Methodenartikel

Darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing

DOI:

10.3791/65876

⸱

10 november 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Genetics, Erasmus University Medical Center - Sophia Children's Hospital, 2Division of Psychosocial Research and Epidemiology, the Netherlands Cancer Institute, 3Department of Hematology, Erasmus Medical Center, 4Department of Pathology, GROW-School for Oncology and Developmental Biology, Maastricht University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting, voor single-cell RNA sequencing analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het maagdarmkanaal (GI) vervult een reeks functies die essentieel zijn voor het leven. Aangeboren afwijkingen die de ontwikkeling beïnvloeden, kunnen leiden tot enterische neuromusculaire aandoeningen, wat het belang benadrukt om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal. In deze studie presenteren we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting om levende, levensvatbare cellen te verkrijgen die kunnen worden gebruikt voor single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse. Dit protocol is gebaseerd op de manuele dissectie van de darm van de zebravis, gevolgd door enzymatische dissociatie met papaïne. Vervolgens worden cellen onderworpen aan fluorescentie-geactiveerde celsortering en worden levensvatbare cellen verzameld voor scRNA-seq. Met deze methode waren we in staat om met succes verschillende darmceltypen te identificeren, waaronder epitheel-, stromale, bloed-, spier- en immuuncellen, evenals enterische neuronen en glia. Daarom beschouwen we het als een waardevolle bron voor het bestuderen van de samenstelling van het maagdarmkanaal in gezondheid en ziekte, met behulp van de zebravis.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het maagdarmkanaal (GI) is een complex systeem dat een vitale rol speelt in de algehele gezondheid en het welzijn. Het is verantwoordelijk voor de vertering en opname van voedingsstoffen, evenals de eliminatie van afvalproducten 1,2. Het maagdarmkanaal bestaat uit meerdere celtypen, waaronder epitheelcellen, gladde spiercellen, immuuncellen en het enterische zenuwstelsel (ENS), die nauw met elkaar communiceren om een goede darmfunctie te reguleren en te behouden 3,4,5. Defecten in de ontwikkeling van het maagdarmkanaal kunnen verstrekkende gevolgen hebben voor verschillende aspecten, zoals de opname van voedingsstoffen, de samenstelling van de microbiota, de darm-hersenas en het ENS, wat leidt tot verschillende enterische neuromusculaire aandoeningen, zoals de ziekte van Hirschsprung en chronische intestinale pseudo-obstructie 6,7. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door ernstige darmdysmotiliteit veroorzaakt door veranderingen in verschillende sleutelcellen, zoals de interstitiële cellen van Cajal, gladde spiercellen en de ENS 6,8,9. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal worden echter nog steeds slecht begrepen.

De zebravis is een waardevol modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal vanwege de snelle embryonale ontwikkeling, transparantie tijdens embryonale en larvale stadia en genetische traceerbaarheid 10,11,12,13,14. Er zijn talrijke transgene zebravislijnen beschikbaar die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. Een voorbeeld van zo'n lijn is de tg(phox2bb:GFP) zebravis, die vaak wordt gebruikt om het ENS te bestuderen, aangezien alle phox2bb+-cellen, inclusief enterische neuronen, het label15,16 hebben. Hier presenteren we, met behulp van de tg(phox2bb:GFP) zebravislijn, een methode voor darmisolatie van 5 dagen na bevruchting (dpf) larven voor single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse (Figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle zebraviskweek en experimenten zijn uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van het Erasmus MC en de wetgeving inzake dierenwelzijn. Het gebruik van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting valt onder de categorie experimenten waarvoor geen formele ethische goedkeuring vereist is, zoals uiteengezet in de Nederlandse regelgeving.

1. Het verkrijgen van 5 dagen na bevruchting (dpf) wildtype en tg (phox2bb: GFP) larven

  1. Kweek van wildtype zebravissen en verzamel 50 eitjes in HEPES-gebufferd E3-medium (hierna E3 genoemd) in een petrischaaltje van 15 cm. Gebruik deze vissen als negatieve controle voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FAC's).
  2. Kweek van tg(phox2bb:GFP) zebravissen en verzamel ongeveer 300 eitjes in E3 in een petrischaaltje van 15 cm.
  3. Bewaar bevruchte eicellen in E3 (maximaal 50 eieren/schaaltje) in een licht/donkercyclus van 14 uur/10 uur, in een broedmachine bij 28,5 °C.
  4. Verwijder bij 1 dpf onbevruchte eieren en laat de bevruchte eieren zich ontwikkelen tot 5 dpf.
  5. Selecteer tg(phox2bb:GFP) larven bij 1 dpf.

2. Dissociatie van hele larven van wildtype

  1. Verdoof 5 dpf-larven met 0,016% tricaïne.
  2. Snijd 30 zebravissen in kleine stukjes met behulp van een scheermesje in een petrischaal met 1 ml 10x trypsine-EDTA-oplossing.
  3. Breng de gehakte zebravis over in een microcentrifugebuis met een totaal volume van 2 ml 10x trypsine-EDTA-oplossing en laat 3 uur op ijs staan. Pipeteer elk uur op en neer met een P1000-pipet om dissociatie te stimuleren.

