Methodenartikel

Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

DOI:

10.3791/65874

⸱

10 november 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Cancer Institute, and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de intrafemorale injectie van enkele hematopoëtische of leukemische stamcellen, waaronder gen-bewerkte cellen, in muizenxenotransplantaatmodellen, die niet alleen de snelle en veilige transplantatie van cellen mogelijk maken, maar ook seriële analyses van het beenmerg.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks de complexiteit van hematopoëtische celtransplantatie bij mensen, voeren onderzoekers vaak intraveneuze of intrafemorale (IF) injecties uit bij muizen. In muizenmodellen is deze techniek aangepast om de zaaiefficiëntie van getransplanteerde hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) te verbeteren. Dit artikel beschrijft een gedetailleerde stapsgewijze technische procedure van IF-injectie en de volgende beenmergaspiratie (BM) bij muizen die seriële karakterisering van cellen in de BM mogelijk maakt. Deze methode maakt de transplantatie mogelijk van waardevolle monsters met een laag aantal cellen die bijzonder moeilijk te transplanteren zijn door middel van intraveneuze injectie. Deze procedure vergemakkelijkt het maken van xenotransplantaten die cruciaal zijn voor pathologische analyse. Hoewel het gemakkelijker is om toegang te krijgen tot perifeer bloed (PB), weerspiegelt de cellulaire samenstelling van PB niet de BM, de niche voor HSPC's. Daarom zijn procedures die toegang bieden tot het BM-compartiment essentieel voor het bestuderen van hematopoëse. IF-injectie en seriële BM-aspiratie, zoals hier beschreven, maken het mogelijk om prospectieve extractie en karakterisering van cellen die in de BM zijn verrijkt, zoals HSPC's, op te halen en te karakteriseren zonder de muizen op te offeren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bloedsysteem wordt gedurende het hele leven in stand gehouden door hematopoëtische stamcellen (HSC's), die zich in het beenmerg bevinden (BM)1,2. Om dynamische veranderingen in de BM-omgeving te bestuderen, is het belangrijk om de biologie van zowel normale als kwaadaardige hematopoësete begrijpen 3,4. Transplantatie van HSC's rechtstreeks in humaan BM levert een hogere implantatie op dan infusie van perifeer bloed (PB), maar een hoge procedurele complexiteit en een verhoogd risico op infectie zorgen ervoor dat deze methode geen deel uitmaakt van de standaardpraktijk5. Bij muizen bieden procedures die de toegang tot BM vergemakkelijken zonder de dieren op te offeren, een hulpmiddel om hematopoëse serieel te controleren. De beschreven procedure is bedoeld om muizen te produceren met een hoge implantatie van getransplanteerde cellen en om seriële bemonstering van de BM van levende muizen mogelijk te maken. Dit artikel zal zich richten op het produceren van xenotransplantaatmodellen met behulp van immunodeficiënte muizen die zijn geënt met menselijke cellen, die moeilijker te produceren zijn dan allotransplantatiemodellen tussen muis en muis. Vergeleken met conventionele transplantatie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) via de staart of retroorbitale ader, zijn de voordelen van deze procedure een hoge cellulaire implantatie met een lage hoeveelheid uitgangsmateriaal.

Hoewel intrafemorale (IF) cellulaire injectie in de BM-holte van muizen vaak wordt gebruikt om menselijke HSPC's in vivote bestuderen 6,7,8, is een formele stapsgewijze procedure die deze techniek illustreert/filmt niet eerder gepubliceerd. Dit protocol maakt een hoge implantatie mogelijk van een laag aantal getransplanteerde cellen en een mechanisme om de BM serieel te bemonsteren. Bovendien is het mogelijk om deze methode te gebruiken om de effecten te analyseren van het rechtstreeks injecteren van medicijnen in de BM-holte op de behandeling van bloedziekten. De hier beschreven procedure helpt bij het verkrijgen van toegang tot BM waar hematopoëtische cellen zich bevinden zonder de muizen op te offeren.

