Method Article

Muis Ronde Spermatide Injectie

DOI:

10.3791/65898

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Reproductive Medicine, First Hospital of Jilin University, 2Center of Prenatal Diagnosis, First Hospital of Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier introduceren we een methode voor het uitvoeren van ronde spermatide-injectie (ROSI) bij muizen, een techniek met veelbelovende klinische toepassingen en bruikbaarheid voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de embryonale ontwikkeling.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ronde spermatiden, gekenmerkt door hun haploïde genetische inhoud, vertegenwoordigen de voorlopercellen van rijpe spermatozoa. Door de innovatieve techniek van ronde spermatide-injectie (ROSI) kunnen eicellen met succes worden bevrucht en ontwikkeld tot levensvatbare foetussen. In een baanbrekende mijlpaal die in 1995 werd bereikt, werd de eerste muizenfoetus geboren door middel van ROSI-technologie. ROSI is sindsdien naar voren gekomen als een cruciaal hulpmiddel voor het ontrafelen van de ingewikkelde mechanismen die de embryonale ontwikkeling beheersen en heeft een aanzienlijk potentieel in verschillende toepassingen, waaronder de versnelling van de generatie van muizen en de productie van genetisch gemodificeerde muizen. In 1996 werd een mijlpaal bereikt toen de eerste menselijke foetus werd geboren door middel van ROSI-technologie. De klinische toepassingen van deze methode hebben echter een fluctuerend patroon van succes en mislukking laten zien. Tot op heden is de ROSI-technologie niet op grote schaal toegepast in de klinische praktijk, voornamelijk vanwege de lage geboorte-efficiëntie en onvoldoende validatie van de veiligheid van de foetus. Dit artikel geeft een uitgebreid overzicht van de precieze methoden voor het uitvoeren van ROSI bij muizen, met als doel een nieuw licht te werpen op fundamenteel onderzoek en de mogelijke klinische toepassingen ervan.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De laatste fase van spermatogenese omvat de transformatie van een ronde spermatide in een volledig ontwikkelde spermatozoön, gekenmerkt door duidelijke kop-, nek- en langwerpige staartstructuren1. Deze transformatie omvat significante veranderingen in de celmorfologie, zoals de condensatie van chromatine in de kern, vervanging van histonen door protamine, acrosoomvorming, ontwikkeling van mitochondriale omhulsels, centriolmigratie en -verlies, vorming van staartstructuren en de verwijdering van cellulaire residuen2.

In 1992 werd de eerste menselijke foetus met succes geboren door middel van intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) -technologie3. Sindsdien hebben onderzoekers het potentieel onderzocht van het gebruik van ronde spermatiden, die dezelfde haploïde genetische samenstelling delen als rijpe spermatozoa, om eicellen te bevruchten en levensvatbare zwangerschappen te ondersteunen 2,4. Vervolgens, in 1996, werd de eerste menselijke foetus verwekt via ronde spermatide-injectie (ROSI) -technologie afgeleverd 5,6. Het is vermeldenswaard dat studies met ICSI en ROSI bij muizen achterbleven bij die bij mensen vanwege de gevoeligheid van het eicelmembraan van de muis voor beschadiging tijdens het injectieproces. Dit probleem werd met succes opgelost met de introductie van het piëzo-membraanbreekapparaat. Zo werd in 1995 de eerste muis geboren die met ROSI-technologie werd bedacht. Daarnaast is er ook onderzoek gaande naar ROSI bij verschillende andere dieren 7,8.

Momenteel concentreert het onderzoek naar ROSI zich voornamelijk op de volgende aspecten: klinische toepassing, opheldering van mechanismen en strategieën om de ontwikkelingsefficiëntie te verbeteren, samen met bredere toepassingen van ROSI-technologie. In de context van klinische toepassingen werd de vooruitgang, ondanks de geboorte van de eerste menselijke ROSI-foetus door ROSI in 1996, gekenmerkt door een reeks successen en mislukkingen 9,10,11,12. Tot op heden heeft ROSI-technologie geen wijdverbreide klinische implementatie bereikt, grotendeels vanwege de lage efficiëntie en de noodzaak van verdere validatie met betrekking tot de veiligheid van foetussen die zijn verwekt met ROSI-technologie. Onvolledige statistieken geven aan dat er wereldwijd minder dan 200 menselijke ROSI-verwekte foetussen zijn afgeleverd. Een keerpunt in het begrijpen van het potentieel van ROSI-technologie vond plaats in 2015 toen Tanaka en collega's rapporteerden over de succesvolle geboorte van 14 foetussen door middel van ROSI-technologie, wat hernieuwd vertrouwen wekte in de klinische toepassing en haalbaarheid ervan13,14. ROSI-technologie is veelbelovend voor het aanpakken van reproductieve biologische uitdagingen, met name bij niet-obstructieve azoöspermiepatiënten. Naast de klinische toepassingen dient ROSI als een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de ingewikkelde mechanismen van embryonale ontwikkeling 15,16,17.

