
    1. Zodra alle media zijn toegevoegd, incubeert u de platen gedurende 1-2 uur in een incubator van 37 °C met 5% CO2 voordat u controleert op luchtbellen in de kanalen of bij de middelgrote inlaten/uitlaten.
    2. Visualiseer bellen in de mediakanalen op de microscoop en verdrijd ze door 75 μL media opnieuw in de kanalen te brengen om de bubbels naar buiten te duwen.
    3. Visualiseer luchtbellen in de medium inlaten/uitlaten met het oog. Gebruik een P200-pipet om luchtbellen te verwijderen die vastzitten bij de middelgrote inlaten en uitlaten door de zuiger naar beneden te duwen, de punt in het gat te steken en de luchtbel eruit te trekken door de zuiger op te tillen om negatieve druk uit te oefenen en de luchtbel op te zuigen.

figure-protocol-2
Figuur 2. Schema van het laden van het apparaat. (A) Met behulp van een P20-pipet wordt het cel/fibrinemengsel via een van de laadpoorten in de weefselkamer van elk apparaat gebracht. (B) Brightfield-microfoto toont een microfluïdisch apparaat geladen EC, fibroblasten en kankercellen om een VMT te vormen. Schaalbalk = 500 μm. (C) Fluorescentiemicrofoto van het apparaat in B met EC in rood, tumor in cyaan en fibroblasten in blauw. (D) Het schema toont de toevoeging van medium aan de reservoirs, met 350 μL aan de hoge kant en 50 μL aan de lage kant om de hydrostatische drukhoogte te genereren. (E) Dag 2 van de VMT-kweek laat zien dat fibroblasten en EC zich beginnen uit te strekken om het vasculaire netwerk te vormen. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Apparaatonderhoud en experimentele toepassingen

  1. Onderhoud en medicamenteuze behandeling
    OPMERKING: Om het debiet in het systeem te behouden, moet de hydrostatische druk dagelijks worden hersteld door het volume van de media van de lage kant terug naar de hoge kant te pipetteren of vice versa, zodat het totale volume aan de hoge kant op 350 μL blijft. De stroomrichting wordt elke dag na dag 2 van de VMO- of VMT-vestiging gewijzigd. Aanvullende onderhouds- en behandelingsdetails vindt u hieronder.
    1. Wissel om de dag van media met EGM2 voltooid totdat het vaatstelsel volledig is vastgesteld (dag 5-6). Oude media volledig opzuigen en hogedrukputten (350 μL) en lagedrukputten (50 μL) vervangen.
      OPMERKING: Experimentele bepaling van geoptimaliseerde mediaformuleringen kan worden uitgevoerd voor andere celtypen, vaak met een 50:50-mix of toevoeging van specifieke componenten aan EGM2.
    2. Zodra het vasculaire netwerk is gevormd en het weefsel volledig is ontwikkeld (dag 4-7), voert u een dextraanperfusietest uit voordat u de apparaten voor experimenten gebruikt (stap 4.2.1.). Gebruik alleen apparaten die voldoende perfusie in de weefselkamer hebben.
    3. Voor experimenten met therapieën maakt u op de dag dat de behandeling begint beelden in alle fluorescerende kanalen voor elk apparaat. Dit zal als uitgangspunt dienen.
    4. Behandel apparaten met de gewenste therapie door het medium te vervangen door vers medium dat het verdunde medicijn in de gewenste concentratie bevat. Zorg ervoor dat medicijnen worden verdund in geschikte voertuigen, afhankelijk van de aanbeveling van de fabrikant, maar niet hoger zijn dan 0.01% DMSO in de media.
    5. Stel apparaten gedurende de gewenste tijd (meestal 48 uur, maar kan worden geïnformeerd door farmacokinetiek).
    6. Breng elk kanaal van elk apparaat in beeld met het gewenste tijdsinterval om de respons op de behandeling te controleren. Houd de platen gedurende de duur van het experiment op de in stap 4.1.1 aangegeven waarden.
