Het voorlopige onderzoek bevestigt dat subarachnoïdale bloeding (SAH) het overlijden van de pericyten in de hersenen veroorzaakt. Het evalueren van de contractiliteit van pericyten na SAH vereist differentiatie tussen levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten. Daarom is er een procedure ontwikkeld om levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten gelijktijdig in hersensecties te labelen, waardoor observatie met behulp van een confocale microscoop met hoge resolutie wordt vergemakkelijkt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beeldvorming van vitale en niet-vitale hersenpericyten in hersenplakjes na een subarachnoïdale bloeding
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pericyten zijn cruciale wandcellen die zich in de cerebrale microcirculatie bevinden en cruciaal zijn voor het actief moduleren van de cerebrale bloedstroom via contractiliteitsaanpassingen. Conventioneel wordt hun contractiliteit gemeten door het observeren van morfologische verschuivingen en nabijgelegen capillaire diameterveranderingen onder specifieke omstandigheden. Toch komt de fixatie na weefsel, het evalueren van de vitaliteit en de daaruit voortvloeiende contractiliteit van de pericyten van de afgebeelde hersenpericyten in het gedrang. Evenzo schiet het genetisch labelen van hersenpericyten tekort in het onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare pericyten, met name bij neurologische aandoeningen zoals subarachnoïdale bloeding (SAH), waar ons voorlopige onderzoek de dood van hersenpericyten valideert. Er is een betrouwbaar protocol bedacht om deze beperkingen te overwinnen, waardoor gelijktijdige fluorescerende tagging van zowel functionele als niet-functionele hersenpericyten in hersensecties mogelijk wordt. Deze labelmethode maakt confocale microscoopvisualisatie met hoge resolutie mogelijk, waarbij tegelijkertijd de microvasculatuur van de hersenplak wordt gemarkeerd. Dit innovatieve protocol biedt een middel om de contractiliteit van de pericyten in de hersenen, de impact ervan op de capillaire diameter en de pericytenstructuur te beoordelen. Het onderzoeken van de contractiliteit van de pericyten in de hersenen binnen de SAH-context levert een inzichtelijk begrip op van de effecten ervan op de cerebrale microcirculatie.
Inleiding
Hersenpericyten, die zich onderscheiden door hun slanke uitsteeksels en uitstekende cellichamen, omringen de microcirculatie 1,2. Terwijl de vergroting van de cerebrale bloedstroom voornamelijk wordt aangedreven door capillaire verwijding, vertonen kleinere slagaders langzamere verwijdingssnelheden3. De contractiliteit van pericyten oefent invloed uit op de capillaire diameter en de morfologie van pericyten, wat van invloed is op de vasculaire dynamica4. Samentrekking van hersenpericyten leidt tot capillaire vernauwing en in pathologische scenario's kan overmatige contractie de erytrocytenstroom belemmeren5. Verschillende factoren, waaronder noradrenaline die vrijkomt uit de locus coeruleus, kunnen samentrekking van de pericyten in de hersenen in haarvaten induceren6. Met een regulerende rol in de cerebrale bloedstroom, vertonen pericyten 20-HETE-synthese, die dient als zuurstofsensor tijdens hyperoxie7. Oxidatieve-nitratieve stress-getriggerde samentrekking van hersenpericyten heeft een nadelige invloed op de haarvaten5. Ondanks zowel in vivo als ex vivo onderzoek naar samentrekking van pericyten in de hersenen8, blijft er beperkte kennis bestaan over de beeldvorming van levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten in hersenplakjes.
Cruciaal is dat beeldvorming van hersenpericyten na weefselfixatie hun vitaliteit en de daaropvolgende contractiliteitsbeoordeling in gevaar brengt. Bovendien, in scenario's zoals neurologische aandoeningen (bijv. subarachnoïdale bloeding - SAH), maakt transgene etikettering van hersenpericyten geen onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare pericyten, zoals bevestigd door onze voorlopige SAH-geïnduceerde hersenpericytensterfte9.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, gebruikten we TO-PRO-3 om levende pericyten te labelen, terwijl overleden pericyten werden gekleurd met propidiumjodide (PI). We gebruikten confocale beeldvormingstechnologieën met hoge resolutie om levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten in hersenplakjes te visualiseren met behoud van schijfactiviteit tijdens beeldvorming. Dit artikel heeft tot doel een reproduceerbare methode te presenteren voor het afbeelden van levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten in hersenplakjes, die dienen als een waardevol hulpmiddel om de impact van hersenpericyten op de cerebrale microcirculatie na SAH te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het experimentele protocol is goedgekeurd door de Animal Ethics and Use Committee van de Kunming Medical University (kmmu20220945). Sprague-Dawley (SD) ratten van beide geslachten, 300-350 g, werden gebruikt voor de huidige studie.