Er zijn talrijke dierstudies uitgevoerd om de onderliggende factoren te onderzoeken die bijdragen aan de lage efficiëntie van ROSI bij het bereiken van volledige embryonale ontwikkeling. Deze factoren omvatten de keuze van methoden voor geassisteerde eicelactivatie (AOA) en hun timings, afwijkingen in genomische stabiliteit en, in het bijzonder, afwijkingen in epigenetische modificaties. Het is belangrijk om te erkennen dat ronde spermatiden onrijpe kiemcellen zijn, die in verschillende fysiologische aspecten aanzienlijk verschillen van rijpe spermatozoa. Mizuki Sakamoto en collega's gaven aan dat H3K27me3, afgeleid van ronde spermatiden, geassocieerd is met chromatine dat minder toegankelijk is en leidt tot verminderde genexpressie in ROSI-embryo's18. In een verwante studie door Jing Wang en collega's werden herprogrammeringsdefecten in ROSI-embryo's in de pronucleaire stadia voornamelijk geassocieerd met de verkeerde expressie van een cohort van de genen die verantwoordelijk zijn voor kleine zygote genoomactivering19. Ze ontdekten ook dat de introductie van een selectieve euchromatische histonlysinemethyltransferase 2-remmer, A366, de algehele ontwikkelingssnelheid mogelijk met ongeveer twee keer zou kunnen verbeteren.

De muis staat als een van de meest waardevolle modeldieren voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling. In dit artikel wordt dieper ingegaan op het uitvoeren van ROSI op muizen. Dit uitgebreide protocol omvat de selectie van geschikte muizen, gedetailleerde ovulatie-inductieprocedures, AOA-technieken, injectietechnieken en de voorbereiding van surrogaatmuizen. Verder presenteren we een vergelijkende analyse van de effecten van twee injectieregimes op de geboorte-efficiëntie: AOA gevolgd door ROSI (A-ROSI; eerste regime) en ROSI gevolgd door AOA (ROSI-A; tweede regime). We willen onderzoekers aanmoedigen om ROSI-experimenten bij muizen met grotere precisie uit te voeren, door een robuustere ondersteuning te bieden voor hun klinische toepassing en het fundamentele onderzoek naar embryonale ontwikkelingsmechanismen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2), C57BL/6 en ICR-muizen die in dit experiment werden gebruikt, werden gekocht van Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd. (Beijing, China). Alle dierbehandelingen voldeden aan de experimentele procedures en normen die zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie Proefdieren van het Eerste Ziekenhuis van de Universiteit van Jilin (erkenningsnummer: 20200435).

1. Bereiding van de relevante reagentia

  1. Koop sommige reagentia commercieel en bereid de resterende reagentia zelf voor.
    1. Verkrijg M2, een buffersysteem voor in vitro verwerking van ronde spermatiden (RS), spermatozoa en eicellen van de leverancier.
    2. Bereid het Ca2+-vrije C.L. Chatot, C.A. Ziomek en B.D. Bavister (CZB) medium voor op AOA volgens het eerder gepubliceerde protocol20.
    3. Verkrijg het kalium simplex geoptimaliseerde medium aangevuld met aminozuren (KSOMaa) oplossing voor embryocultuur bij de leverancier.
    4. Bereid hyaluronidase, met een werkconcentratie van 0,1% (1 g/l), door 0,1 g hyaluronidase op te lossen in 1 ml embryowater. Neem 10 μL geconcentreerde bewaaroplossing en los op in 990 ml M2, die 1 week bij 4 °C kan worden bewaard.
    5. Bereid polyvinylpyrrolidon (PVP), met een gemiddeld molecuulgewicht van 360.000 en een massaconcentratie van 12%, door 1,2 g PVP op te lossen in 10 ml M2. De resulterende oplossing kan gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard.
    6. Bewaar de cytochalasine B (CB) stockoplossing (2 μl), oplosbaar in 18 μl DMSO, bij -20 °C. Neem 5 μl van de geconcentreerde bewaaroplossing en los op in 995 ml M2. De resulterende oplossing kan gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard.

