T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Samenvatting

Bacteriofagen (fagen), virussen die bacteriën infecteren, zijn een integraal onderdeel van het darmmicrobioom. Hoewel deze symbiotische bewoners de bacteriële fitheid en populatiedynamiek aansturen, is er weinig bekend over hoe ze de darmhomeostase en ziekte beïnvloeden. Dit protocol bestudeert geïsoleerde T4-fagen in een muismodel, aanpasbaar aan andere faag-bacterieparen.

Samenvatting

Bacteriofagen (fagen) zijn virussen die bacteriën infecteren met soort- en stamspecificiteit en zijn de meest voorkomende biologische entiteiten in alle bekende ecosystemen. Binnen bacteriële gemeenschappen, zoals die in de darmmicrobiota, zijn fagen betrokken bij het reguleren van de populatiedynamiek van de microbiota en het stimuleren van bacteriële evolutie. Er is de afgelopen tien jaar hernieuwde belangstelling voor faagonderzoek, deels vanwege de gastheerspecifieke dodingsmogelijkheden van lytische fagen, die een veelbelovend hulpmiddel bieden om de toenemende dreiging van antimicrobieel resistente bacteriën tegen te gaan. Bovendien suggereren recente studies die aantonen dat fagen zich hechten aan darmslijm dat ze een beschermende rol kunnen spelen bij het voorkomen van bacteriële invasie in het onderliggende epitheel. Belangrijk is dat, net als bacteriële microbiomen, verstoorde fageom in verband zijn gebracht met verslechterde resultaten bij ziekten zoals inflammatoire darmaandoeningen. Eerdere studies hebben aangetoond dat fagen het microbioom van dieren en mensen kunnen moduleren door middel van fecale filtraattransplantaties, wat de gezondheid van de gastheer ten goede komt. Met deze recente golf van onderzoek komt de noodzaak om protocollen op te stellen en te standaardiseren voor het bestuderen van fagen in de context van het darmmicrobioom. Dit protocol biedt een reeks procedures om geïsoleerde T4-fagen en hun bacteriële gastheer, Escherichia coli, te bestuderen in de context van het maagdarmkanaal van muizen. De hier beschreven methoden beschrijven hoe te beginnen met een faaglysaat, het aan muizen toe te dienen en de effecten op de niveaus van bacteriële gastheer en fagen te beoordelen. Dit protocol kan worden aangepast en toegepast op andere faag-bacterieparen en biedt een startpunt voor het bestuderen van gastheer-faagdynamiek in vivo.

Inleiding

Bacteriofagen, of fagen, zijn virussen die bacteriën infecteren en doden met soort- en stamspecificiteit¹. Fagen spelen een belangrijke rol binnen complexe bacteriële gemeenschappen zoals de darmmicrobiota, waar ze betrokken zijn bij het reguleren van de populatiedynamiek en het stimuleren van bacteriële fitheid^. Gedurende het afgelopen decennium is er hernieuwde belangstelling geweest voor faagonderzoek als gevolg van de opkomst van antimicrobieel resistente pathogenen³ en het potentieel voor faagtherapie als alternatieve behandelingsstrategie. In de afgelopen jaren zijn lytische faagcocktails met enig succes intraveneus gebruikt bij ernstige, antibioticaresistente bacteriële septische infecties bij mensen ^3,4. Orale faagtherapie is ook voorgesteld als een mogelijk alternatief voor antibiotica om darminfecties en ontstekingen te behandelen. Bovendien zijn fagen betrokken bij het succes van fecale filtraattransplantaties (FFT), dit zijn fecale microbiotapreparaten die zijn gefilterd om bacteriën te verwijderen, bij de behandeling van recidiverende Clostridioides difficile-infectie (rCDI)^5,6, inflammatoire darmaandoeningen (IBD)^7,8 en necrotiserende enterocolitis bij te vroeg geboren varkens⁹. Gezien deze resultaten is het belangrijk om rekening te houden met interacties tussen zowel fagen en de darmmicrobiota, als fagen en de gastheer van zoogdieren, aangezien de toevoeging van nieuwe fagen aan een reeds bestaande gemeenschap indirecte effecten kan hebben op de gemeenschap als geheel, en niet alleen op de doelbacteriën2,10.

De studie van faaginteracties met hun doelbacteriën in vitro is nuttig gebleken voor het begrijpen van de mechanismen en effecten van faag- en bacterie-interacties in de darm. In deze setting is aangetoond dat Escherichia coli-specifieke T4-fagen van de orde Caudovirales immunoglobuline (Ig)-achtige domeinen nodig hebben die zich bevinden in zeer antigene buitenste capside (Hoc)-eiwitten op het virionoppervlak om zich te hechten aan darmslijm¹¹. Bovendien hebben transwell-tests aangetoond dat T4-fagen in staat zijn om te interageren met epitheelcelculturen en door cellagen te transloceren door macropinocytose^12,13. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat fagen kunnen interageren met hun metazoaire gastheer, ook al zijn ze niet in staat om eukaryote cellen te infecteren. Deze modellen, hoewel nuttig, missen het volledige scala aan complexe interacties die plaatsvinden in een darmecosysteem die nodig zijn voor een uitgebreide verkenning van de tripartiete interactie tussen fagen, bacteriën en de metazoaire gastheer.