    7. Aan het einde van het experiment, bleekplaten en plaats ze in een container voor biologisch gevaar, fixeer ze met 4% PFA voor immunofluorescerende kleuring (stap 4.3.), of oogst ze voor isolatie van levende cellen of RNA (stap 4.4.).
  2. Perfusie testen
    1. Perfusie van dextraan
      OPMERKING: Vasculaire permeabiliteit/doorgankelijkheid kan worden bepaald door het vasculaire netwerk te perfuseren met fluorescerend gelabeld dextran met verschillende molecuulgewichten (40 kD, 70 kD of 150 kD). FITC- of rhodamine-dextran kan worden gebruikt, afhankelijk van het fluorescerende label van de EC.
      1. Bepaal voorafgaand aan de perfusie de juiste blootstelling van het FITC- of rhodaminekanaal door een paar μL dextran toe te voegen in het fluïdische kanaal of de kamer van een leeg apparaat. Stel de belichtingstijd net onder het verzadigingsniveau in met behulp van microscoopsoftware om een histogram van pixelintensiteiten weer te geven, waardoor een dynamisch bereik wordt gegarandeerd dat wordt gekenmerkt door gelijkmatig verdeelde pixels zonder enige noemenswaardige concentratie van hoge intensiteitswaarden.
      2. Maak microfoto's van alle apparaten in interessante kanalen, inclusief een achtergrondafbeelding van alle apparaten in het fluorescerende dextrankanaal, om te kalibreren tegen de achtergrond. Gebruik dezelfde belichting als hierboven bepaald en lijn de weefselkamer uit in het midden van het beeldkader om consistente beelden voor kwantificering te garanderen.
      3. Bereid een hoofdvoorraad FITC-dextran of rhodamine-dextran in een concentratie van 5 mg/ml in 1x DPBS. Deze voorraad kan op 4 °C bewaard worden.
      4. Om een werkbouillon te bereiden, verdunt u 5 mg/ml bouillon tot een eindconcentratie van 50 μg/ml in EGM2.
      5. Vervang de media in de reservoirs door de verdunde dextraanoplossing als half maximaal volume (175 μL in één putje en de hoge kant op het bovenste of onderste kanaal van de weefselkamer). Vervang de media in de andere putjes zodat de ontkoppelde hoge kant 175 μL verse EGM2 krijgt zonder dextran, en de putjes aan de lage kant slechts 50 μL in elk.
        OPMERKING: Dextran mag slechts aan één kant van de microfluïdische kanalen (boven of onder) worden toegevoegd om visualisatie mogelijk te maken van de kleurstof die door de hogedrukzijde, in het vaatbed en uit de lagedrukzijde reist.
      6. Kijk onder de microscoop of het fluorescerende dextran door het vasculaire netwerk stroomt. Dit gebeurt meestal binnen ongeveer 2 minuten na het toevoegen van de kleurstof aan het mediareservoir.
      7. Begin met het in beeld brengen van het fluorescerende dextraankanaal (en andere kanalen, indien gewenst). Dit is T = 0 tijdstip. Maak extra foto's op meerdere tijdstippen (meestal elke 10 minuten) of een afbeelding met één eindpunt.
    2. Perfusie van cellen
      OPMERKING: Afhankelijk van de onderzoeksopzet kunnen verschillende celtypen door het vaatstelsel worden geperfuseerd, waaronder lymfocyten of macrofagen voor kankerimmunologische onderzoeken, evenals kankercellen voor metastasestudies. Cellen moeten fluorescerend worden geëtiketteerd om het volgen in de loop van de tijd te vergemakkelijken.
      1. Voer ten minste 2 uur voor het perfuseren van cellen dextraanperfusie uit op alle apparaten zoals hierboven beschreven. Deze stap is belangrijk om de doorgankelijkheid van de bloedvaten te bepalen voordat cellen worden toegevoegd.
      2. Bepaal de juiste camerabelichting voor de cellen die moeten worden geperfuseerd. Neem een klein monster van cellen om onder de microscoop te bekijken en stel de belichtingstijd voor die fluorescerende marker in. Stel de belichtingstijd in net onder het verzadigingsniveau.