2. Preparaat van eicellen

  1. Acclimatiseren vrouwelijke B6D2F1-muizen in de leeftijd van 6-8 weken gedurende ten minste 1 week aan hun nieuwe omgeving. Injecteer intraperitoneaal met 7,5 IE drachtige merrieserumgonadotrofine (PMSG) om 17.00 uur, gevolgd door 7,5 IE humaan choriongonadotrofine (HCG) 48 uur later. Zorg ervoor dat er geen contact met mannelijke muizen optreedt na de injectie.
    LET OP: De aangegeven tijd (17.00 uur) is niet verplicht. Het is alleen voor het werkgemak. De 14 uur na 17.00 uur is 7.00 uur, wanneer de eicellen klaar zijn, en de injectie wordt uitgevoerd, dus de injectietijd is gepland voor de ochtend. De starttijd van de injectie kan worden aangepast aan het dagschema van het laboratorium.
  2. Euthanasie de muizen na 14 uur HCG-injectie met behulp van de cervicale dislocatiemethode. Open de buikholte en zoek de baarmoeder. Identificeer de eierstokken langs de baarmoeder en snijd de eileiders in de buurt van de eierstokken door met een schaar. Herhaal dezelfde procedure aan de andere kant en plaats de eileiders in M2, die van tevoren is voorverwarmd op 37 °C.
  3. Zoek onder een rechtopstaande microscoop (10x) het vergrote deel van de eileider, dat een transparant en gezwollen uiterlijk vertoont. Gebruik een spuit van 1 ml om de eileider vast te zetten terwijl u het vergrote deel doorsnijdt en verzamel eicelcoronale cumuluscomplexen (OCCC's).
  4. Breng OCCC's aan in de voorverwarmde M 2-operatieoplossing die 0,1% hyaluronidase bevat en verwijder de granulosacellen door voorzichtig door een orale pipet te blazen.
    OPMERKING: Houd de OCCC's gedurende een korte duur, indien nodig, ongeveer 2 minuten in 0,1% hyaluronidase.
  5. Na het verwijderen van de granulosacellen de eicel overbrengen naar KSOMaa, 3x spoelen en in een kooldioxide-incubator plaatsen voor later gebruik (37 °C, 5% CO2).

3. Preparaat van ronde spermatiden en spermatozoa

  1. Verzamel ronde spermatiden en spermatozoa uit de testis en bijbal van mannelijke C57BL/6-muizen (8-10 weken) respectievelijk.
    1. Voor spermatozoa, euthanaseer de muizen door cervicale dislocatie. Open de buikholte, zoek de bijbal in de buurt van de testis en snijd voorzichtig weg met een schaar.
    2. Plaats de bijbal in M2-medium en snijd voorzichtig weg met een spuit van 1 ml om de spermatozoa onder een rechtopstaande microscoop (10x) naar buiten te laten stromen.
    3. Hevel de stromende spermatozoa en M 2-suspensie over naar de bodem van een buis met 0,5 ml M2, zodat de spermatozoa op natuurlijke wijze stroomopwaarts kunnen stromen. Zet ze opzij voor later gebruik.
    4. Voor ronde spermatiden verwijdert u de testikels uit de buikholte en plaatst u ze in M2. Snijd het witte membraan voorzichtig door met een spuit van 1 ml en knijp de ingewikkelde tubuli seminiferi onder een rechtopstaande microscoop (10x) uit.
    5. Snijd de tubuli pipuli voorzichtig weg met behulp van twee spuiten van 1 ml. Zuig de suspensie en het filter op met een zeef met 400 mazen (38 μm).
  2. Centrifugeer de gefilterde cellen, gooi het supernatant weg en voeg 200 μl Hoechst 33342 toe voor kleuring, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 10 minuten.
  3. Voer fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) uit om ronde spermatiden te onderscheiden van andere celtypen. Plaats de gekleurde cellen in een flowcytometriebuis en voer een ronde spermatidescreening uit.
    1. Verschillende modellen flowcytometriemachines hebben verschillende regulerende parameters en kunnen tijdens het gebruik met technische ondersteuning worden gecommuniceerd. Pas als eerste stap de spanning aan en selecteer de celpopulatie op basis van voorwaartse verstrooiing (FSS) en zijverstrooiing (SSC; zie aanvullende tabel 1).
    2. Verwijder voor de tweede stap de celverklevingen volgens FSC en activeer de pulsbreedte.
    3. Selecteer als derde stap de beoogde haploïde ronde spermatiden. Hoechst 33342 bindt zich aan DNA en cellen met verschillende ploïdie vertonen verschillende fluorescentie-intensiteiten. Stel de excitatiegolflengte in op 355. Selecteer twee detectiekanalen, 460/50 en 670/30, onder een laser met een golflengte van 355 om ronde spermatiden te sorteren. Bewaar de gesorteerde ronde spermatiden vervolgens in een koelkast van 4 °C voor later gebruik.
      OPMERKING: Het is ook mogelijk om ronde spermatiden direct te selecteren op basis van hun morfologie onder een microscoop, maar training is vereist om de nauwkeurigheid van de selectie te garanderen.