Muismodellen zijn een belangrijk hulpmiddel voor het onderzoeken van fagen binnen complexe omgevingen. Een wenselijke toepassing van faagtoediening is als een alternatieve strategie voor de behandeling van antimicrobieel resistente infecties of pathobionten geassocieerd met chronische ontstekingsziekten, waaronder IBD. Opkomende literatuur suggereert echter dat faaggedrag in vitro niet volledig representatief is voor in vivo functies. Buttimer et ^al.14 toonden aan dat een faagcocktail in staat was om de beoogde bacteriën in vitro uit te putten in een vereenvoudigd consortium voor menselijke microbiota, maar niet in vivo kon worden gerepliceerd in gnotobiotische muizen die waren gekoloniseerd met hetzelfde bacterie-faagconsortium. Bovendien leidde de T7-faag in een conventioneel microbioom van muizen tot selectieve uitputting van de beoogde darmbacteriën, hoewel geleidelijk herstel in de loop van de tijd werd waargenomen, wat wijst op geëvolueerde resistentie¹⁵. Andere studies hebben het naast elkaar bestaan aangetoond van oraal toegediende fagen en hun doelbacteriestammen in vivo ^2,16. Naast het naast elkaar bestaan van fagen en bacteriën, leidde de toediening van fagen inderdaad tot wijdverbreide veranderingen in de algehele samenstelling en functie van de microbiotagemeenschap ^2,16. Dit is relevant in ziekteomgevingen, aangezien verschillende onderzoeken associaties hebben gevonden tussen een verhoogde relatieve abundantie van Caudovirales en IBD ^7,8,17 die onafhankelijk waren van veranderingen in bacteriële abundantie⁷. Het blijft onbekend of dit een aanjager of gevolg is van de pathogenese van de ziekte.

De historische focus van faagonderzoek lag op de relatie tussen een faag en zijn doelbacterie. Het is echter ook belangrijk om rekening te houden met mogelijke interacties tussen faag en het slijmvlies, het epitheel en het immuunsysteem van de metazoaire gastheer. Deze interacties spelen allemaal een belangrijke rol in de algehele respons op een darmfaaginfectie. Om dit aan te tonen, zijn fagen bestudeerd met behulp van kiemvrije (GF) muizen om hun impact op het immuunsysteem op te helderen zonder interferentie door de microbiota⁸. In dit systeem werden faagnucleïnezuren gedetecteerd door Toll-like receptoren (TLR's) die zich in endosomen van fagocytische immuuncellen (macrofagen en dendritische cellen) bevinden. Dit activeerde stroomafwaartse signalering en stimuleerde T-celafhankelijke productie van interferon (IFN)-γ⁸ of type I IFN's¹⁸. Bovendien impliceerden Flückiger et ^al.19 geheugen CD8⁺ T-cellen bij de herkenning van faag-gecodeerde (profag) antigenen, wat resulteerde in kruisreactiviteit van T-cellen met tumorantigenen, wat resulteerde in verminderde tumorbelasting. Ten slotte is de productie van faagspecifieke antilichamen gedocumenteerd in muizenstudies waarbij fagen op een continue manier aan diermodellen werden toegediend via drinkwater ^8,20, of door herhaalde orale maagsonde gedurende meerdere maanden²⁰, wat het vermogen van faageiwitten aantoont om humorale immuunresponsen te bevorderen. Hoewel deze manieren van faaginoculatie een optimale en voortdurende priming van het immuunsysteem mogelijk maken, vertegenwoordigen ze mogelijk niet de natuurlijk voorkomende interacties tussen fagen en het darmmilieu, noch de kinetiek van oraal toegediende faagtherapie. Tot nu toe heeft een beperkt aantal studies de interacties van fagen met een enkele bacteriesoort onderzocht in monocolonized muismodellen²¹. Muizen met monokolonisatie bleken echter van cruciaal belang bij het ontcijferen van microbe-specifieke effecten van individuele soorten op het maagdarmkanaal (GI) en de ontwikkeling van het immuunsysteem22,23,24, en ze kunnen nog nuttig blijken te zijn bij het begrijpen van tripartiete interacties tussen fagen, hun doelbacteriën en de metazoaire gastheer.

Opwindend is dat er nog veel te leren valt over de interacties tussen darmfaag en darmcommensale bacteriën, evenals de interacties die optreden tussen de metazoaire gastheer en de fagen die erin verblijven. Dit protocol biedt een reeks procedures om geïsoleerde T4-faag en zijn bacteriële tegenhanger, E. coli (K-12, BW25113), te bestuderen met behulp van een gnotobiotisch muismodel. Deze gestandaardiseerde procedures bieden ook een basis voor het optimaliseren van andere faag/bacterie-dyades door de groeiparameters aan te passen aan de paren van belang. De hier beschreven methoden beschrijven: (1) Bereiding van T4-faag en vehiculumlysaten voor orale sonde van muizen; (2) Orale toediening van T4-faag aan gnotobiotische muizen met E. coli monokolonisatie; (3) Monitoring van T4-faagniveaus in uitwerpselen en weefsels van muizen in de loop van de tijd.