Dit protocol is vergelijkbaar met de techniek die wordt gebruikt voor BM-aspiraties9. Het belangrijkste verschil is dat dit artikel en het bijbehorende videoprotocol een veilige procedure beschrijven voor het injecteren van cellen in het merg, terwijl eerdere artikelen cellen via de ader transplanteerden en vervolgens seriële BM-aspiratie uitvoerden. Dit protocol maakt succesvolle implantatie mogelijk met kleine aantallen van een cellijn (Figuur 1), normale navelstrengbloed (CB)-afgeleide HSPC's (CD34+) (Figuur 2) en HSC's (CD34+CD38-CD45RA-CD90+) (Figuur 3), normale BM-afgeleide HSPC's (CD34+CD38-) (Figuur 4), patiënt-afgeleide leukemische stamcellen (CD34+CD38-) (Figuur 5), CRISPR/Cas9 gen-bewerkte normale CB-afgeleide HSPC's (CD34+) (Figuur 6) en acute myeloïde leukemie (AML)-iPSC's (Figuur 7). Vooral voor de normale HSC's uit navelstrengbloed konden we met succes implantatie maken met slechts 10 cellen. Deze methode is vooral waardevol voor experimenten die worden uitgevoerd met zeldzame of moeilijk te genereren celpopulaties, zoals ongemodificeerde of genbewerkte primaire menselijke acute myeloïde leukemie of CB-cellen. Bovendien beschrijft deze procedure een efficiënte methode voor de seriële analyse van geënte cellen, die onmiddellijk kan worden gebruikt in stroomafwaartse experimenten. Om verspilling van waardevolle monsters te voorkomen en IF-injectie te garanderen, hebben we hier ook kort de op Akaluc gebaseerde procedure10-praktijken beschreven om deze techniek te helpen verstevigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zes tot tien weken oude mannelijke of vrouwelijke NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) muizen werden gebruikt in dit protocol, maar het kan op alle soorten muizen worden toegepast. De bestraling is afhankelijk van de experimentele inhoud en het type muizen, het al dan niet bestralen van de muizen is afhankelijk van de onderzoeksdoelstellingen. Alle hier beschreven dierprocedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en zijn goedgekeurd door het Administrative Panel on Lab Animal Care van Stanford University (APLAC #22264). Alle normale bloedcelpopulaties werden vers gesorteerd. Menselijke AML-monsters werden verkregen van patiënten in het Stanford Medical Center met geïnformeerde toestemming, volgens door de institutionele beoordelingsraad (IRB) goedgekeurde protocollen (Stanford IRB, 33818).

1. Intrafemorale injectie van cellijnen, hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) of leukemische stamcellen (LSC's)

OPMERKING: Om de geïnjecteerde cellen gemakkelijk te analyseren met een beeldvormingsapparaat, werd een Akaluc/tdTomato-positieve K562-cellijn gegenereerd en werd AkaLumine-HCl/Akaluc gebruikt als substraat10. Als er geen beeldvormingsapparatuur beschikbaar is, kunnen cellen worden gelabeld met een fluorescerende kleurstof door lentivirus of PiggyBac en worden geanalyseerd met flowcytometrie. Ongeacht de details van de celpreparatie, is het belangrijk om een manier te hebben om te bewijzen dat de cellen die in het beenmerg worden toegediend, op betrouwbare wijze de BM zijn binnengegaan voor het verbeteren van deze techniek (Figuur 1).

