Structurele en biochemische studies van menselijke membraantransporters vereisen milligramhoeveelheden stabiel, intact en homogeen eiwit. Hier beschrijven we schaalbare methoden om transporteurs van menselijke opgeloste stoffen te screenen, tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van codon-geoptimaliseerde genen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
High-Throughput expressie en zuivering van menselijke opgeloste stoffen voor structurele en biochemische studies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Opgeloste stoffen (SLC's) zijn membraantransporters die een reeks endogene en exogene substraten importeren en exporteren, waaronder ionen, voedingsstoffen, metabolieten, neurotransmitters en geneesmiddelen. Ondanks het feit dat deze groep eiwitten naar voren is gekomen als aantrekkelijke therapeutische doelwitten en markers van ziekte, is deze groep eiwitten nog steeds relatief ondergewaardeerd door de huidige geneesmiddelen. Projecten voor het ontdekken van geneesmiddelen voor deze transporters worden belemmerd door beperkte structurele, functionele en fysiologische kennis, uiteindelijk als gevolg van de moeilijkheden bij de expressie en zuivering van deze klasse van in membraan ingebedde eiwitten. Hier demonstreren we methoden om zeer zuivere milligrammen humane SLC-transporteiwitten te verkrijgen met behulp van codon-geoptimaliseerde gensequenties. In combinatie met een systematische verkenning van constructontwerp en high-throughput expressie, zorgen deze protocollen voor het behoud van de structurele integriteit en biochemische activiteit van de doeleiwitten. We belichten ook kritieke stappen in de eukaryote celexpressie, affiniteitszuivering en grootte-uitsluitingschromatografie van deze eiwitten. Uiteindelijk levert deze workflow zuivere, functioneel actieve en stabiele eiwitpreparaten op die geschikt zijn voor structuurbepaling met hoge resolutie, transportstudies, betrokkenheidstests voor kleine moleculen en in-vitroscreening met hoge doorvoer.
Inleiding
Membraaneiwitten zijn al lang het doelwit van zowel onderzoekers als de farmaceutische industrie. Hiervan zijn de opgeloste stoffen (SLC's) een familie van meer dan 400 secundaire transportergenen die gecodeerd zijn in het menselijk genoom1. Deze transporters zijn betrokken bij de import en export van tal van moleculen, waaronder ionen2, neurotransmitters3, lipiden 4,5,6,7, aminozuren8, voedingsstoffen 9,10,11 en geneesmi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle voor codon geoptimaliseerde RESOLUTE SLC-genen zijn gedeponeerd in AddGene43, waarvan de links beschikbaar zijn op de lijst van RESOLUTE publieke reagentia44. Deze genen zijn gekloond in het pDONR221-plasmide en maken het mogelijk om de genen direct te klonen in de bestemmingsvector met behulp van recombinatieklonen45. Om parallellisme te maximaliseren, worden bacteriële, insecten- en zoogdiercellen gekweekt in blokformaat voor respectievelijk bacmideproductie (sectie 3), baculovirusamplificatie (sectie 5) en expressietesten (sectie 6). Voor deze stappen is een micro-expressieschud....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
SLC-genen kunnen worden gekloond van RESOLUTE pDONR-plasmiden naar BacMam-vectoren voor expressie van zoogdieren
De beschreven protocollen voor klonen, expressie en zuivering zijn succesvol gebleken voor veel SLC-transporters over meerdere eiwitvouwen. Desalniettemin bevatten de procedures verschillende controlepunten voor het bewaken van de voortgang, waardoor optimalisatie mogelijk is om rekening te houden met verschillen in expressie, eiwitvouwing, lipide- en wasmiddelafhankelijke stabiliteit en ge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ontwikkeling van SLC-gerichte therapieën is belemmerd gebleven door het ontbreken van systematische karakterisering van de transporterfunctie. Dit heeft geleid tot onevenredig minder geneesmiddelen die zich op deze eiwitklasse richten in vergelijking met GPCR's en ionkanalen63, ondanks hun talrijke rollen in normale en pathofysiologische processen. RESOLUTE is een internationaal consortium dat zich richt op het ontwikkelen van geavanceerde onderzoekstechnieken en -instrumenten om het huidige SL.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige financiële belangen zijn.
Dankbetuigingen
Dit werk werd uitgevoerd binnen het RESOLUTE-project. RESOLUTE heeft financiering ontvangen van de Gemeenschappelijke Onderneming voor het initiatief innovatieve geneesmiddelen 2 in het kader van subsidieovereenkomst nr. 777372. Deze gemeenschappelijke onderneming wordt ondersteund door het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie en EFPIA. Dit artikel geeft alleen de mening van de auteurs weer en noch IMI, noch de Europese Unie en EFPIA zijn verantwoordelijk voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de informatie in het artikel. Het pHTBV-plasmide werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Prof. Frederick Boyce (Harvard).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3C protease | Geproduceerd in eigen beheer | ||
| 50 of 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
| 5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
| 96-well bacmid zuiveringskit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
| 96-well blok (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
| Zelfklevende plastic afdichtingen | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
| Agarose grootte-uitsluitingschromatografie kolom | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
| Benzonase DNAse | Geproduceerd in eigen beheer | ||
| BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
| Cholesteryl Hemisuccinate Tris zout | Anatrace | CH210 | CHS |
| Kobalt metaalaffiniteitshars | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
| D(+)-Biotine | Sigma Aldrich | 851209 | |
| Dextran-agarose grootte-uitsluitingschromatografie kolom | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
| Digitonine | Apollo Scientific | BID3301 | |
| Dounce weefselmolen (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
| EDTA-vrije protease remmer cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-vrije Protease Inhibitor Cocktail |
| Foetaal runder serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Glyco-diosgenine | Anatrace | GDN101 | GDN |
| Zwaartekracht stroming kolommen | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
| HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
| Hydrofiele, neutrale silica UHPLC kolom | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
| Imidazool | Sigma Aldrich | 56750 | |
| Insect transfectiereagens | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
| Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
| Magnesium Chloride Hexahydraat | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Micro-expressie shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
| n-Dodecyl-b-D-Maltopyranosid | Anatrace | D310 | DDM |
| n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
| n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
| Octaethylene Glycol Monododecyl Ether | Anatrace | O330 | C12E8 |
| Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
| Fosfaat Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
| Polyoxyethyleen(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
| Polyoxyethyleen(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
| Poreuze afdichting voor weefselkweek platen | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Recombinatie enzym mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
| Serum-vrij insecten media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-vrij media |
| Natrium Butyraat | Sigma Aldrich | 303410 | |
| Sonicator 24-koppen sonde | Sonics | 630-0579 | |
| Sonicator vermogensunit | Sonics | VCX 750 | |
| Strep-Tactin hars | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity hars |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
| Suspensie-aangepaste HEK293 cellen | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
| Transfectiereagens | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |
Referenties
- Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
- Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