4. Ronde spermatide-injectie (ROSI)

  1. Voer de ROSI-procedure uit met behulp van een omgekeerde microscoop met een micromanipulatiesysteem.
  2. Maak in de eerste voorbereidingsstap vasthoud- en injectienaalden volgens de eerder beschreven procedure21. Houd de binnendiameter van de injectienaald tussen 6-7 μm, ontworpen voor de extractie van ronde spermatiden, en voor de bevestigingsnaald, een binnendiameter van 20 μm voor het vastzetten van de eicel.
  3. Maak in de daaropvolgende voorbereidingsstap een injectievat door 10 μL M2 druppeltjes met CB te plaatsen om eicellen te verzachten en 10 μL M2 druppeltjes voor het bewaren van ronde spermatiden. Gebruik PVP-druppels om de injectienaalden te bevochtigen en te reinigen.
    LET OP: Het toevoegen van CB is hier geen noodzakelijke stap, maar het toevoegen van CB kan de overlevingskans na injectie sterk verbeteren.
  4. Extraheer ronde spermatiden met behulp van een injectienaald.
  5. Draai de eicel met een vasthoudnaald en plaats het poollichaam van de eicel op 12 uur of 6 uur.
  6. Plaats de injectienaald voorzichtig op 3 uur op de eicel en hecht stevig aan de zona pellucida. Gebruik een PiezoXpert-apparaat om een gat in de zona pellucida te maken. Pas de sterkte aan van klein naar groot, wat hier ongeveer de intensiteit = 5 en de snelheid = 15 is.
  7. Beweeg de injectienaald voorzichtig door de zona pellucida en ga horizontaal de eicel in. Wanneer het het midden van de eicel passeert, breng dan een piëzo aan (intensiteit = 1 en snelheid = 1), wat resulteert in het scheuren van het eicelmembraan en de geleidelijke injectie van de ronde spermatide in het cytoplasma van de eicel.
  8. Trek de injectienaald terug en zuig een kleine hoeveelheid van het membraan van de eicel op bij de opening om deze af te dichten. Deze stap is cruciaal, omdat het niet afdichten zou leiden tot cytoplasmatische lekkage en eicelsterfte.
    OPMERKING: Het is vermeldenswaard dat ROSI AOA vereiste voor of na de injectie van ronde spermatiden, die we in de volgende paragrafen hebben besproken.

5. Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI)

  1. Voer voor ICSI dezelfde stappen uit als voor ROSI, met als enige verschil de diameter van de ICSI-injectienaald, die 9-10 μm meet.
  2. Plaats spermatozoa op een PVP-landingsbaan om hun zwemsnelheid te verminderen en sperma-extractie te vergemakkelijken.
  3. Voer scheiding uit van de kop en staart van de spermatozoa voor ICSI. Zuig de spermatozoa uit de staart en plaats de hals van de spermatozoa precies bij de opening van de injectienaald. Breng een piëzo aan (meerdere piëzo's kunnen naar behoefte worden gebruikt, intensiteit = 5 en snelheid = 15) om de kop en staart van de spermatozoa te scheiden.

6. Geassisteerde eicelactivering (AOA)

  1. Bereid volgens het protocol een CZB-medium voor zonder calcium en magnesium.
  2. Gebruik strontiumchloride-hexahydraat (SrCl26H2 O), met een molecuulgewicht van 266,62, in een concentratie van 10 mM. Los voor de bereiding 0,26662 g SrCl26H2O op in 1 ml embryowater. Voeg op het moment van gebruik 10 μL geconcentreerde bewaaroplossing toe aan 990 μL Ca2+-vrij CZB-medium en gebruik onmiddellijk.
  3. Plaats de eicellen in het Ca2+-vrije CZB-medium dat SrCl26H2O bevat voor activering; elke druppel heeft een volume van 20 μL en er worden telkens 20 eicellen geplaatst. Incubeer gedurende 20 minuten.
  4. Stel tegelijkertijd een groep op voor activering van parthenogenese zonder ronde spermatiden of spermatozoa te injecteren. Opgemerkt moet worden dat de parthenogenese-activeringsgroep wordt weergegeven zonder statistische analyse en dat de controlegroep ICSI is.