  1. Bereid celsuspensies (tot 3 × 106 bloedcellen) met 20 μL fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer (fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 2% foetaal runderserum (FBS) + 2 mM EDTA) of dooimedium (IMDM + 20% FBS + Pen/Streptokokken) in PCR of buisjes van 1,5 ml en bewaar op ijs voor injectie.
    NOTITIE: Vermijd het maken van luchtbellen tijdens het ophangen van de cellen met de naald. Bellen moeten zoveel mogelijk vlak voor de injectie worden verwijderd, omdat het injecteren van luchtbellen een plotselinge dood van muizen kan veroorzaken.
  2. Conditie 6-10 weken oude volwassen muizen met 200 cGy (225 kV, 13,3 mA, totaal 2 Gy [dosiscontrolemodus]) tot 48 uur voorafgaand aan de injectie van de cellen.
  3. Verdoof eerst de muizen met isofluraaninhalatie in een inductiekamer en houd ze op 2% isofluraan in 100% zuurstof met een stroomsnelheid van 1-2 l/min via een neuskegel om een stabiele toestand van anesthesie te bereiken. Controleer de diepte van de anesthesie met een teenknijpreflex en een langzame, gestage ademhaling, en behoud deze toestand tijdens de isofluraanprocedure.
    OPMERKING: Controleer tijdens de procedure elke 3-5 minuten de diepte van de anesthesie om er zeker van te zijn dat er geen verandering in hart- en ademhalingsfrequenties optreedt bij chirurgische manipulatie en/of beknelling van oor, teen en staart. De kleur van slijmvliezen en huid kan worden gebruikt als een indicator van oxygenatie, omdat ze roze zullen zijn als de muizen in goede conditie zijn. Wees voorzichtig wanneer er ondoorzichtige doeken over de muis worden geplaatst, omdat het niet altijd mogelijk is om te zien wat er met de muis gebeurt.
  4. Dien voorafgaand aan de procedure muizen met 10 mg/kg carprofen subcutaan toe om pijn te minimaliseren en verwarm 0,5-1,0 ml 0,9% zoutoplossing voor ondersteunende zorg.
  5. Breng oogzalf aan op de ogen van de muis om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  6. Houd de muis op een warmtekussen of een ander thermostatisch geregeld oppervlak om onderkoeling tijdens de procedure te voorkomen.
    OPMERKING: Na de procedure wordt een temperatuurregelbaar verwarmingskussen gebruikt. De lichaamstemperatuur van de muis is doorgaans 37-39 °C en de pad zou idealiter iets lager moeten zijn. In de praktijk wordt de temperatuur vaak ingesteld op 32-36 °C.
  7. Desinfecteer het hele been met het te injecteren dijbeen met drie sets afwisselende scrubs (afgewisseld met een povidon-jodium- of een chloorhexidinescrub en 70% met ethanol doordrenkte gaassponzen).
    OPMERKING: 1) Als de bediener linkshandig is, is het linkerdijbeen van de muis mogelijk gemakkelijker te injecteren dan het rechterdijbeen. 2) In deze studie werd de vacht niet verwijderd voor injecties om onnodige huidbeschadiging te voorkomen, en de plaats van de naaldinvoer kan gemakkelijk worden gelokaliseerd zonder de vacht af te snijden. Bij muizen met een donkere vacht kan het echter een uitdaging zijn om de prikplaats te lokaliseren, in welk geval kunt u overwegen de vacht af te knippen, aangezien het snel en gemakkelijk is om met de injectie te beginnen.
  8. Knijp zachtjes in het dijbeen met duim en wijsvinger om het been te stabiliseren. Duw met de ring of de vijfde vinger op het scheenbeen om het scheenbeen gebogen te houden ten opzichte van het dijbeen. Positionering is belangrijk voor een succesvolle injectie (aanvullende figuur S1-S5).
    OPMERKING: Gebruik een tang om in het bot te knijpen om letsel aan de vingers te voorkomen; Het kan echter moeilijk zijn om de schacht van het dijbeen te voelen en zal de procedure meer tijd geven.
  9. Steek een lege steriele naald van 27 G (1/2 inch) met een bevestigde spuit net onder de patellapees, zodat de naald stevig tussen de twee condylen van het dijbeen zit. Gebruik de rand van de naald en pik de patellapees een paar keer lichtjes op het dijbeen om de beste plaats te vinden om de naald in te brengen (aanvullende afbeelding S1-S5).
    OPMERKING: Kennis van de anatomie van het kniegebied van de muis is noodzakelijk voordat deze procedure wordt uitgevoerd. Beginners moeten de tijd nemen om de anatomie van het gebied te begrijpen en de procedure op een geëuthanaseerde muis oefenen voordat ze het op een levende muis proberen.
  10. Draai de naald naar buiten en naar boven om ervoor te zorgen dat deze evenwijdig is aan de schacht van het dijbeen.
    OPMERKING: Deze manoeuvre biedt een betrouwbaar pad naar de mergholte, vergemakkelijkt het ophalen van de merginhoud uit de dijbeenschacht en minimaliseert het ongemak voor het dier door de procedure.