1. Induceren van het SAH-model
- Verdoof de ratten met 2% isofluraan en 100% zuurstof. Handhaaf de anesthesie door continue inhalatie-anesthesie te geven met isofluraan (1%-3%). Zet de kop van de rat vast met behulp van een stereotaxisch apparaat (zie Materiaaltabel).
- Maak het SAH-model door de onderstaande stappen te volgen.
- Steek een micro-injectienaald in de suprasellaire stortbak. Injecteer vervolgens autoloog bloed uit de staartslagader van de rat (zonder antistollingsmiddel) in de suprasellaire stortbak met behulp van een spuitpomp (zie Tabel met materialen).
- Implanteer een micro-injectienaald in de rechter laterale hersenventrikel met behulp van de genoemde coördinaten: bregma, −0,8 mm; lateraal, 1,4 mm; diepte, 4 mm9. Injecteer voor SAH-groepen 0,2 ml bloed van de rattenstaartslagader. Dien voor schijngroepen hetzelfde volume isotone zoutoplossing toe (Figuur 1A).
2. Voorbereiding en stabilisatie van hersenplakjes
- Verdoof de ratten diep met 2% isofluraan inhalatie. Haal na de onthoofding de hele hersenen eruit en dompel ze onder in ijskoude kunstmatige hersenvloeistof (ACSF).
OPMERKING: Gebruik vers bereide ACSF-oplossingen met de volgende samenstelling: 134 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1.1 mM NaH 2 PO 4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2 en 10.11 mM D-Glucose (zie Materiaaltabel). Houd een pH tussen 7,3 en 7,4 aan. - Gebruik een vibratoom (zie Tabel met materialen) om acute hersenplakjes met een dikte van 200 μm van de SD-ratten te bereiden in ijskoude ACSF die wordt belucht met 5% CO 2 en 95% O 2 (Figuur 2).
- Plaats de 200 μm dikke acute hersenplakjes in een opslagkamer op een nylon gaas ondergedompeld in ACSF. Breng de ACSF-oplossing in evenwicht met 95%O2 en 5% CO2 en handhaaf een temperatuurbereik van 35-37 °C. Laat de hersenplakjes gedurende 2 uur stabiliseren en geef ze de tijd om zich aan te passen (Figuur 3).
3. Labelen van pericyten in acute hersenplakjes met TO-PRO-3
OPMERKING: Perocyten van acute hersenplakjes werden fluorescerend gelabeld met behulp van de tracer TO-PRO-310.
- Voeg de fluorescerende kleurstof TO-PRO-3 toe aan de ACSF en bereik een eindconcentratie van 1 μM. Incubeer de acute hersenplakjes bij kamertemperatuur in een donkere omgeving met de TO-PRO-3-bevattende ACSF gedurende 20 minuten.
NOTITIE: Vergeet niet om latex handschoenen te dragen tijdens het hanteren van TO-PRO-3 ter bescherming. - Breng de nylon gaaszeef, met de hersenplakjes, over van de laadkamer naar een spoelkamer met 6 putjes (zie Materiaaltabel). Laat de hersenplakjes 10 minuten in de spoelkamer blijven (Figuur 4D).
OPMERKING: Deze spoelstap beëindigt het kleuringsproces, vermindert achtergrondetikettering en voorkomt niet-specifieke kleuring. - Spoel de preparaten in totaal 15 minuten met ACSF-oplossing die in evenwicht is met een mengsel van 5% CO 2 en 95% O2. Deze spoelstap stopt de opname van kleurstof en minimaliseert de etikettering op de achtergrond (Figuur 4C).
4. Kleuring van niet-vitale pericyten van cerebrale microcirculatie in acute hersenplakjes
- Incubeer hersenplakjes die vooraf zijn geladen met TO-PRO-3 bij 37 °C met isolectine B4 geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/ml, zie materiaaltabel) gedurende 30 minuten in een donkere omgeving. Spoel de hersenplakjes na incubatie gedurende 15 minuten in ACSF (Figuur 4E).