7. Embryo overdracht

  1. Huisvest de geligeerde ICR mannelijke en vrouwelijke muizen in een verhouding van 1:2. Onderzoek de volgende ochtend de vrouwelijke muizen op de aanwezigheid van een vaginale plug en selecteer die met een vaginale plug voor transplantatie.
  2. Injecteer de teruggeplaatste embryo's bestaande uit 2-cellige embryo's de vorige ochtend en plaats ze de volgende middag terug.
  3. Maak een incisie op de rug van de vrouwelijke muis, leg het witte vet en de eierstokken bloot en zoek het vergrote deel van de eileider onder een rechtopstaande microscoop (10x).
  4. Gebruik een spuit van 1 ml om een opening te maken in het vergrote deel van de eileider en zuig de embryo's op via een orale pipet. Breng de embryo's voorzichtig in de richting van de baarmoeder. Hecht de wond met behulp van 4 x 10 modellen gebogen naalden met draad, met een dikte van 5-0 (0,09-0,11 mm). De hechtdraad wordt gemaakt in twee lagen, met een laag voor het buikvlies en een laag voor de buitenste huid.
  5. Voer voor surrogaatmuizen keizersneden uit op basis van het experimentele schema. Euthanaseer de muizen door de cervicale dislocatiemethode, desinfecteer met alcohol en open de buikholte. Snijd voorzichtig en snel de baarmoeder open en open de vruchtwaterholte om de foetus en placenta te laten zien. Verwijder de navelstreng en knip vanaf de zijkant dicht bij de foetus af; De foetus werd gevoed door dezelfde periode van muizen die borstvoeding gaven.
    OPMERKING: Vanwege de noodzaak om geboortecijfers te berekenen, is een keizersnede nauwkeuriger wat betreft de productiecapaciteit. Bij een natuurlijke bevalling kunnen de nakomelingen door de moeder worden opgegeten, wat resulteert in onnauwkeurige statistieken. De keizersnede wordt uitgevoerd bij surrogaatmuizen die in een vroeg stadium zijn getransplanteerd, en de keizersnede euthanasie wordt vóór de bevalling uitgevoerd.

8. Statistische analyse

  1. Gebruik GraphPad Prism 5 om te analyseren. De gegevens worden uitgedrukt in gemiddelde ± SD; P < 0,05 geeft een statistisch verschil aan en P < 0,01 geeft een significant statistisch verschil aan.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn ons onderzoek begonnen door het effect van AOA op het ontwikkelingsvermogen van embryo's te onderzoeken. Een schematische illustratie van het experimentele ontwerp is weergegeven in figuur 1A. Vóór de injectie met spermatozoön ondergingen de eicellen AOA (A-ICSI) of bleven ze onbehandeld (ICSI). Gedetailleerde gegevens over de embryonale ontwikkeling worden weergegeven in tabel 1. De resultaten toonden geen significante verschillen in splitsing, blastocyst of geboortecijfers tussen de A-ICSI- en ICSI-groepen (P > 0,05; Figuur 1B). Deze bevindingen geven aan dat AOA met 10 mM SrCl2 gedurende 20 minuten geen invloed had op het ontwikkelingspotentieel van de embryo's.

Eerder werd gemeld dat er geen waarneembare verschillen waren in de ontwikkelingsefficiëntie van ROSI-embryo's die waren geselecteerd door FACS of door direct visueel onderzoek onder een microscoop22. Onze experimenten maakten gebruik van FACS-technologie om RS te identificeren (Figuren 2A,B). Onder de microscoop hadden ronde spermatiden van muizen een diameter van ongeveer 10 μm en vertoonden ze een uitsteekselachtige nucleolusstructuur in het midden (Figuur 2C). We stellen dat selectie via FACS nauwkeuriger is dan direct visueel onderzoek onder een microscoop. Bovendien ondersteunt de literatuur de directe exploratie van RS door morfologische verschillen. ROSI-embryo's werden gegenereerd met behulp van twee verschillende methoden: de A-ROSI-groep, waarbij eicellen werden onderworpen aan AOA vóór de ronde spermatide-injectie, en de ROSI-A-groep, waar eicellen werden onderworpen aan AOA na de ronde spermatide-injectie. Het schematische diagram van het experimentele ontwerp is weergegeven in figuur 1C. Er werden met name geen significante verschillen in de splitsings- en blastocystsnelheden gevonden tussen de A-ROSI-, ROSI-A- en ICSI-groepen (P > 0,05; Figuur 1D). De blastocystsnelheden van de A-ROSI-, ROSI-A- en ICSI-groepen waren significant hoger dan die van de activeringsgroep (P < 0,05; Figuur 1D). Het geboortecijfer van de ROSI-groep was echter lager dan dat van de ICSI-groep, ongeacht of de eicellen voor of na de injectie werden geactiveerd (P < 0,05; Figuur 1D). Belangrijk is dat het geboortecijfer van de A-ROSI-groep iets hoger was dan dat van de ROSI-A-groep (Figuur 1D). Verdere details over de gegevens over de embryonale ontwikkeling worden weergegeven in tabel 1.

