Laseropname van microdissectie van orale submuceuze fibroseweefsels maakt nauwkeurige extractie van cellen mogelijk uit histologische regio's die van belang zijn voor de analyse van multi-omics-gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van cellen met morfologische en ruimtelijke informatie uit orale submuceuze fibrosemonsters door middel van microdissectie met laseropname
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Orale submuceuze fibrose (OSF) is een veel voorkomende vorm van potentieel kwaadaardige aandoening in de mondholte. De atrofie van epitheel en fibrose van de lamina propria en de submucosa worden vaak aangetroffen op histopathologische objectglaasjes. Er werd voorgesteld dat epitheliale dysplasie, epitheliale atrofie en senescente fibroblasten geassocieerd zijn met de kwaadaardige transformatie van OSF. Vanwege de heterogeniteit van potentieel kwaadaardige orale aandoeningen en oraal plaveiselcelcarcinoom, is het echter moeilijk om de specifieke moleculaire mechanismen van kwaadaardige transformatie in OSF te identificeren. Hier presenteren we een methode om een klein aantal epitheel- of mesenchymale cellen te verkrijgen die morfologische gegevens en ruimtelijke informatie dragen door middel van microdissectie met laseropname op in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde weefselglaasjes. Met behulp van een microscoop kunnen we op microschaal (~500 cellen) dysplastisch of atrofisch epitheelweefsel en fibrotisch subepitheliaal weefsel nauwkeurig vastleggen. De geëxtraheerde cellen kunnen worden geëvalueerd door genoom- of transcriptoomsequencing om genomische en transcriptomische gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie te verkrijgen. Deze aanpak elimineert de heterogeniteit van de sequentiebepaling van OSF-weefsel in bulk en de interferentie veroorzaakt door cellen in niet-laesionele gebieden, waardoor nauwkeurige spatial-omics-analyse van OSF-weefsel mogelijk wordt.
Inleiding
Orale submuceuze fibrose (OSF) is een chronische, verraderlijke ziekte die zich voornamelijk in het mondslijmvlies ontwikkelt en resulteert in een beperkte mondopening. Hoewel OSF een multifactoriële ziekte is, is het kauwen van arecanoten of betelnoten de belangrijkste oorzaak van OSF 2,3. Vanwege deze geografisch specifieke gewoonte is OSF voornamelijk geconcentreerd in populaties in Zuidoost- en Zuid-Azië3. De gemeenschappelijke histologische kenmerken van OSF zijn onder meer abnormale collageenafzetting in het bindweefsel onder het mondslijmvliesepitheel, vas....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele beoordelingsraad van de Peking University School and Hospital. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten. De weefselmonsters die in dit onderzoek werden gebruikt, werden geanonimiseerd. Het onderzoeksschema is weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding van het monster
- Snijd in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde orale submuceuze fibroseweefsels in continue secties van 3 μm en 10 μm dikte op een microtoom.
- Vouw de secties uit in het water en vis ze vervolgens uit op de glijbanen. Bevestig de secties v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Door lasermicrodissectie van OSF-weefsels uit te voeren, hebben we monsters genomen van dysplastisch epitheel, stroma onder het dysplastische epitheel, atrofisch epitheel en stroma onder atrofisch epitheelweefsel (Figuur 1). Door DNA te extraheren en sequencing van het hele genoom met een lage diepte, waren we in staat om morfologie-gerelateerde veranderingen in het aantal kopieën (CNA) te analyseren15. CNA is een veel voorkomende vorm van genomische instabiliteit die.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol rapporteerde een pijplijn om OSF-weefselmonsters vast te leggen met morfologische en ruimtelijke informatie voor verdere ruimtelijk-omische analyses door middel van lasermicrodissectie. Op basis van de representatieve resultaten identificeerden we verschillende CNA-patronen tussen verschillende morfologiegerelateerde monsters.
OSF, een type OPMD, is een veel voorkomende precancereuze aandoening van oraal plaveiselcelcarcinoom6. Er is gemeld dat genomische i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates van het Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxyline | YiLi | 20230326 | |
| Eosine oplossing | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | Nr.32061 | |
| Harris hematoxylindisoplossing | YiLi | 20230326 | |
| Heetplaat | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissectiesysteem | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissectie microsysteem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount montagemedium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscoopdekglas | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtoom | LEICA | RM2235 | |
| PCR buisjes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membraan slides | LEICA | Nr.11505158 | |
| Re-blue oplossing | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapuur gedistilleerd water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xyleen | PEKING REAGENT | Nr.33535 |
Referenties
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicop....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
