Methodenartikel

Isolatie van cellen met morfologische en ruimtelijke informatie uit orale submuceuze fibrosemonsters door middel van microdissectie met laseropname

DOI:

10.3791/65890

⸱

11 augustus 2023

 ,  ,  , 
1Department of Oral Pathology, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Center of Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & National Engineering Research Center of Oral Biomaterials and Digital Medical Devices, 2Research Unit of Precision Pathologic Diagnosis in Tumors of the Oral and Maxillofacial Regions, Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU034), 3Central Laboratory, Peking University School and Hospital of Stomatology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laseropname van microdissectie van orale submuceuze fibroseweefsels maakt nauwkeurige extractie van cellen mogelijk uit histologische regio's die van belang zijn voor de analyse van multi-omics-gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orale submuceuze fibrose (OSF) is een veel voorkomende vorm van potentieel kwaadaardige aandoening in de mondholte. De atrofie van epitheel en fibrose van de lamina propria en de submucosa worden vaak aangetroffen op histopathologische objectglaasjes. Er werd voorgesteld dat epitheliale dysplasie, epitheliale atrofie en senescente fibroblasten geassocieerd zijn met de kwaadaardige transformatie van OSF. Vanwege de heterogeniteit van potentieel kwaadaardige orale aandoeningen en oraal plaveiselcelcarcinoom, is het echter moeilijk om de specifieke moleculaire mechanismen van kwaadaardige transformatie in OSF te identificeren. Hier presenteren we een methode om een klein aantal epitheel- of mesenchymale cellen te verkrijgen die morfologische gegevens en ruimtelijke informatie dragen door middel van microdissectie met laseropname op in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde weefselglaasjes. Met behulp van een microscoop kunnen we op microschaal (~500 cellen) dysplastisch of atrofisch epitheelweefsel en fibrotisch subepitheliaal weefsel nauwkeurig vastleggen. De geëxtraheerde cellen kunnen worden geëvalueerd door genoom- of transcriptoomsequencing om genomische en transcriptomische gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie te verkrijgen. Deze aanpak elimineert de heterogeniteit van de sequentiebepaling van OSF-weefsel in bulk en de interferentie veroorzaakt door cellen in niet-laesionele gebieden, waardoor nauwkeurige spatial-omics-analyse van OSF-weefsel mogelijk wordt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orale submuceuze fibrose (OSF) is een chronische, verraderlijke ziekte die zich voornamelijk in het mondslijmvlies ontwikkelt en resulteert in een beperkte mondopening. Hoewel OSF een multifactoriële ziekte is, is het kauwen van arecanoten of betelnoten de belangrijkste oorzaak van OSF 2,3. Vanwege deze geografisch specifieke gewoonte is OSF voornamelijk geconcentreerd in populaties in Zuidoost- en Zuid-Azië3. De gemeenschappelijke histologische kenmerken van OSF zijn onder meer abnormale collageenafzetting in het bindweefsel onder het mondslijmvliesepitheel, vasculaire stenose en occlusie1. OSF-epitheelweefsel kan manifestaties van atrofie of hyperplasie en zelfs dysplasie vertonen wanneer het gelijktijdig wordt behandeld met orale leukoplakie 4,5.

OSF wordt door de Wereldgezondheidsorganisatie gedefinieerd als een veel voorkomende orale potentieel kwaadaardige aandoening (OPMD) die het potentieel vertoont om zich te ontwikkelen tot oraal plaveiselcelcarcinoom met een kwaadaardige transformatiesnelheid van 4%-6%6,7,8,9. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de kwaadaardige transformatie van OSF is complex10. Abnormale groei van het epitheel, waaronder zowel dysplasie als atrofie, verhoogt de kans op carcinogenese, en senescente fibroblasten in het stroma kunnen betrokken zijn bij de kwaadaardige progressie van OSF door epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) te induceren via reactieve zuurstofsoorten (ROS) en andere moleculen10.

Technologieën voor ruimtelijk-omische analyses genereerden multi-omische gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie die inzicht hebben verschaft in kankermechanismen11,12,13. Hier presenteren we een protocol om morfologie-gerelateerde celpopulaties vast te leggen uit formaline-gefixeerd paraffine-ingebed OSF-weefsel door middel van lasermicrodissectie. Multi-omische analyses van deze monsters kunnen uitdagingen met heterogeniteit binnen het weefsel overwinnen en het begrip van de moleculaire pathologie en mechanismen van kwaadaardige transformatie in OSF14 vergroten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele beoordelingsraad van de Peking University School and Hospital. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten. De weefselmonsters die in dit onderzoek werden gebruikt, werden geanonimiseerd. Het onderzoeksschema is weergegeven in figuur 1.

1. Voorbereiding van het monster

  1. Snijd in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde orale submuceuze fibroseweefsels in continue secties van 3 μm en 10 μm dikte op een microtoom.
  2. Vouw de secties uit in het water en vis ze vervolgens uit op de glijbanen. Bevestig de secties van 3 μM en 10 μm op respectievelijk adhesiemicroscoopglaasjes (objectglaasjes A) en PEN-membraanglaasjes (objectglaasje B).
  3. Plaats de objectglaasjes gedurende 2 uur op een hete plaat van 60 °C.