Voor de representatieve resultaten die hier worden gepresenteerd, werden gezuiverde T4-faaglysaten vermeerderd uit faagbankvoorraden die worden bijgehouden door het Rohwer Lab. De faag-op-tap-methode voor de vermeerdering van T4-fagen is aangepast²⁵, zoals vermeld in dit protocol. De methode levert binnen drie dagen endotoxine-lage faagvoorraden met een hoge titer op. Met behulp van deze aanpak werden routinematig 10 ml ≥ 10¹⁰ plaquevormende eenheden (pfu)/ml T4-faag met < 0,5 endotoxine-eenheden (EU)/ml verzameld. De aanbevolen endotoxineniveaus voor orale of intraveneuze toediening aan muizen zijn respectievelijk ≤ 20 EU/ml en ≤ 5 EU/kg/u (of 0,1 EU toegediend gedurende 1 uur voor een muis van 20 g), waardoor dit een geschikte methode is voor de bereiding van fagen voor in-vivo-inoculatie . Alle faagvoorraden werden bij 4 °C opgeslagen in een faagbuffer van zout magnesium (SM) (recept in stap 1.1.5.1). E. coli werd gekweekt in LB-media. Voor verschillende faag-bacterieparen kunnen diverse kweekmedia en groeiomstandigheden worden aangepast aan dit protocol. Fagen kunnen ook afkomstig zijn uit de omgeving, zoals afvalwater, zeewater, bodem en darminhoud en kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd volgens Sambrook en Russell²⁶ voorafgaand aan de bereiding met behulp van de juiste groei- en voortplantingsomstandigheden voor elk faag-gastheerpaar van belang²⁵. Als alternatief kunnen fagen worden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel) of uit faagbanken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn opgesteld door de UBC Animal Care Committee en de door de Biosafety Committee goedgekeurde protocollen (A23-0113, B19-0038). Muizen werden gehuisvest aan de Universiteit van British Columbia onder pathogeenvrije omstandigheden in het Center for Disease Modelling. C57BL/6-muizen werden binnen de faciliteit gefokt in een steriele flexibele filmisolator, voorzien van steriel muizendieet, water, strooisel en nestmateriaal. De muizen werden gehandhaafd op een dag/nacht-cyclus van 12 uur. Experimentele muizen, zowel mannetjes als vrouwtjes, werden binnen elk experiment op leeftijd gebracht, variërend van 6 tot 12 weken oud en met een gewicht van 15-30 g voor alle experimenten.