  11. Draai de naald in cirkels terwijl je langzaam in de beenmergholte gaat. Steek de naald in totdat er een merkbare vermindering van de weerstand is. Bevestig de juiste positie van de naald door de spuit voorzichtig zijdelings te bewegen. Als het mogelijk is om de rand van de naald aan te raken met de vingers die buiten het bot komen, ga dan terug naar stap 1.9 en zoek een andere hoek en plaats om de naald naar beneden te boren.
    1. Zorg ervoor dat de intredehoek van de naald loodrecht op het botuiteinde staat.
      OPMERKING: Theoretisch moet de naald evenwijdig aan het dijbeen worden geïnjecteerd en in een hoek van 90° ten opzichte van de botuiteinden. Als er weerstand is van het inwendige oppervlak, is de naald correct in de dijbeenholte geplaatst. Om er zeker van te zijn dat de naald evenwijdig aan het bot is, plaatst u een lamp aan de zijkant van het bot en observeert u de schaduw van het bot evenwijdig aan de schacht van de naald. De afname van de weerstand bij binnenkomst in de beenmergholte hangt af van de leeftijd van de muis: hoe jonger de muis, hoe gemakkelijker het is om de afname van de weerstand te herkennen.
  12. Creëer onderdruk door de naaldzuiger voorzichtig naar achteren te trekken terwijl u de naald heen en weer beweegt in de BM-holte. Als de naald in de BM-holte zit, komt er wat bloed/merg uit de spuit.
    1. Als het bloed/merg niet wordt gezien, wissel dan naar een nieuwe naald en probeer dezelfde route te vinden.
      OPMERKING: De reden om over te stappen op een nieuwe naald is dat zodra het bot de naald verstopt, het moeilijk wordt om de terugstroming van het bloed/merg te controleren. Het minimaliseren van het aantal injectieroutes in de BM-holte is cruciaal, omdat cellen die in het beenmerg worden geïnjecteerd het potentieel hebben om via eerdere ingangspunten uit het dijbeen te lekken. Als er meerdere injectieroutes nodig zijn, kan het risico op lekken worden verminderd door cellen geleidelijk te injecteren in plaats van een snelle bolus.
  13. Verwijder de naald langzaam en breng de celhoudende spuit via dezelfde route in. Probeer de naald in te brengen totdat deze stopt (aan de rand van de BM-holte) en trek vanaf daar een klein beetje (1-2 mm) terug om de cellen gemakkelijk te injecteren. Voordat u de zuiger indrukt en de cellen loslaat, aspireert u lichtjes en controleert u op bloed/merg om er zeker van te zijn dat de naald correct wordt geplaatst. Controleer eerst de terugstroming van het bloed/merg en duw vervolgens langzaam op de spuit om de cellen te injecteren.
    OPMERKINGEN: Het is erg belangrijk om de route en hoek van de eerste injectie te onthouden wanneer u overschakelt op een nieuwe naald. Als dezelfde route niet kan worden gevonden, probeer het dan opnieuw met de originele naald die is gebruikt om de eerste route te maken. Op dit moment kan een nieuwe naald worden gebruikt, maar als de originele naald wordt gebruikt, moet het vastgelopen bot voor gebruik één keer naar buiten worden geduwd. Gebruik de naald met de cellen niet om een nieuwe injectieroute te vinden; Anders kunnen stukjes bot die in de naald vastzitten de verspreiding van de cellen verhinderen. Hoewel de BM-holte erg klein is, moet het injectievolume minder dan 30 μL zijn, rekening houdend met de dode holte.
    1. Zorg ervoor dat de injectiesnelheid laag is om te voorkomen dat lucht in de spuit het beenmerg binnendringt en om te voorkomen dat cellen uit de prikplaats lekken. Als u weerstand voelt tijdens het indrukken van de spuit, beweegt u de naald op en neer om een minder resistent gebied in de holte te vinden.
  14. Zodra de cellen met succes in het dijbeen zijn geïnjecteerd, verwijdert u de naald en spuit uit de muis terwijl u druk op de spuit houdt.
    OPMERKING: Probeer het opnieuw met het andere dijbeen als de injectie niet kan worden voltooid. De procedure is erg stressvol voor de muis, zelfs onder narcose. Houd altijd de vitale functies (hart en ademhalingsfrequentie) van de muis in de gaten en probeer de procedure zo snel mogelijk af te ronden.
  15. Haal de muis uit de neuskegel en leg deze op een schone papieren handdoek om opzuigen van beddengoed te voorkomen. Houd de muis tijdens het herstel op een verwarmingskussen of een ander thermostatisch geregeld oppervlak. Controleer alle muizen om het herstel van de anesthesie te controleren voordat u ze weer op het muizenrek plaatst.
    OPMERKING: Er mag geen complicatie of angst optreden na de aspiratie als het op de juiste manier wordt gedaan. De procedure zal worden voltooid wanneer verdoofde muizen zijn hersteld en in staat zijn om te lopen en voedsel en water te bereiken.
  16. Observeer de muizen gedurende de volgende 24 uur op tekenen van angst of infectie na de procedure. Tekenen van angst of infectie zijn onder meer constante bloedingen, bloedarmoede en lethargie. Als een van deze symptomen na de procedure wordt gezien, euthanaseer dan het dier of de dieren door CO2 -inademing of cervicale dislocatie volgens het protocol voor het omgaan met dieren.