      3. Maak microfoto's van alle apparaten in interessante kanalen, inclusief een achtergrondafbeelding van alle apparaten in het fluorescerende dextrankanaal, om te kalibreren tegen de achtergrond. Gebruik dezelfde belichting als bepaald in stap 4.2.2.1.
      4. Controleer of dextran volledig uit de weefselkamers is gediffundeerd voordat de cellen worden geoogst voor perfusie. Oogst en tel de cellen die van belang zijn.
      5. Resuspendeer cellen met de juiste dichtheid in EGM2. T-cellen worden bijvoorbeeld meestal toegevoegd in ongeveer 1 x 106 cellen/ml om de concentratie in het bloed na te bootsen.
        OPMERKING: EC zijn gevoelig voor mediasamenstelling, maar kunnen tot 50% mengen met de meeste andere media. Test vooraf.
      6. Voeg 175 μL celsuspensie toe aan het ene putje aan de hoge kant van elk apparaat en voeg 175 μL EGM2 compleet toe aan het andere putje. Voeg aan de lage kant 50 μL EGM2 complete media toe aan beide putjes.
      7. Kijk onder de microscoop of de fluorescerende cellen door het vasculaire netwerk stromen. Dit gebeurt meestal binnen ongeveer 2 minuten na het toevoegen van de cellen aan het mediareservoir.
      8. Zodra de celstroom tot stand is gebracht, begint u met het in beeld brengen van het fluorescerende celkanaal (en andere kanalen, indien gewenst). Dit is T = 0 tijdstip. Maak extra foto's op meerdere tijdstippen of een afbeelding met één eindpunt, afhankelijk van de onderzoeksopzet. Beeldvorming om de 10 minuten zal bijvoorbeeld resulteren in tijdverloop met hoge resolutie of elke 6-12 uur om periodieke celbewegingen te volgen.
  3. Immunofluorescerende (IF) kleuring
    1. Zuig media op uit putten. Voeg 200 μL 4% PFA toe aan beide putjes aan de hoge kant van elke apparaateenheid en 50 μL aan de lage kant. Laat PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur of 30 minuten bij 4°C door de kamers stromen.
    2. Maak tijdens de incubatie een plaat met 24 putjes met 500 μL 1x PBS per putje. Bereken hoeveel putjes er nodig zijn om elk apparaat te beitsen.
    3. Verwijder PFA volledig uit putten. Draai de plaat ondersteboven en verwijder voorzichtig de plastic achterkant van het membraan.
      NOTITIE: IF-kleuring kan ook ter plaatse worden uitgevoerd zonder het membraan en het apparaat te verwijderen. Om dit te doen, voert u kleuringsstappen uit door reagentia door de VMO/VMT te perfuseren en de duur van elke incubatiestap met ongeveer 6 keer te verlengen.
    4. Trek heel voorzichtig en voorzichtig de onderste membraanlaag van de functielaag van het apparaat om de weefselkamers bloot te leggen door beide hoeken vast te pakken en in een langzame en vloeiende beweging naar beneden te trekken. Het grootste deel van het weefsel moet in de weefselkamer blijven. Zie figuur 3A.
    5. Gebruik een scheermesje of scalpel om voldoende kracht uit te oefenen om volledig door de functielaag te snijden en snijd een kleine rechthoek rond elke afzonderlijke apparaateenheid, zoals weergegeven in afbeelding 3B.
    6. Klem een spatel tussen de kenmerklaag en de putplaat. Oefen lichte druk uit onder de kenmerklaag om voorzichtig de hele kenmerklaag met de weefselkamer van de putplaat te verwijderen.
    7. Plaats elk rechthoekig stuk PDMS-kenmerklaag met het weefsel met de voorkant naar beneden in een enkel putje met PBS.
    8. Zodra alle units zich in de put bevinden, wast u met PBS door de plaat gedurende 5 minuten op een zachte tuimelaar te plaatsen, PBS uit de put op te zuigen en te vervangen door 500 μL verse PBS. Herhaal dit voor een totaal van 3 wasbeurten.