1. Bereiding van faag- en vehiculumlysaten voor orale sonde bij muizen

1. Faagzuivering en voorraadvorming
   OPMERKING: In deze studie worden T4-fagen gekweekt en getiterd door ze op een gazon met bacteriën te plateren met behulp van de methode met één agarlaag, hieronder beschreven. De dubbele agarlaagmethode is al eerder beschreven^25,27en kan ook met vergelijkbare werkzaamheid worden gebruikt. Voor dit protocol is gekozen voor de methode met één agarlaag, omdat deze zorgt voor een betere zichtbaarheid van plaque²⁸.
   1. Kweek E. coli in 5 ml steriele LB-media in steriele polystyreen of glazen kweekbuisjes (met doppen). Incubeer de buizen bij 37 °C en schud ze 's nachts bij 200 tpm, totdat de stationaire fase is bereikt.
   2. Bereid zachte agar in een glazen mediafles door LB met 0,5% agar in de autoclaaf te zetten en af te koelen tot 50 °C of lager (terwijl het vloeibaar blijft) voorafgaand aan de suppletie. Bereid voldoende zachte agar voor 15 ml per bord.
   3. Vul zachte agar aan met MgSO₄ en CaCl₂ tot een eindconcentratie van 1 mM voor elk. Voeg 100 μL E. coli-cultuur 's nachts toe voor elke 3 ml zachte agar. Roer voorzichtig met een magnetische roerstaaf om de supplementen en cultuur in de zachte agar te homogeniseren.
      OPMERKING: Consistentie in het volume en de dichtheid van E. coli die aan het zachte agarpreparaat wordt toegevoegd, is van cruciaal belang (beschreven in de sectie representatieve resultaten).
   4. Voeg 15 ml zachte agar + E. coli per petrischaaltje (diameter 15 cm) toe met behulp van een serologische pipet. Laat de borden op kamertemperatuur opstijven voor gebruik op dezelfde dag.
      NOTITIE: Borden zullen in ongeveer 20 minuten opstijven met open deksels. De agar blijft zacht, maar verschuift niet als de platen worden omgekeerd.
   5. Bereid 8-10 seriële verdunningen van de bron T4-faag in factoren van 10 door verdunning in SM-buffer. Breng 5 μL van elke verdunning aan op de platen. Laat de plekken een nacht drogen, omkeren en incuberen bij 37 °C.
      1. Om de faagbuffer van zout magnesium (SM) te bereiden, lost u in 1 L gedeïoniseerd H₂O 100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄·7H₂O en 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) op. Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur.
         OPMERKING: De volgende dag zou E. coli moeten zijn uitgegroeid tot een gazon door de zachte LB-agar. Plaques, of vrijgemaakte groeigebieden die zichtbaar zijn in het E. coli-gazon , zullen verschijnen waar faagdoding van geïnfecteerde E. coli-gastheren plaatsvond. Elke plaquette vertegenwoordigt een plaquevormende eenheid (pfu).
   6. Pluk een enkele plaque van de zachte agarplaat door een steriele pipetpunt in het midden van de plaque te duwen, waardoor een agarplug aan het uiteinde van de tip ontstaat. Resuspendeer de plaqueplug in 1 ml SM-buffer in een microcentrifugebuisje van 1,7 ml. Draai de buis gedurende 1 minuut op maximale snelheid om te mengen.
   7. Centrifugeer de buis op 4000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om eventueel vuil uit het lysaat te verwijderen. Breng het supernatans over in een nieuwe microcentrifugebuis.
   8. Herhaal stap 1.1.1-1.1.3 om de geïsoleerde faag te vermeerderen. Voeg 100 μl van de geïsoleerde faag toe aan een aliquot van 15 ml zachte agar met E. coli in een conische buis. Keer de buis drie keer om om te mengen en giet de agar in een petrischaaltje.
   9. Laat de platen drogen voordat u ze omkeert en een nacht bij 37 °C incubeert. Bereid een gazoncontroleplaat voor zonder faag om de levensvatbaarheid van E. coli te bevestigen.
      OPMERKING: Na een nacht incubatie moet de controleplaat een gazon met E.coli hebben, terwijl de faaghoudende plaat volledig moet worden gelyseerd.
   10. Om de faag uit de plaat te halen, voegt u 5 ml SM-buffer toe aan het oppervlak van de faag-gezuiverde plaat en schudt u 15 minuten met 70 tpm op een tuimelaar bij kamertemperatuur.
   11. Verzamel de buffer van de plaat in een conische centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 4000 x g om eventueel vuil van de agarplaat te pelleteren.
   12. Vang het T4-faaglysaat op in een nieuwe buis en bewaar het bij 4 °C tot titratie en vermeerdering.
       OPMERKING: T4-fagen zijn meer dan 10 jaar stabiel²⁵; De stabiliteit hangt echter af van het type faag en de opslagomstandigheden. De faagtiter zal ook variëren met de bewaartijd. Fagen zijn gevoelig voor bevriezing. Daarom wordt cryopreservatie aanbevolen in vloeibare stikstof en het vermijden van vries-dooicycli, omdat dit fagen kan beschadigen, waardoor de faagtiter²⁵ wordt verminderd.
   13. Titer de T4-faagvoorraad lysaat om de concentratie in pfu/ml te bepalen, zoals eerder beschreven 25,29,30. Een T4-faagvoorraad met een hoge titer bevat 10⁸ pfu/ml of meer.
2. Bereiding van experimentele faaglysaten
   1. Kweek E. coli in 5 ml LB-media in steriele polystyreen of glazen kweekbuisjes (met doppen). Incubeer de buizen 's nachts bij 37 °C en schud bij 200 tpm, totdat de stationaire fase is bereikt.
   2. Subcultuur de nachtelijke E. coli-cultuur 1:50 in 100 ml LB-media in een glazen conische kolf. Incubeer bij 37 °C met schudden bij 200 tpm totdat de bacteriën de vroege tot midden exponentiële fase hebben bereikt (ca. 1,5 uur).
      OPMERKING: Een eerste groeicurve kan worden uitgevoerd om de optische dichtheid te bepalen bij een bereik van 600 nm (OD₆₀₀) waarbij de bacteriecultuur zich in een exponentiële fase bevindt. Kweek in een glazen conische buis wordt gesuggereerd omdat recent bewijs heeft aangetoond dat fagen zich kunnen hechten aan kunststoffen zoals polypropyleen³¹.
   3. Voeg 100 μL van de T4-faagvoorraad met hoge titer uit stap 1.1 toe aan de E. coli-subcultuur en incubeer bij 37 °C met schudden gedurende 3 uur, of totdat het nieuwe lysaat niet langer troebel is. Vang het T4-faaglysaat op in conische buizen van 50 ml en ga direct over tot de reinigingsstappen of, indien nodig, bewaar het bij 4 °C tot de volgende dag.