2. Aspiratie van beenmergcellen uit het dijbeen voor de FACS-analyse

OPMERKING: De procedure voor het opzuigen van de BM-cellen van de muizen lijkt sterk op de methoden beschreven in sectie 1 en kan worden geleerd uit eerdere literatuur 9,11,12. Hieronder volgt een overzicht van enkele verschillen tussen de BM-injectie- en aspiratieprotocollen.

  1. Bereid 500 μL PBS + 10 mM EDTA (celsuspensiemedium: CSM) per monster voor het opschorten van de BM-aspiratie.
  2. Maak een spuit van 27 G van 0,5 ml nat met CSM voordat u de BM opzuigt. Vul de spuit met 200-500 μl CSM en laat deze onmiddellijk ontsnappen. Herhaal deze procedure 2-3x.
  3. Zuig de BM voorzichtig op door de zuiger op de spuit terug te trekken, wat 20-50 μl BM van de muis oplevert. Verwijder vervolgens de naald volledig uit het dijbeen en suspendeer het aangezogen monster in CSM (500 μl in een buis van 1.5 ml) voor de volgende kleurstap. Haal de muis uit de neuskegel en leg deze op een schone papieren handdoek om te voorkomen dat beddengoed tijdens het herstel wordt opgezogen. Controleer alle muizen om het herstel van de anesthesie te controleren voordat u ze weer op het muizenrek plaatst.
    OPMERKING: BM-aspiratie/bemonstering kan worden herhaald, maar de herhalingsprocedure op dezelfde dag moet op het andere dijbeen worden uitgevoerd om herhaald trauma aan hetzelfde been te voorkomen. Hoewel er weinig informatie is over de frequentie van BM-aspiratie, zijn we van mening dat femorale BM-aspiratie over het algemeen elke 4 weken wordt herhaald en in totaal minstens 3-4x kan worden uitgevoerd zonder problemen (bijv. infectie) op basis van onze ervaring. Houd er echter rekening mee dat het beenmerg aan de contralaterale zijde van het getransplanteerde beenmerg over het algemeen een lagere cellulaire implantatie heeft.
  4. Pelletcellen uit het beenmerg aspireren door 5 minuten centrifugeren bij 300 × g, 4 °C.
  5. Zuig de supernatant op, voeg 0,5-1 ml ACK-lysisbuffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) toe aan elke buis en vortex om de cellen opnieuw te suspenderen. Plaats 5-10 minuten op ijs.
  6. Filter elke buis door nylon gaas in een nieuwe buis.
  7. Spoel de tube af met 1 ml FACS-buffer en voeg deze via het nylon gaas ook toe aan een nieuwe tube.
  8. Pelletcellen 5 minuten centrifugeren bij 300 × g, 4 °C.
  9. Zuig het bovenstaande op en voeg de kleuringsoplossing toe die de gewenste antilichamen bevat13. Zet 20 minuten op ijs.
  10. Was de cellen en analyseer ze volgens de experimentele opstelling.
    1. Was de cellen met FACS-buffer (PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) en kleurde ze gedurende 30 minuten op ijs met antilichamen in een totaal volume van 50 μl. Was en kleurde de cellen met propidiumjodide (PI) in een eindconcentratie van 1 μg/ml onmiddellijk vóór de analyse of sortering. Voer analyses uit om de zuiverheid van de gesorteerde celpopulaties te verifiëren.
      OPMERKING: Alle antilichamen die worden gebruikt voor flowcytometrie worden beschreven in de materiaaltabel.