    9. Aspireer PBS uit elk putje en permeabiliseer weefsels met 500 μL 0,5% Triton-X in PBS, 2x gedurende 10 minuten elk op een zachte rocker. Verwijder de permeabilisatie-oplossing.
    10. Blokkeer 500 μL 10% serum in 0,1% Triton-X per apparaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schommelen.
    11. Verdun primaire antilichamen in 3% serum in 0,1% Triton-X tot de gewenste concentratie en volume. Verwijder de blokkerende oplossing en voeg voldoende primaire antilichaamoplossing toe om de bodem van elk putje volledig te bedekken en vrije beweging van de apparaatweefsels mogelijk te maken (~200 μL). Dek de plaat af met een transparante folie.
    12. Incubeer de plaat een nacht schommelend bij 4 °C. Breng de volgende dag de plaat met apparaattissues terug op kamertemperatuur (~15 min).
    13. Zuig de primaire antilichaamoplossing op uit elke put en waskamers met 500 μL PBS, 3x gedurende 5 minuten elk op een zachte wip.
    14. Voeg 200 μL secundair antilichaam toe in 3% serum in 0,1% Triton-X in de gewenste concentratie. Incubeer de plaat met zacht schommelen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
    15. Zuig secundaire antilichaamoplossing op en was met PBS, 3x gedurende 5 minuten elk met zacht schommelen. Voeg een oplossing van 1x DAPI in 0,1% Triton-X toe gedurende 10 minuten terwijl je schommelt in het donker.
    16. Verwijder rechthoekige apparaatuitsparingen met bevlekte tissues van de plaat met een pincet en leg ze met de tissuekant naar boven op keukenpapier.
    17. Pipetteer een paar μL (~10 μL) antifade-oplossing rechtstreeks op elke kamer en het dekglaasje en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Laat antifade 's nachts bij kamertemperatuur in het donker uitharden op kamers en ga dan verder met beeldvorming.
  4. Weefsel- en celisolatie voor moleculaire assays
    OPMERKING: Elke plaat met hoge doorvoer bevat ongeveer 1-2 x 105 cellen, afhankelijk van het tijdstip van de oogst. Schaal het aantal experimentele replicaten om rekening te houden met het totale aantal cellen en het potentiële verlies tijdens het oogsten.
    1. Single-cell analyses
      1. Zuig media uit elke put op en keer de plaat met hoge doorvoer om zodat de apparaatlaag naar boven wijst.
      2. Verwijder de plastic achterkant van het membraan. Trek heel voorzichtig en voorzichtig het PDMS-bodemmembraan van de functielaag van het apparaat om de weefselkamers bloot te leggen door beide hoeken vast te pakken en in een langzame en vloeiende beweging naar beneden te trekken.
      3. Het membraan kan zelfs met de juiste hechting worden verwijderd. Het grootste deel van het weefsel moet in de weefselkamer blijven na het verwijderen van het membraan; Als er echter een deel aan het membraan vastzit, volg dan de onderstaande stappen op het membraan zelf.
      4. Was elke apparaateenheid met 500 μL HBSS of PBS. Voeg aan elke apparaateenheid 100 μL dissociatiereagens toe en laat het als een druppel op het apparaat zitten. Zet de plaat 5 minuten terug in de incubator van 37 °C.
      5. Gebruik na de spijsvertering een P200-pipet om op en neer door de weefselkamers te pipetteren en de weefsels in het dissociatiereagens te verzamelen. Beweeg de pipetpunt heen en weer over elk apparaat om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig wordt verwijderd en verzamel het in een conische van 15 ml met 500 μL EGM2 om het dissociatiereagens te neutraliseren.
      6. Om de resterende cellen volledig uit de weefselkamer te verwijderen, voegt u 500 μL EGM2 toe aan elke apparaateenheid en wast u deze met een P200-pipet.