2. Hematoxyline-eosine-kleuring

  1. Plaats objectglaasjes A en B gedurende 10 minuten in xyleen (LET OP) en herhaal deze stap driemaal.
  2. Hydrateer A en B in gesorteerde ethanoloplossingen in de orde van grootte van 100%, 100%, 90%, 80% en 70% gedurende 1 minuut in elke concentratie.
  3. Plaats objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrapuur gedestilleerd water
  4. Plaats objectglaasjes A en B gedurende 90 s in Harris hematoxyline-kleurstofoplossing.
  5. Leg de objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrazuiver gedestilleerd water en herhaal deze stap driemaal.
  6. Plaats objectglaasjes A en B gedurende 2 s in div-hematoxyline-oplossing (VOORZICHTIG).
  7. Leg de objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrazuiver gedestilleerd water en herhaal deze stap driemaal.
  8. Plaats de objectglaasjes in A en B in 1% re-blue oplossing gedurende 2 s.
  9. Leg de objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrazuiver gedestilleerd water en herhaal deze stap driemaal.
  10. Plaats de objectglaasjes gedurende 2 s in eosine-oplossing.
  11. Leg de objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrazuiver gedestilleerd water en herhaal deze stap driemaal.
  12. Dehydrateer de objectglaasjes in gesorteerde ethanoloplossingen in de orde van grootte van 70%, 80%, 90%, 100% en 100% gedurende 2 s in elke concentratie.
  13. Plaats dia A gedurende 3 minuten in xyleen en herhaal deze stap twee keer.
  14. Voeg een druppel montagemedium (LET OP) toe aan dia A en dek het af met een afdekglas.

3. Observatie van histologische morfologie en laseropname microdissectie

  1. Start het lasermicrodissectiesysteem en de software (Figuur 2).
  2. Plaats objectglaasje A op de objectglaasje en observeer de histologische morfologie om het interessegebied voor lasermicrodissectie te identificeren.
  3. Verwijder dia A en plaats dia B omgekeerd op de objectglaas.
  4. Klik op de knop Lossen (Figuur 2) om het opvangapparaat naar buiten te duwen. Steek een polymerasekettingreactie (PCR)-buis in het opvangapparaat en zorg ervoor dat de buis vast wordt gehouden. Klik op de knop OK (Figuur 3).
  5. Selecteer een dop door op de corresponderende rode cirkel te klikken die het verzamelapparaat markeert: buisdoppen. De geselecteerde cirkel wordt groen.
  6. Klik op de knop Tekenen en de knop Tekenen + knippen en gebruik de muis om het interessegebied te schetsen.
  7. Klik op de Start Cut knop om het interessegebied vast te leggen; het gevangen monster wordt opgevangen door de dop (Figuur 4).
  8. Klik op de knop Omlaag om ervoor te zorgen dat het gevangen monster wordt verzameld (Figuur 5).
  9. Klik op de knop Specimen om het volgende monster vast te leggen.
  10. Klik op de knop Lossen om de PCR-buis met het opgevangen monster te ontladen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door lasermicrodissectie van OSF-weefsels uit te voeren, hebben we monsters genomen van dysplastisch epitheel, stroma onder het dysplastische epitheel, atrofisch epitheel en stroma onder atrofisch epitheelweefsel (Figuur 1). Door DNA te extraheren en sequencing van het hele genoom met een lage diepte, waren we in staat om morfologie-gerelateerde veranderingen in het aantal kopieën (CNA) te analyseren15. CNA is een veel voorkomende vorm van genomische instabiliteit die...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol rapporteerde een pijplijn om OSF-weefselmonsters vast te leggen met morfologische en ruimtelijke informatie voor verdere ruimtelijk-omische analyses door middel van lasermicrodissectie. Op basis van de representatieve resultaten identificeerden we verschillende CNA-patronen tussen verschillende morfologiegerelateerde monsters.

OSF, een type OPMD, is een veel voorkomende precancereuze aandoening van oraal plaveiselcelcarcinoom6. Er is gemeld dat genomische i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates van het Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adhesion microscope slidesCITOTESTREF.188105
Div-haematoxylineYiLi20230326
Eosine oplossingBASOBA4098
EthanolPEKING REAGENTNr.32061
Harris hematoxylindisoplossingYiLi20230326
HeetplaatLEICAHI1220
Laser capture microdissectiesysteemLEICALMD7Machine
Laser microdissectie microsysteemLEICA8.2.3.7603Software
Micromount montagemediumLEICAREF.3801731
MicroscoopdekglasCITOTESTREF.10212450C
MicrotoomLEICARM2235
PCR buisjesAXYGEN16421959
PEN-membraan slidesLEICANr.11505158
Re-blue oplossingYiLi20230326
Ultrapuur gedistilleerd waterInvitrogenREF.10977-015
XyleenPEKING REAGENTNr.33535

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
  2. Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949(2022).
  3. Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
  4. Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940(2019).
  5. Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
  6. Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
  7. Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619(2021).
  8. Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793(2022).
  9. Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
  10. Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992(2023).
  11. Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28(2023).
  12. Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
  13. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  14. Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806(2022).
  15. Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
  16. Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
  17. Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
  18. Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53(2017).
  19. Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208(2022).
  20. Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
  21. Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131(2021).
  22. Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
  23. Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176(2019).
  24. Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
  25. Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
  26. Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Formalinegefixeerd ParaffineRuimtelijke OmicsEpitheliale DysplasieWeefselmicrodissectieKopiegetalvariatiesHistopathologische coupesGenomische sequencingTranscriptoomsequencing

Gerelateerde artikelen