    2. Gebruik de volgende FACS-poortstrategieën (Figuur 2-7) om de getransplanteerde cellen uit het beenmerg van de muis te analyseren.
      1. Onderscheid populaties van cellen aan de hand van hun voorwaartse (grootte) en zijverstrooiing (granulariteit) eigenschappen.
      2. Voer doubletdiscriminatie uit door FSC-H versus FSC-W uit te zetten, volgens SSC-H versus SSC-W.
      3. Sluit dode cellen uit.
      4. Onderscheid populaties van cellen door menselijke CD45 en muis CD45. Deze combinaties van antilichaamkleuring maken de detectie van menselijke CD3, CD19 en CD33 mogelijk, evenals binnen de menselijke CD45-fractie.
        OPMERKING: Voordat u de monsters kleurt, moet u eraan denken om muis- en menselijke Fc-blokken te gebruiken om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen. We kleuren meestal 10 minuten met de Fc-blokken (muis + mens) op ijs en voegen dan de antilichamen toe zonder de cellen te wassen. Raadpleeg de instructies van elk bedrijf voor het gebruik van de Fc-blokantilichamen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens deze protocollen 1,14,15,16,17,18,19,20 werd elk monster getransplanteerd en werd het xenotransplantaatmuismodel vastgesteld. Het doel van de experimenten hier was om IF-injectie met verschillende soorten menselijke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenotransplantaatmodellen bij muizen zijn belangrijk voor het bestuderen van zowel normale als pathologische menselijke hematopoëse. De BM is de bron van hematopoëse3; daarom vereist het bestuderen van hematologische ziekten de succesvolle implantatie van zeldzame menselijke stamcellen in de BM van muizen. Tot nu toe zijn transplantatiemethoden zoals een staartader, retroorbitale ader en IF-injectie gemeld, en het is bekend dat elk van deze methoden getransplantee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.M. zit in de adviesraden van Kodikaz Therapeutic Solutions, Orbital Therapeutics en 858 Therapeutics en is een uitvinder van een aantal patenten met betrekking tot CD47-kankerimmunotherapie die in licentie is gegeven aan Gilead Sciences. R.M. is mede-oprichter en aandeelhouder van Pheast Therapeutics, MyeloGene en Orbital Therapeutics.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken alle leden van het Majeti lab voor hun hulp, steun, aanmoediging en inspiratie door de jaren heen. We erkennen de Flow Cytometry Core van het Stanford Stem Cell Institute, het Binns Program for Cord Blood Research en de patiënten voor het doneren van hun monsters. Voor menselijke monsters werden normale menselijke beenmerg- en perifere bloedcellen van een normale donor vers verkregen van AllCells of het Stanford Blood Center. We danken het Nakauchi-lab van Stanford University voor het doneren van het pBac-AkaLuc-tdTomato-plasmide. Bovenal willen we de dierenartsen en dierencontrolemedewerkers van het Veterinary Service Center in Stanford bedanken die voor onze muizen zorgen. Met name Mike Alvares, supervisor van het dierencentrum, is zo grondig geweest in zijn beheer van de muizen dat het niet overdreven is om te zeggen dat zonder hem ons onderzoek niet mogelijk zou zijn geweest.