3. Isolatie van de darmen

  1. Plaats 6-10 larven van 5 dpf, verdoofd met 0,016% tricaïne op een rij, op een 1,8% agaroseplaat (0,45 g agarose in 25 ml E3), onder een dissectiemicroscoop
  2. Zet een insectenspeld in de kop van de zebravis.
  3. Verwijder alle resterende E3 met behulp van een tissue.
  4. Isoleer de darm met behulp van een andere insectenpin, zonder andere organen te verstoren. Zorg ervoor dat de dooier is verwijderd (aanvullende afbeelding S1A).
  5. Eenmaal geïsoleerd, inspecteert u de darm en verwijdert u indien nodig al het niet-intestinale materiaal (bijv. huid, vet, lever).
  6. Verzamel de darm met een pincet en plaats deze in een microcentrifugebuis, met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 10% foetaal kalfsserum (FCS), op ijs.
    OPMERKING: Er moeten minimaal 244 darmen worden geïsoleerd, waarbij de totale dissectietijd op 3 uur wordt gehouden. Dit is haalbaar met twee mensen die parallel werken.

4. Darm dissociatie

  1. Centrifugeer onmiddellijk na de dissectie van alle darmen de microcentrifugebuis op volle snelheid (13.800 × g) gedurende 30 s.
  2. Verwijder de PBS/10% FCS maar laat een kleine hoeveelheid (~100 μL) achter om uitdroging van de darmen te voorkomen. Voeg 500 μL 2,17 mg/ml papaïne toe aan HBSS met CaCl2 en MgCl2 om de cellen te dissociëren.
  3. Activeer papaïne met 2,5 μL cysteïne (1 M).
  4. Incubeer de ingewanden in een waterbad van 37 °C gedurende 10 min. Pipetteer halverwege (na 5 min) op en neer om de vertering van enzymatisch weefsel te stimuleren.
  5. Breng cellen over in een FACS-buis met behulp van een celzeef van 35 μm, vooraf bevochtigd met 0,5 ml PBS/10% FCS.
  6. Was de zeef door in totaal 2 ml PBS/10% FCS toe te voegen in stappen van 0.5 ml.
  7. Centrifugeer bij 700 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  8. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 300 μL PBS/10% FCS.
  9. Voeg 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe om dode cellen te labelen (1:1,000) en incubeer gedurende 5 minuten om hun uitsluiting tijdens FACS mogelijk te maken.

5. FACS-verrijking

  1. Gebruik het wildtypemonster om de poorten van de gesorteerde celpopulatie in te stellen door 3.000 cellen op de flowcytometer te registreren (aanvullende figuur S1B-E).
  2. Gebruik een mondstuk van 100 μm, stel de sorteerprecisie in op zuiverheid en plaats de opvangbuis met 200 μL PBS/5% FCS in de FACS-machine.
  3. Laad de celsuspensie van de ingewanden en sorteer levende (DAPI-negatieve), enkele cellen in de verzamelbuis (Figuur 2C), door doubletten (Figuur 2B) en dode cellen (Figuur 2C) uit te sluiten.
    OPMERKING: Voor de tg(phox2bb) zebravis wordt het aandeel GFP+- cellen alleen ter referentie gecontroleerd, aangezien alle afzonderlijke levende cellen worden gesorteerd.
  4. Bewaar de opvangbuis op ijs na het sorteren van de cellen.
  5. Tel de celsuspensie met een hemocytometer, inclusief een levensvatbaarheidscontrole met trypanblauw. Als de levensvatbaarheid minimaal 80% is, ga dan verder met de volgende stap.
  6. Cellen zijn nu klaar om te verwerken voor scRNAseq (d.w.z. 10x Genomics Chromium-platform). Gebruik ongeveer 20.000 cellen per monster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met dit protocol bereikten we succesvolle isolatie en dissociatie van hele darmen van 5 dpf-larven. Door papaïne als dissociatie-enzym te gebruiken, hebben we de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk verbeterd, waardoor 46.139 gebeurtenissen met enkele, levensvatbare cellen (6,4% van alle cellen) uit 244 geïsoleerde darmen konden worden vastgelegd (Figuur 2A). Wildtype hele larven werden gebruikt als controle om ervoor te zorgen dat het sorteerproces werd geoptimaliseerd, waardoor effe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een methode voor isolatie en dissociatie van de darm van 5 dpf zebravislarven met behulp van FACS. Met deze methode werden verschillende darmceltypen met succes verzameld en geanalyseerd door scRNA-seq, met behulp van het 10x Genomics Chromium-platform. We selecteerden de tg(phox2bb:GFP) zebravislijn, omdat we een indicatie wilden dat levensvatbare ENS-cellen ook geïsoleerd zouden worden (Figuur 2D). Het is echter belangrijk op te merken dat deze methode gemakkel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Vrienden van de Sophia Stichting (SSWO WAR-63).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x Trypsin (0,5%)-EDTA (0,2%)Sigma59418C
5 mL buis met ronde bodem en cel-strainer dopFalcon352235
AgaroseSigma-AldrichA9539
BD Falcon Ronde-bodem buis 5 mL (FACS buizen) klikkapBD Biosciences352054
Cell Ranger v3.0.210X GenomicsN/A
DAPISigma-AldrichCat#D-9542
DissectiemicroscoopOlympus SZX16
FACSAria III sorteerapparaatBD BiosciencesN/A
HBSS met CaCl2 en MgCl2Gibco14025050
InsectenpinnenFine Science Tools26000-25
L-CysteineSigmaC7352
MS-222, TricaineSupelcoA5040-250G
PapainSigmaP4762
Seurat v3Stuart et al. (2019)N/A
Trypan blauw Sigma Cat#T8154

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
  2. Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
  3. Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  4. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
  5. Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
  6. Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
  7. Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
  8. De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
  9. Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
  14. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
  15. Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
  16. Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).
  17. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  18. Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070(2023).
  19. Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290(2022).
  20. Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
  21. Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).
  22. Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
  23. Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
  24. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van de darm van zebravissenfluorescence activated cell sortingintestinale celtypenenzymatische weefseldissociatiepapaine digestieenterische neuronengastro intestinale ontwikkelingcelviabiliteitsassay

Gerelateerde artikelen