      OPMERKING: Een grotere faagburstgrootte (wat wijst op een hoger gemiddeld aantal virionen dat per replicatiecyclus vrijkomt) vereist een langere incubatietijd voor de bacteriële subcultuur in stap 1.2.2. Dit zorgt voor een verhoogde bacteriedichtheid voorafgaand aan het pieken met faagbestanden.
   4. Centrifugeer lysaten bij 4000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om eventuele resterende bacteriën en celresten te pelleteren. Filtreer het resulterende supernatans met behulp van een nylon filter van 0,22 μm en breng het filtraat over naar nieuwe conische centrifugebuisjes van 50 ml.
   5. Voeg 0,1 volume chloroform toe aan elk volume gefilterd T4-faaglysaat om eventuele resterende bacteriën te doden en bacteriegroei te voorkomen. Draai kort om te mengen en te incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
      OPMERKING: Met lipiden omhulde fagen zijn gevoelig voor chloroform, wat de faagtiter²⁵ kan verminderen. Sla deze stap indien nodig over.
      LET OP: Chloroform is een giftig organisch oplosmiddel dat gevaarlijk is bij inademing, inslikken of opnemen via de huid. Gebruik een zuurkast en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij het werken met chloroform. Gebruik glas in plaats van serologische pipetten van polystyreen bij het werken met chloroform, omdat dit niet compatibel is met de meeste kunststoffen. Chloroform kan in polypropyleen conische centrifugebuisjes worden geplaatst voor de stappen 1.2.5-1.2.6, maar mag niet langdurig in plastic buisjes worden bewaard.
   6. Centrifugeer het lysaat op 4000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de chloroform van het lysaat te scheiden. Gebruik een serologische pipet om de bovenste lysaatlaag voorzichtig over te brengen in een nieuwe conische buis van 50 ml zonder de onderliggende chloroformlaag te verstoren. Gooi het chloroformafval weg in de daarvoor bestemde container voor gevaarlijk vloeibaar afval. Bewaar lysaten bij 4 °C tot concentratie en buffer de volgende dag worden uitgewisseld.
   7. Concentreer faaglysaten in een centrifugaalfilterinrichting van 100 kDa (zie Materiaaltabel) door 13 ml faaglysaat toe te voegen aan het bovenste reservoir van het apparaat en gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 4000 x g , of totdat het grootste deel van het lysaat door het filter in het onderste reservoir is terechtgekomen.
      NOTITIE: Streef naar ongeveer 2 ml lysaat aan het einde van de centrifugeertijd. Naarmate de faagconcentratie in het filter toeneemt met de toevoeging van lysaat, zullen de centrifugeertijden waarschijnlijk toenemen. Centrifugaalfilterinrichtingen hebben een fysieke dode stop om te voorkomen dat ze droogdraaien³². Laat het filtermembraan niet uitdrogen als voortgezet gebruik bedoeld is (d.w.z. door alle vloeistof uit het bovenste reservoir te verwijderen). Spintijden kunnen variëren op basis van het type faag en de titer.
   8. Gebruik een P200- of P1000-pipet om de resterende ~2 ml lysaat voorzichtig op en neer te pipetten in het bovenste reservoir om het filtermembraan na elke draaibeurt te ontstoppen. Gooi het filtraat uit het onderste reservoir weg in een afvalcontainer en laat de geconcentreerde faag in het bovenste reservoir achter.
   9. Herhaal stap 1.2.7-1.2.8 totdat het volledige volume faaglysaat door het filterapparaat is geleid, waarbij na elke centrifuge ~2 ml geconcentreerde faag in het bovenste reservoir wordt vastgehouden.
   10. Ontstop het filtermembraan na de laatste centrifuge door het resterende lysaat (~2 ml) in het bovenste reservoir op en neer te pipetteren. Was de faag (bufferuitwisseling) door 12 ml SM-buffer toe te voegen aan het bovenste reservoir en centrifugeer op 4000 x g gedurende 10 minuten, of totdat het grootste deel van de buffer door het filter is gegaan.
   11. Gooi het filtraat weg en herhaal de wasstap (stap 1.2.10). Resuspendeer de resterende 2 ml lysaat in SM-buffer tot een eindvolume van 10 ml (of minder), voor langdurige opslag. Breng het lysaat over in een conische centrifugebuis van 50 ml en bewaar het bij 4 °C totdat het endotoxine is verwijderd.
       OPMERKING: Het is optioneel om de faag in dit stadium te titeren om er zeker van te zijn dat het faaglysaat geconcentreerd is (> 10⁸ pfu/ml) en om het faagverlies tijdens het endotoxineverwijderingsproces te bepalen.
   12. Verwijder verontreinigende endotoxinen uit het T4-faaglysaat door 0,4 volume 1-octanol (zie Materiaaltabel) toe te voegen aan het totale volume lysaat.
       OPMERKING: Endotoxinen worden verwijderd omdat ze zeer immunostimulerend zijn, en daarom kan hun aanwezigheid leiden tot de inductie van een faagonafhankelijke aangeboren immuunrespons²⁵.
       LET OP: 1-Octanol is een aromatische, organische, ontvlambare verbinding met een sterke geur en irriterend voor de ogen. Draag geschikte PBM's bij het werken met 1-octanol. Voer alle werkzaamheden uit in een zuurkast om inademing van damp te voorkomen. Gebruik afdichtingsfolie om lekken van buizen te voorkomen wanneer u buiten de zuurkast werkt.
   13. Sluit het deksel van de conische centrifugebuis af met afdichtfolie om lekken te voorkomen. Schud bij 120 rpm op een platform of schommelschudder bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, gevolgd door incubatie bij 4 °C gedurende 1,5 uur, zonder te schudden.
   14. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 4000 x g om het endotoxine-geklaarde lysaat te scheiden van het 1-octanol. De 1-octanollaag zal bovenop het lysaat drijven. Gebruik een P1000-pipet om voorzichtig zoveel mogelijk 1-octanol te verwijderen en gooi deze weg in de daarvoor bestemde container voor gevaarlijk/ontvlambaar vloeibaar afval.