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies 1R01HL142637 en 1R01CA251331, het Stanford Ludwig Center for Cancer Stem Cell Research and Medicine, en het Blood Cancer Discoveries Grant-programma via The Leukemia & Lymphoma Society, The Mark Foundation for Cancer Research en The Paul G. Allen Frontiers Group, allemaal aan R.M. R.M. is een ontvanger van een Leukemia and Lymphoma Society Scholar Award. Y.N. werd ondersteund door de Nakayama Foundation for Human Science en een Stanford University School of Medicine Dean's Postdoctoral Fellowship. A.E. werd ondersteund door de NCI onder award F32CA250304, het Advanced Residency Training Program aan Stanford en de American Society of Hematology Scholar Award.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1/2 mL Spuit, 27 GBD305620https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing BufferQualoty Biological118-156-101CShttps://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biologische IrradiatorKimtronIC-250https://www.kimtron.com/ic-250
ChlorhexidineNolvasanNDC 54771-8701-1https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Ethyl alcohol, proof 190Gold Shieldhttps://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetaal bovien serum (FBS)Omega ScientificFB-01https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Flow cytometer, AriaIIBeckton Dickinson (BD)cell sorting
IMDMGibco12440053https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USPDechraNDC 17033-094-25https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) muizen Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA
Strain #:005557		Zes- tot tienwekenoude mannetjes of vrouwtjes 
Oogzalf, USPBausch LombNDC 24208-780-55https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a
7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injectie (Caprofen)VetOneNDC 13985-748-20http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4Zelf gemaakt
Penicilline-StreptomycineGibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidon-jodiumBetadineNDC 67618-155-16https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (in de VS)Sigma-Aldrich808350-5MGAkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antilichaampje (in vivo, muis beenmerg)
AntigeenVerdunning
Antigeen: Anti-menselijke CD45
Fluorofoor: V450
Kloon: HI30		BD Biosciences5603671:25
Antigeen: Anti-muis CD45.1
Fluorofoor: PE-Cy7
Kloon: A20		eBioscience25-0453-811:50
Antigeen:Anti-muis TER-119
Fluorofoor: PE-Cy5
Kloon: TER-119		eBioscience15-5921-831:100
Antigeen:Anti-menselijke CD3
Fluorofoor: APC-Cy7
Kloon: SK7		BD Biosciences3410901:12,5
Antigeen:Anti-menselijke CD19
Fluorofoor: APC
Kloon: HIB19		BD Biosciences5554151:25
Antigeen:Anti-menselijke CD33
Fluorofoor: PE
Kloon: WM53		BD Biosciences5554501:25
Live/Dead kleuringConc.
PIInvitrogen1 μg/mL
Compensatiekralen
Negatieve controleBD BiosciencesZie instructies voor details
Anti-muis Ig, κBD BiosciencesZie instructies voor details

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  2. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature reviews. Genetics. 132, 1-14 (2020).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Méndez-Ferrer, S., et al. Bone marrow niches in haematological malignancies. Nature Reviews. Cancer. 20 (5), 285-298 (2020).
  5. Frassoni, F., et al. Direct intrabone transplant of unrelated cord-blood cells in acute leukaemia: a phase I/II study. The Lancet. Oncology. 9 (9), 831-839 (2008).
  6. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature Medicine. 9 (7), 959-963 (2003).
  7. McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
  8. Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Scientific Reports. 6 (1), 23886(2016).
  9. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. Journal of Visualized Experiments. (89), e51660(2014).
  10. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  11. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (1949).
  12. Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52 (9), 1806-1808 (2011).
  13. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  14. Chan, S. M., et al. Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations induce BCL-2 dependence in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 21 (2), 178-184 (2015).
  15. Zhang, T. Y., et al. IL-6 blockade reverses bone marrow failure induced by human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 12 (538), (2020).
  16. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLIFE. 6, 27873(2017).
  17. Nishimura, T., et al. Sufficiency for inducible Caspase-9 safety switch in human pluripotent stem cells and disease cells. Gene Therapy. 27 (10-11), 525-534 (2019).
  18. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  19. Okada, M., et al. A prospective multicenter phase II study of intrabone marrow transplantation of unwashed cord blood using reduced-intensity conditioning. European Journal of Haematology. 100 (4), 335-343 (2018).
  20. Fink, D., et al. Capacity of the medullary cavity of tibia and femur for intra-bone marrow transplantation in mice. PloS One. 14 (11), 0224576(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intrafemorale injectieBeenmergaspiratieHematopo tische stamcellenMuis xenotransplantatiemodelSeri le beenmerganalyseCelintegratieHematopo tische progenitorcellenBeenmergtransplantatieFACS bufferBioluminescentie imaging

Gerelateerde artikelen