figure-results-1
Figuur 1: ROSI-embryo's vertoonden een verminderde ontwikkelingsefficiëntie in vergelijking met ICSI-embryo's. (A) Schematische illustratie van het experimentele protocol dat het effect van activering op de embryonale ontwikkeling van ICSI beoordeelt. Blauw = Eicellen werden niet geactiveerd; Geel = Eicellen werden geactiveerd. (B) Ontwikkelingsefficiëntie van embryo's afgeleid van A-ICSI en ICSI. (C) Schematische illustratie van het experimentele protocol voor het genereren van verschillende soorten embryo's. (D) Ontwikkelingsefficiëntie van embryo's afgeleid van A-ROSI, ROSI-A, A en ICSI. **, P < 0,01. Afkortingen: A= Activatie E= Embryonale dag; ROSI= Ronde spermatide injectie; ICSI = Intracytoplasmatische sperma-injectie. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. De vergelijking van de koersen wordt uitgevoerd met behulp van de chi-kwadraattoets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Ronde spermatiden werden geselecteerd via flowcytometrische sortering. (A) Voor de selectie van ronde spermatiden werd een flowcytometrisch sorteerdiagram gebruikt. (B) Representatieve afbeeldingen van de selectie van ronde spermatiden. Schaal balk: 10 μm. Afkortingen: FSC = Forward scatter; SSC = zijwaartse verstrooiing; 355 is de excitatiegolflengte; 460/50 en 670/30 zijn twee detectiekanalen onder een laser met een golflengte van 355. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

GroepenOntwikkeling vóór implantatieOntwikkeling na implantatie
RepliceertSplitsingspercentage (%)Blastocyst percentage (%)2-cellige embryo's teruggeplaatst/ Nee. van de ontvangersGeboortecijfer (%)
A-ICSI599.33 (149/150)75.17 (112/149)49/548.98 (24/49)
A-ROSI599.33 (149/150)73.83 (110/149)44/518.18 (8/44) **
ROSI-A598.00 (147/150)64.63 (95/147)45/513.33 (6/45) **
Activering5100.00 (150/150)12.00 (18/150) **51/50.00 (0/51) **
ICSI598.00 (147/150)73.47 (108/147)46/552.17 (24/46)

Tabel 1. De ontwikkelingsefficiëntie van embryo's afkomstig van verschillende groepen.

Aanvullende tabel 1. Het aandeel van verschillende celpopulaties gesorteerd op flowcytometrie. P3 deel is ronde spermatiden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geassisteerde eicelactivering
Een kritieke voorwaarde voor ROSI is AOA, aangezien ronde spermatiden alleen de eicelactivering niet kunnen initiëren. Momenteel is de meest gevestigde methode bij muizen het gebruik van strontiumchloride23,24, terwijl de meest geavanceerde menselijke toepassing gebruik maakt van elektrische activering13,14. De timing van de activering van de eicel is ook van groot belang. Zoals gerapporteerd in de literatuur, is de meest optimale activeringsbenadering bij muizen het eerst activeren van de eicel en vervolgens het injecteren van de ronde spermatide25. Dit staat in contrast met het conventionele bevruchtingsproces, waarbij sperma eerst de eicellen binnendringt en vervolgens fosfolipase C ζ afgeeft om de eicel26 te activeren. Gespecialiseerd onderzoek uitgevoerd door Satoshi Kishigami en collega's benadrukt het differentiële vermogen van ROSI om een mannelijke kern te vormen in pre- of post-geactiveerde eicellen. Om een efficiënte productiesnelheid van het nageslacht te bereiken, moeten beide injectietypes worden uitgevoerd voordat de eicellen de G1-fase25 ingaan.