   15. Gebruik een naald van 18 G en een spuit van 10 ml om het faaglysaat onder de resterende laag van 1 octanol op te vangen en zorg ervoor dat u de laag van 1 octanol niet verzamelt. Bewaar lysaat bij 4 °C tot het vacuüm.
   16. Breng 1 ml aliquots T4-faaglysaat over in steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Snelvacuüm met deksels open op 4000 x g bij kamertemperatuur om resterend 1-octanol uit het lysaat te verdampen. Vacuüm versnellen gedurende 3 uur of totdat het volume van het faaglysaat met 30% is ^verminderd25. Bewaren bij 4 °C tot titratie.
   17. Titer het faaglysaat om de concentratie in pfu/ml te bepalen. Verdun het resulterende T4-faaglysaat in SM-buffer tot de gewenste concentratie en hertiter om te bevestigen.
   18. Kwantificeer de endotoxinen die aanwezig zijn in het T4-faaglysaat met behulp van een chromogene endotoxine-kwantificeringskit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Vergelijk de endotoxineniveaus in het uiteindelijke faaglysaat met een pre-endotoxineverwijderingsmonster, voertuigcontroles, buffer en drinkwater van muizen.
       OPMERKING: De chromogene endotoxine-kwantificeringskit wordt geïnactiveerd door 1-octanol²⁵. Voer snelheidsvacuümstappen uit om 1-octanol te verwijderen (stap 1.2.16) voordat endotoxinen worden gekwantificeerd. Het endotoxinegehalte voor gedestilleerd water wordt geschat op 20 EU/ml²⁵; Het endotoxinegehalte van het drinkwater van muizen kan echter per faciliteit verschillen. Als het endotoxinegehalte in het faaglysaat hoger is dan de hoeveelheid die in het drinkwater aanwezig is, overweeg dan om de stappen voor het verwijderen van endotoxinen te herhalen (1.2.12-1.2.16).
   19. Bewaar geconcentreerde, endotoxine-gezuiverde T4-faaglysaten in SM-buffer bij 4 °C.
3. Bereiding van faagvrij bacterieel lysaat voor voertuigbesturingen
   OPMERKING: Een faagvrij bacterieel lysaat kan worden bereid als middel om eventuele effecten te controleren als gevolg van bacteriële verontreinigingen (bijv. endotoxine) die worden gegenereerd bij de productie van faaglysaat in stap 1.2, die van invloed kunnen zijn op experimentele resultaten wanneer ze in muizen worden geïnoculeerd.
   1. Van een nachtelijke cultuur van E. coli, subcultuur de E. coli 1:50 in 100 ml LB-media. Zonder faag toe te voegen, blijft u de bacteriën kweken terwijl u ze gedurende 3 uur bij 37 °C schudt, of de incubatietijd van het in stap 1.2 geproduceerde faaglysaat evenaart.
   2. Breng de E. coli-cultuur over in conische buizen van 50 ml en lysecellen met behulp van een sonicatorsonde (zie Tabel met materialen) op ijs bij 30 kHz gedurende pulsen van 30 s (3x) om bacteriecellen handmatig te lyseren.
   3. Volg de rest van het protocol volgens stap 1.2, beginnend bij stap 1.2.4, inclusief alle stappen voor opruimen, wassen en verwijderen van endotoxinen.
      OPMERKING: Tijdens het concentreren met behulp van het centrifugaalfilterapparaat zal het voertuiglysaat sneller door het filter stromen dan het faaglysaat, vanwege de afwezigheid van faag. Verkort daarom de centrifugatietijden van 5 minuten tot 2-5 minuten om ervoor te zorgen dat het ultrafiltermembraan niet uitdroogt tijdens langdurig centrifugeren.
   4. Titer het lysaat van het medium om te bevestigen dat het geen faag bevat.
   5. Gebruik een chromogene endotoxine-kwantificeringskit volgens de instructies van de fabrikant om de endotoxineniveaus in het voertuiglysaat te meten. Verdun het vehiculumlysaat in SM-buffer om overeen te komen met de endotoxineniveaus in het faaglysaat.
4. Alternatieve experimentele controles: bereiding van door warmte geïnactiveerd faaglysaat
   OPMERKING: Een alternatief voor het faagvrije bacteriële lysaat is een door warmte geïnactiveerd faaglysaat. Warmte-inactivatie dissocieert faagvirionen, terwijl resterende endotoxinen zoals lipopolysacchariden (LPS) hittestabiel zijn ^8,33. Deze methode werd gebruikt door Gogokhia et ^al.8 om te bepalen of intacte, levensvatbare faagvirionen nodig waren voor immuunactivering. Onderzoekers worden aangemoedigd om beide methoden te testen (faagvrij vs. warmte-geïnactiveerd) en te bepalen welke controle het meest geschikt is voor hun experimentele behoeften. Welke keuze er ook wordt gekozen, het is belangrijk om te erkennen dat een buffercontrole waarschijnlijk niet geschikt is vanwege de aanzienlijke manipulatie die nodig is om een faagbestand te concentreren en op te ruimen.
   1. Breng het benodigde volume gereinigd, gezuiverd en verdund T4-faaglysaat van stap 1.2 (100 μl per muis) over naar steriele microcentrifugebuisjes die zijn voorzien van dekselsloten.
   2. Verwarm lysaten op een warmteblok bij 95 °C gedurende 15 min¹⁶.
   3. OPTIONEEL: Als de verwijdering van faag/bacteriële nucleïnezuren vereist is, voer dan een DNase I- en RNase A-behandeling uit volgens Jakočiūnė en Moodley³⁴. Kort:
      1. Voeg 50 μL DNase I 10x buffer, 1 μL DNase I (1 E/μL) en 1 μL RNase A (10 mg/ml) (zie materiaaltabel) toe aan 450 μL warmte-geïnactiveerd faaglysaat.
      2. Incubeer lysaten bij 37 °C gedurende 1,5 uur in een warmteblok, zonder te schudden.
      3. Inactiveer DNase I en RNase A door 20 μL 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe te ^voegen34.
   4. Houd lysaten 10 minuten op kamertemperatuur om af te koelen en combineer lysaten als er meerdere buizen worden gebruikt. Bewaren bij 4 °C tot titratie.
   5. Voer een fagtiter uit om te bevestigen dat er geen levensvatbare T4-faag in het lysaat aanwezig is. Bewaar warmte-geïnactiveerde lysaten bij 4 °C.
   6. Gebruik een chromogene endotoxine-kwantificeringskit volgens de instructies van de fabrikant om de endotoxineniveaus in het door warmte geïnactiveerde lysaat te meten. Verdun het door warmte geïnactiveerde lysaat in SM-buffer volgens de endotoxineniveaus die aanwezig zijn in het gematchte faaglysaat.