- Incubeer de hersenplakjes in ACSF vergast met 5% CO 2 en 95% O2 zoals gewoonlijk. Voeg propidiumjodide (PI) in een concentratie van 37 μM toe aan beide oplossingen bij 37 °C. Dit zal niet-vitale hersenpericyten labelen. Incubeer de preparaten in deze ACSF-oplossing gedurende 60 minuten in het donker (figuur 4F).
- Spoel de preparaten vervolgens gedurende 15 minuten met ACSF-oplossingen om de opname van kleurstof te stoppen en achtergrondetikettering te minimaliseren.
5. Beeldvorming van vitale en niet-vitale hersenpericyten in acute hersenplakjes
- Breng de plakjes hersenen voorzichtig over in confocale schaaltjes met glazen bodem (zie Tabel met materialen) met behulp van plastic pasteurpipetten. Vul de schalen met ACSF-oplossing die vooraf in evenwicht is gebracht met 5% CO 2 en 95 % O2. Gebruik een ijzeren gaas om de hersenschijfjes van ratten op hun plaats te houden.
- Breng de confocale schalen met glazen bodem over naar de tafel van een confocale microscoop. Plaats de acute hersenplak op de bodem van de schaal en doordrenk9 deze met ACSF-oplossing die is geëgaliseerd met een mengsel van 95%O2 en 5% CO2 tijdens confocale microscopiebeeldvorming (Figuur 5A en Figuur 5Ab').
- Visualiseer de wandcellen van de cerebrale corticale microvasculatuur met behulp van een 40x objectief. Leg beeldstapels vast met behulp van compatibele software (zie Materiaaltabel). Gebruik geschikte filters voor IB4 (excitatie/emissie 460 nm/520 nm), PI (excitatie/emissie 545 nm/595 nm) en TO-PRO-3 (excitatie/emissie 606 nm/666 nm) (Figuur 5D).
OPMERKING: Leg beelden vast met de volgende details: 40× DIC N1-objectieflens, 3 × 12 bit: 512 × 512 pixels (0,22 × 0,22 mm), kalibratie: 0,42 μm/px. - Identificeer cerebrale microvasculatuur en pericyten op basis van hun netwerk en morfologie. Lokaliseer een specifiek gebied met een cerebraal microvasculatuurnetwerk op elk hersenplakje en leg beelden vast.
- Noteer zorgvuldig de locatie van de beeldvorming om consistentie te garanderen bij volgende opnamen (Figuur 5B,C). Gebruik voor verdere verwerking en analyse beeldanalysesoftware (ImageJ) en fotobewerkingssoftware (zie Materiaaltabel).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Onder normale fysiologische omstandigheden ondergaan hersenpericyten over het algemeen geen celdood. Figuur 6 illustreert dit fenomeen, waarbij geel de aanwezigheid van vitale hersenpericyten aangeeft; hersenpericyten vertonen geen kleuring met PI, wat wijst op hun levensvatbaarheid. Om verder te onderzoeken of pericyten na celdood aan de microvasculatuur gehecht blijven, werden methoden gebruikt in een SAH-rattenmodel en werd daaropvolgende beeldvorming uitgevoerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn confocale beeldvormingstechnieken met hoge resolutie ontwikkeld voor het visualiseren van vitale hersenpericyten, niet-vitale hersenpericyten en de microvasculatuur in hersenplakjes. In acute plakjes hersenen van ratten omvat het proces de eerste labeling van pericyten met TO-PRO-311, gevolgd door microvasculaire endotheelcellen met IB412; vervolgens wordt de identificatie van overleden pericyten uitgevoerd met behulp van PI. Dit protocol is eenvoudig, reproduceerba...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); de Stichting voor Natuurwetenschappen van de provincie Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 6-well plate | ABC biochemie | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminiumfolie | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal beeldvormingssoftware | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gastank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Confocal schotel met glazen bodem | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Lijm | EVOBOND | KH-502 | RT |
| IJsmachine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Beeldanalysesoftware | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalatieanesthesiesysteem | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectine B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Bewaar aliquots bij –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteurpipet | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltiekpomp | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (jodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Bewaar aliquots bij –20 °C |
| Stereotactisch apparaat | SCIENCE | QA | RT |
| Spuitpomp | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostaat waterbad | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrerend microtoom | Leica | VT1200 | RT |
Referenties
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222(2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