De diameter van de injectienaald
In de context van ROSI is het belangrijk op te merken dat een grotere diameter van de injectienaald zich niet noodzakelijkerwijs vertaalt in betere resultaten. De gebruikte injectienaald heeft een diameter van 6-7 μm, iets kleiner dan een ronde spermatide. Daarom, wanneer een ronde spermatide wordt opgezogen, wordt het celmembraan onderworpen aan een knijpend effect, wat mogelijk kan leiden tot directe blootstelling van de kern. Deze directe blootstelling kan bevorderlijk zijn voor depolymerisatie en de daaropvolgende vorming van de mannelijke pronucleus27.

Afdichting behandeling
Eicellen van muizen vertonen minder cytoplasmatische viscositeit in vergelijking met andere soorten. Zelfs een kleine breuk in het celmembraan kan ervoor zorgen dat het cytoplasma gemakkelijk naar buiten stroomt, wat resulteert in eiceldegeneratie28. Om het risico te beperken, is het na injectie van de ronde spermatide in het cytoplasma van de eicel en het terugtrekken van de injectienaald absoluut noodzakelijk om een klein deel van het celmembraan bij de opening van het eicelmembraan op te zuigen om de ruimte af te dichten, vergelijkbaar met de procedure in ICSI21. Dit afdichtingsproces vermindert het risico op eiceldegeneratie aanzienlijk.

Toepassing van ROSI als model
Naast klinische toepassingen heeft ROSI-technologie verschillende andere toepassingen als model. Het kan de generatie van muizen versnellen met29, vrouwelijke dodelijkheid redden als gevolg van een vaderlijk overgeërfde Xist-deletie bij muizen17, muizen genereren na ronde spermatide-injectie in haploïde parthenogenetische tweecellige blastomeren15, transgene muizennakomelingen genereren16 en de vruchtbaarheid behouden bij adolescente kinderen vóór de behandeling van kanker30,31. IJverig onderzoek naar ROSI bij muizen kan aanzienlijk bijdragen aan vooruitgang in onderzoek naar reproductieve gezondheid.