      7. Centrifugeer de digestieoplossing met de losgeraakte weefsels bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om afzonderlijke cellen en hele weefsels te pelleteren.
      8. Zuig de media voorzichtig op en voeg 500 μL collagenase type IV van 1 mg/ml (200 E/ml) collagenase type IV, 0,1 mg/ml hyaluronidase type V en 200 E/ml DNAse type IV in HBSS toe aan de weefsels.
      9. Laat de oplossing na een zachte resuspensie 2 minuten op kamertemperatuur staan voordat u opnieuw voorzichtig pipettert om de gel te dissociëren.
      10. Was het digestiemengsel met 10 ml EGM2 en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g bij 4 °C. Resuspendeer cellen in 1x DPBS met 1% BSA of HSA en passeer ze door een vooraf bevochtigd filter van 70 μm door gedurende 1 minuut te centrifugeren op 200 x g .
      11. Tel de cellen en pas het volume aan zodat de uiteindelijke concentratie 1000 cellen per μL is. Cellulaire suspensies kunnen vervolgens worden onderworpen aan FACS, flowcytometrie of single-cell RNA-sequencing.
    2. RNA-isolatie uit hele weefsels
      1. Volg de stappen 4.4.1.1 en 4.4.1.2 hierboven.
      2. Voeg ongeveer 10 μL RNA-lysisbuffer toe aan elke blootgestelde weefselkamer en zorg ervoor dat de buffer zich direct op de weefsels verzamelt. Gebruik in totaal niet meer dan 100 μL RNA-lysisbuffer.
      3. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik de P20 om op en neer te pipetteren op elke apparaateenheid en gebruik indien nodig de pipetpunt om eventueel achtergebleven materiaal uit de weefselkamer te schrapen.
      4. Breng zoveel mogelijk lysisbuffer over in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Herhaal de stappen 4.4.2.2.-4.4.2.3. voor resterende apparaten en poolmonsters in de buis van 1,5 ml.
      5. Volg de instructies van de fabrikant voor het isoleren van RNA, afhankelijk van de kit of reagentia.

figure-protocol-3
Figuur 3. Voorbereiding van het platform voor immunokleuring. (A) Schema van volledig geassembleerd apparaatplatform met membraanlaag erop. Om het membraan te verwijderen, trekt u voorzichtig elke hoek van de buitenste laag naar beneden in een gestage, zachte beweging. (B) Zodra de membraanlaag volledig is verwijderd, gebruikt u een mes, scalpel of mes om rechthoeken rond de weefselkamer van elke apparaateenheid te snijden, waarbij u ervoor zorgt dat u niet in het weefsel zelf snijdt. Een spatel kan dan onder elke rechthoek worden geklemd om deze van de plaat los te maken en elke eenheid in een enkel putje van een bord met 24 putjes te plaatsen met PBS om te kleuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In navolging van de hier beschreven protocollen werden VMO's en VMT's opgericht met behulp van commercieel gekochte EC, NHLF en, voor VMT, de triple-negatieve borstkankercellijn MDA-MB-231. Gevestigde VMO's werden ook doorbloed met kankercellen om metastase na te bootsen. In elk model assembleert een vasculair netwerk zichzelf op dag 5 van de cocultuur als reactie op door zwaartekracht aangedreven stroming door de weefselkamer, en dient het als een kanaal voor in vivo soortgelijke afgifte van voedingsstoffen, th...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bijna elk weefsel in het lichaam ontvangt voedingsstoffen en zuurstof via het vaatstelsel, waardoor het een cruciaal onderdeel is voor realistische ziektemodellering en screening van geneesmiddelen in vitro. Bovendien worden verschillende maligniteiten en ziektetoestanden gedefinieerd door vasculaire endotheliale disfunctie en hyperpermeabiliteit3. Met name bij kanker is tumor-geassocieerde vasculatuur vaak slecht doorbloed, verstoord en lek, waardoor het fungeert als een barrière voor th...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CCWH heeft een aandelenbelang in Aracari Biosciences, Inc., dat een versie van de in dit artikel beschreven technologie op de markt brengt. De voorwaarden van deze overeenkomst zijn herzien en goedgekeurd door de University of California, Irvine, in overeenstemming met haar beleid inzake belangenconflicten. Er zijn geen andere belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de leden van het laboratorium van Dr. Christopher Hughes voor hun waardevolle inbreng in de beschreven procedures, evenals onze medewerkers in het laboratorium van Dr. Abraham Lee voor hun hulp bij het ontwerp en de fabricage van het platform. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) en TL1 TR001415 en W81XWH2110393 (SJH).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fabricage