2. Toediening en monitoring van T4-faag bij E. coli monocolonized muizen

1. Monokolonisatie van muizen met E. coli
   1. Bereid E. coli voor op toediening aan GF-muizen⁸ door E. coli geplukt uit een enkele kolonie een nacht in LB-media te kweken.
   2. Onder strenge, steriele omstandigheden³⁵ 200 μl E. coli-cultuur toedienen aan GF-muizen die zijn gehuisvest in steriele vinylisolatoren of bio-exclusion luchtdichte kooien door middel van een mondsonde. Bij gebruik van aerotolerante bacteriën kunnen muizen ook worden gekoloniseerd door 200 μL bacteriecultuur op de rug van elke muis aan te brengen.
      OPMERKING: De inoculatiedosis is afhankelijk van de stam, aangezien verschillende bacteriën een verschillend pH-overlevingsvermogen vertonen^36,37. Zucoloto et ^al.35 bevelen inoculatie aan met 1 x 10⁸ kve per dier. Representatieve resultaten die hier worden getoond, zijn gegenereerd met muizen die zijn geïnoculeerd met een nachtelijke kweek (cfu werd niet bepaald). Pilot-experimenten kunnen worden uitgevoerd om een dosis te bepalen die resulteert in een betrouwbare kolonisatie van de muizenstam van belang. Het volume bacteriën dat via een mondsonde moet worden toegediend, kan worden beïnvloed door de leeftijd en het gewicht van de muizen. Raadpleeg het individuele laboratorium of het instellingsprotocol voor dierethiek voor maximaal toegestane doses. Het hier voorgestelde volume is gebaseerd op een maagsonde van 10% van het lichaamsgewicht van de muis (bijv. maximaal 200 μl voor een muis van 20 g). Sommige bacteriesoorten verdragen de zuurgraad van de maag niet en slagen er niet in de darm te koloniseren. Overweeg om eerst te gavagen met 100 μL 1 M NaHCO₃ om maagzuur te neutraliseren². Als een strikte anaëroob wordt gebruikt om te koloniseren, moet de microbe onder anaërobe omstandigheden worden gekweekt en overgebracht naar de gnotobiotische dierenfaciliteit in individueel bereide luchtdichte containers (1 voor elke muis). Voer elke maagsonde snel uit zodra de container is geopend om het verlies van microbiële levensvatbaarheid als gevolg van blootstelling aan zuurstof te beperken.
   3. Controleer muizen op nadelige gezondheidseffecten.
      OPMERKING: Raadpleeg in geval van nadelige gezondheidseffecten de normen die zijn vastgesteld door de betreffende dierenverzorger. Mogelijke nadelige gezondheidseffecten omvatten, maar zijn niet beperkt tot: (1) Aspiratie van maagsondevloeistof: symptomen zijn onder meer het uitstoten van bellen via de neus, "open mond" ademen/hijgen. (2) Perforatie van de slokdarm: symptomen zijn onder meer snel verslechterende gezondheid, vooroverbuiging, lethargie, leidend tot de dood van het dier binnen 24 uur. (3) Ontsteking van de slokdarm als gevolg van herhaalde maagsondes: symptomen zijn onder meer moeite met het inbrengen van de maagsondenaald. (4) Diarree als gevolg van veranderingen in het microbioom.
   4. Bevestig bacteriële kolonisatie in fecale pellets door ten minste eenmaal per week te kweken en/of door 16S rRNA-sequencing³⁵.
      OPMERKING: Als u fokkers koloniseert in een gnotobiotische isolator voor de productie van experimentele muizen, plan dan ten minste 9 weken van tevoren voor het genereren van 6 weken oude experimentele muizen van de eerste generatie nakomelingen (F1). Als alternatief kunnen volwassen GF-muizen worden gemonokoloniseerd. Bij deze benadering wordt aanbevolen om 7 weken na kolonisatie te wachten voorafgaand aan faaginoculatie, omdat dit de tijd is die nodig is voor het darmslijmvlies om te stabiliseren na introductie van een complexe microbiota in GF-muizen³⁸.
2. Orale inoculatie van T4-faag in E. coli monokoloniseerde muizen
   1. Verdun T4-faaglysaten en mediumbesturingen tot een vooraf bepaalde concentratie in SM-buffer. Volgens Hsu et ^al.2 faaglysaten verdunnen om toediening van 2 x 10⁶ pfu per muis mogelijk te maken².
      OPMERKING: Afhankelijk van de stabiliteit van de faag in vivo kan een hogere of lagere concentratie faag worden gebruikt. Doses van 2 x 10², 2 x 10⁴ en 2 x 10⁶ pfu T4-faag per muis resulteerden in een stabiele en langdurige kolonisatie in de darm die niet dosisafhankelijk leek te zijn (weergegeven in de rubriek representatieve resultaten). De kinetiek van faagbacteriën moet daarom in vivo worden getest voorafgaand aan grootschalige experimenten.
   2. Onder steriele, gnotobiotische omstandigheden moet elke muis worden gespoeld met 100 μL geautoclaveerde 1 M NaHCO₃ om maagzuur te neutraliseren. Wacht 10 minuten en spoel vervolgens met 100 μL T4-faaglysaat of voertuigbesturing.
   3. Controleer muizen op nadelige gezondheidseffecten.

3. Bewaking van T4-faagniveaus in vivo

OPMERKING: Zodra muizen zijn geïnoculeerd met faag, kan de concentratie van zowel fagen als doelbacteriën worden gemeten in fecale of weefselmonsters. Dit geeft informatie over de kinetiek van de faaginfectie en kolonisatiedynamiek van beide organismen.