Beperkingen van het artikel
Dit artikel dient als een methodologische gids met verschillende beperkingen, waaronder het ontbreken van een directe vergelijkende selectie van RS onder een microscoop voor injectie en een vermeend gebrek aan innovatie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen conflicten van financiële of andere belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn Wenjie Zhao dankbaar voor haar onschatbare hulp bij het sorteren van ronde spermatiden door middel van flowcytometrie en Fang Wang voor haar expertise op het gebied van embryotransfer bij muizen. Dit werk kreeg gedeeltelijke steun van de Natural Science Foundation van de provincie Jilin (nr. YDZJ202301ZYTS461). We danken Bullet Edits Limited voor de taalkundige redactie en proeflezing van het manuscript.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CaCl22H2O SigmaC7902 Preparatie van CZB
Glucose SigmaG6152 Preparatie van CZB
HEPES-Na (basisch) SigmaH3784 Preparatie van CZB
Hoechst 33342Beyotime C1025FACS
humaan choriongonadotropine (HCG)Ningbo Second Hormone CompanyHCGOvulatiebevorderende medicijnen
HyaluronidaseSigmaH3506Verwijderen van granulosacellen rond de eicel
KCl SigmaP5405Preparatie van CZB
KH2PO4 SigmaP5655 Preparatie van CZB
KSOMaaCaisson LabsIVL04-100MLKalium simplex geoptimaliseerd medium aangevuld met aminozuren
L-glutamine SigmaG8540 Preparatie van CZB
M2SigmaM7167-50MLWerkvloeistof
MgSO47H2O SigmaM1880 Preparatie van CZB
Na2-EDTA2H2O SigmaE5134 Preparatie van CZB
NaCl SigmaS5886Preparatie van CZB
NaHCO3SigmaS5761 Preparatie van CZB
Na-lactaat 60% siroop d = 1,32 g/LSigmaL7900 Preparatie van CZB
Na-pyruvaat SigmaP4562 Preparatie van CZB
Piezo boorpuntjes (ICSI) Eppendorf piezoXpertPiezo-elektrische membraanruptuur
zwanger merrie serum gonadotropine (PMSG)Ningbo Second Hormone CompanyPMSGOvulatiebevorderende medicijnen
PVA SigmaP8136Preparatie van CZB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Redgrove, K. A., McLaughlin, E. A. The role of the immune response in Chlamydia trachomatis infection of the male genital tract: A double-edged sword. Front Immunol. 5, 534(2014).
  2. Yanagimachi, R. Intracytoplasmic injection of spermatozoa and spermatogenic cells: Its biology and applications in humans and animals. Reprod Biomed Online. 10 (2), 247-288 (2005).
  3. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A. C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).
  4. Kimura, Y., Yanagimachi, R. Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring. Development. 121 (8), 2397-2405 (1995).
  5. Tesarik, J., et al. Spermatid injection into human oocytes. II. Clinical application in the treatment of infertility due to non-obstructive azoospermia. Human Reprod. 11 (4), 780-783 (1996).
  6. Tesarik, J., Mendoza, C. Spermatid injection into human oocytes. I. Laboratory techniques and special features of zygote development. Human Reprod. 11 (4), 772-779 (1996).
  7. Hirabayashi, M., et al. Activation regimens for full-term development of rabbit oocytes injected with round spermatids. Mol Reprod Dev. 76 (6), 573-579 (2009).
  8. Ogonuki, N., et al. Birth of a marmoset following injection of elongated spermatid from a prepubertal male. Mol Reprod Dev. 86 (8), 928-930 (2019).
  9. Niederberger, C., et al. Forty years of IVF. Fertil Steril. 110 (2), 185(2018).
  10. Gross, K. X., Hanson, B. M., Hotaling, J. M. Round spermatid injection. Urol Clin North Am. 47 (2), 175-183 (2020).
  11. Hanson, B. M., et al. Round spermatid injection into human oocytes: a systematic review and meta-analysis. Asian J Androl. 23 (4), 363-369 (2021).
  12. Tekayev, M., Vuruskan, A. K. Clinical values and advances in round spermatid injection (ROSI). Reprod Biol. 21 (3), 100530(2021).
  13. Tanaka, A., et al. Fourteen babies born after round spermatid injection into human oocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14629-14634 (2015).
  14. Tanaka, A., et al. Ninety babies born after round spermatid injection into oocytes: survey of their development from fertilization to 2 years of age. Fertil Steril. 110 (3), 443-451 (2018).
  15. Yang, H., Shi, L., Chen, C. D., Li, J. Mice generated after round spermatid injection into haploid two-cell blastomeres. Cell Res. 21 (5), 854-858 (2011).
  16. Moreira, P., et al. Transgenic mouse offspring generated by ROSI. J Reprod Dev. 62 (1), 37-42 (2016).
  17. Federici, F., et al. Round spermatid injection rescues female lethality of a paternally inherited Xist deletion in mouse. PLoS Genet. 12 (10), e1006358(2016).
  18. Sakamoto, M., et al. Paternally inherited H3K27me3 affects chromatin accessibility in mouse embryos produced by round spermatid injection. Development. 149 (18), 200696(2022).
  19. Wang, J., et al. Single-cell multiomics sequencing reveals the reprogramming defects in embryos generated by round spermatid injection. Sci Adv. 8, (2022).
  20. Ward, M. A., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in mice. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (1), (2018).
  21. Yoshida, N., Perry, A. C. Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).
  22. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2013).
  23. Kong, P., et al. Effects of the histone deacetylase inhibitor 'Scriptaid' on the developmental competence of mouse embryos generated through round spermatid injection. Hum Reprod. 32 (1), 76-87 (2017).
  24. Hosseini, S., Salehi, M. Tricostatin A-treated round spermatid enhances preimplantation embryo developmental competency following round spermatid injection in mice. Zygote. 30 (3), 373-379 (2022).
  25. Kishigami, S., Wakayama, S., Nguyen, V. T., Wakayama, T. Similar time restriction for intracytoplasmic sperm injection and round spermatid injection into activated oocytes for efficient offspring production. Biol Reprod. 70 (6), 1863-1869 (2004).
  26. Tao, Y. Oocyte activation during round spermatid injection: state of the art. Reprod Biomed Online. 45 (2), 211-218 (2022).
  27. Ogura, A., Ogonuki, N., Miki, H., Inoue, K. Microinsemination and nuclear transfer using male germ cells. Int Rev Cytol. 246, 189-229 (2005).
  28. Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod. 52 (4), 709-720 (1995).
  29. Ogonuki, N., et al. A high-speed congenic strategy using first-wave male germ cells. PLoS One. 4 (3), e4943(2009).
  30. Abdelaal, O., et al. Fertility preservation for pediatric male cancer patients: illustrating contemporary and future options; a case report. Transl Androl Urol. 10 (1), 520-526 (2021).
  31. Eyni, H., et al. Advanced bioengineering of male germ stem cells to preserve fertility. J Tissue Eng. 12, (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Round Spermatid InjectionMouse ROSIOocyte ActivationIntracytoplasmic Sperm InjectionEmbryonic DevelopmentFlow CytometrySpermatid IsolationOocyte MicroinjectionAssisted ReproductionGenetically Modified Mice

Related Articles