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilaan, 95% Sigma-Aldrich175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene MicroplatesGreiner Bio-One655096
Methanol ≥99,8% ACSVWR Chemicals BDHBDH1135-1LP
MILTEX steriele wegwerpbare biopsie punch met plunjer, 1mm diameter,Integra Miltex33-31AA-P/25
PDMS membraanPAX IndustriesHT-6240
Plasma Cleaner PDC-001Harrick PlasmaN/A
Smooth-Cast 385Smooth-OnN/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonaat Kaststijl Vacuum DesiccatorBel-ArtF42400-4031
Standaard deksels met condensatieringen, 96-well plateVWR82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)Dow4019862
Celcultuur/Beladen
BioTek Lionheart FX Geautomatiseerde MicroscoopAgilent CYT5MFAW
CELLvo Human Endotheel Progenitor CellenStemBioSysN/A
Collagene I, rattenstaartEnzo Life Sciences
Collagenase uit Clostridium histolyticum (type 4)Sigma-AldrichC5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X zonder calcium en magnesiumCorning21-021-CV
Corning DMEM met L-Glutamine, 4,5g/L Glucose en Sodium PyruvaatCorning10013CV
DAPISigma-AldrichD9542
DPBS, geen calcium, geen magnesiumGibco14190144
EGM-2 Endotheelcelgroeimedium-2 BulletKitLonzaCC-3162
Fibrinogeen uit runderplasmaNeta ScientificSIAL-341573
Fibronectine uit humaan plasmaSigma-AldrichF0895
Fluoresceïne isothiocyanate–dextran (70kDa)Sigma-AldrichFD70S-1G
Gelatine uit varkenshuidSigma-AldrichG1890
Hyaluronidase uit schapentesten (type 4)Sigma-AldrichH6254
Laminine Muis ProteïneGibco23017015
Leica TCS SP8LeicaN/A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
NHLF – Normal Human Lung FibroblastsLonzaCC-2512
Nikon Eclipse TiNikonN/A
Paraformaldehyde 4% in 0,1M Fosfaat BufferSaline, pH 7,4Electron Microscopy Sciences 15735-90-1L
PBMCs - Perifere bloed mononucleaire cellenLonzaCC-2702
PBS, pH 7,4Gibco10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat InactivatedAvantor Seradigm97068-091
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144
Quick-RNA Microprep KitZymo ResearchR1051
Trombine uit runderplasmaSigma-AldrichT4648
Triton X-100 (Electrophoresis),Fisher BioReagentsBP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), fenol roodGibco12605028
Trypsin-EDTA (0,05%), fenol roodGibco25300062
VasculifeLifeline Cell TechnologyLL-0003

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  2. Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
  3. Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
  4. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
  5. Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
  6. Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798(2021).
  7. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  8. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589(2016).
  9. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
  10. Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
  11. Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
  12. Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601(2020).
  13. Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760(2022).
  14. Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
  15. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng - Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  16. Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
  17. Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
  18. Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
  19. Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  22. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385(2011).
  23. Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618(2020).
  24. Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
  25. COMSOL Multiphysics. , Stockholm, Sweden. www.comsol.com (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gevasculariseerde microtumorTumormicro omgevingMicroflu disch platformTumorchipDynamische stromingEndotheelcellenExtravasatie van immuuncellenGepersonaliseerde geneeskundeTumorheterogeniteitHoge resolutie beeldvorming

Gerelateerde artikelen