1. Spot plating T4 faag om de concentratie in fecale pellets te bepalen
   1. Verzamel fecale pellets van elke muis in steriele, vooraf gewogen, microcentrifugebuisjes om T4-faag- en E. coli-niveaus te meten. Bewaar buisjes op ijs tot ze plat zijn.
      OPMERKING: Plaats monsters op ijs in de tussentijd tussen het verzamelen en het uitplateren om de groei van aerotolerante bacteriën te vertragen. Gedurende enkele uren kan er nog steeds groei van aërobe bacteriën zijn, of enige dood van anaërobe bacteriën als gevolg van blootstelling aan zuurstof, wat kan leiden tot scheve bacterietellingen. Daarom moeten bacteriën en faagbeplating zo snel mogelijk na de monsterafname worden uitgevoerd. Obligate anaërobe bacteriën tolereren geen blootstelling aan zuurstof. Om het monster te bewaren, verzamelt u monsters in afgesloten buizen en brengt u de buizen zo snel mogelijk na afname over naar een anaërobe kamer. Als er geen groei wordt gedetecteerd in fecale monsters, overweeg dan alternatieven zoals 16S rRNA qPCR voor bacteriële kwantificering.
   2. Noteer het eindgewicht van elke buis en bereken het monstergewicht door het oorspronkelijke buisgewicht af te trekken. Dit zal worden gebruikt voor het normaliseren van de T4-faag- en E. coli-concentratie tot monstergewicht (respectievelijk pfu/g of cfu/g).
   3. Voeg 1 ml steriele SM-buffer toe aan elke buis en draai grondig op maximale snelheid (>1 min) om fecale pellets te homogeniseren. Als het monster kleiner is dan 15 mg, mag een kleiner volume SM-buffer worden toegevoegd. Noteer het volume SM-buffer dat aan elk monster is toegevoegd voor berekeningen van kve/g of pfu/g monster.
   4. Bereid een reeks van 8 (of meer, afhankelijk van de verwachte faagconcentratie) seriële verdunningen van 20 μl van elk monster in een SM-buffer van 180 μl, in factoren van 10. Draai elk gehomogeniseerd monster kort om te mengen voordat het aan de eerste buis/put wordt toegevoegd. Pipetteer om tussen elke toevoeging te mengen en verwissel de tips tussen elke verdunning om te voorkomen dat het aantal fagen of bacteriën wordt opgeblazen via monsteroverdracht.
      OPMERKING: Als vezels en vuil in het monster het pipetteren belemmeren, voeg dan extra buffer toe aan de fecale suspensie om het voorraadmonster verder te verdunnen.
   5. Breng 5 μl van elke verdunning aan op LB-zachte agarplaten met E. coli (voor faagplaque-assays) of LB-agar-platen (1,5% agar, voor bacteriële kolonie-assays) om de T4-faag- en E. coli-concentratie in elk monster te bepalen. Voor nauwkeurigheid ziet u elk monster in drievoud.
      OPMERKING: Bij het bereiden van seriële verdunningen in een plaat met 96 putjes, kan een 8-kanaals P20-meerkanaalspipet worden gebruikt om elke kolom serieel verdund monster op platen te pipetiseren. Verwissel de punten tussen elke verdunning, zelfs als u van de meest verdunde naar de meest geconcentreerde gaat, aangezien de faag zich aan de wanden van de pipetpunt kan hechten en de hoeveelheid faag die aan elk nieuw putje wordt toegevoegd, kan veranderen³¹.
   6. Laat elke plek drogen voordat u de plaat omkeert en in de couveuse plaatst. Incubeer een nacht bij 37 °C.
   7. Selecteer voor elk monster de verdunning waarbij er 3-30 telbare plaques per plek zijn. Tel en noteer het aantal plaques op de plek en de gebruikte verdunning.
   8. Bereken pfu/g monster door het aantal plaques te delen door het volume dat op elke plek is uitgeplateerd om pfu/μL te verkrijgen. Vermenigvuldig dit met de verdunningsfactor en met het volume SM-buffer dat aan elk monster is toegevoegd om pfu/monster te verkrijgen. Deel ten slotte door het gewicht van het monster om pfu/g³⁰ te verkrijgen.
      
      
2. Weefselbemonstering op experimentele eindpunten
   1. Euthanaseer muizen op elk geselecteerd tijdstip volgens het goedgekeurde institutionele protocol voor dierethiek en verzamel de inhoud van de blindedarm, de inhoud van de dunne en dikke darm en alle weefsels die van belang zijn in steriele, vooraf gewogen microcentrifugebuisjes van 2 ml met ronde bodem.
   2. Noteer het eindgewicht van elke buis om het monstergewicht te berekenen. Bewaar tissues en cecale inhoud op ijs tot ze dezelfde dag worden plateerd.
   3. Voeg steriele SM-buffer toe aan elke buis en noteer de toegevoegde volumes.
   4. Voor de cel- en darminhoud worden de vortexmonsters grondig (>1 min) genomen volgens stap 3.1.3.
   5. Voeg voor weefselmonsters een steriele metalen kraal toe aan elk buisje. Homogeniseer weefsels met behulp van een weefsellyser (zie materiaaltabel) bij 20 Hz gedurende 5 minuten of totdat de weefsels zijn gedissocieerd en de suspensie homogeen is.
      OPMERKING: Als monsters niet goed homogeniseren, overweeg dan om het volume van de toegevoegde SM-buffer te verhogen, de homogenisatietijd te verlengen of de homogenisatiefrequentie te verhogen tot 30 Hz. Een weefselhomogenisator kan ook worden gebruikt om weefsels te dissociëren, terwijl het herstel van bacteriën en fagen mogelijk maakt^39,40. Homogenisatoren werken met hogere frequenties dan weefsellysers met behoud van de integriteit van bacteriën.
   6. Bereid seriële verdunningen van elk monster voor in factoren van 10 en voer spotplating uit om de E. coli - en T4-faagconcentraties in elk monster te bepalen, zoals beschreven in stap 3.1.4-3.1.8⁴¹.

Resultaten

Om de interacties tussen de T4-faag/E. coli-dyade in de darm van muizen te onderzoeken, werden T4-faag en vehiculumlysaten bereid, gereinigd en gezuiverd (Figuur 1A). T4-faaglysaten werden getitereerd door middel van plaquetest en verdund tot 2 x 10⁷ pfu/ml (2 x 10⁶ pfu/muis) in SM-buffer. Voertuiglysaten werden ook getiterd om te bevestigen dat er geen levensvatbare faagaanwezigheid was en verdund in hetzelfde volume SM-buffer als het T4-faaglysaat. Endotoxineniveaus werden gekwantificeerd in verdunde lysaten met behulp van een chromogene endotoxine-kwantificeringskit. T4-faag, warmte-geïnactiveerde faag en vehiculumlysaten hadden endotoxineniveaus die lager waren dan aanvaardbare niveaus voor drinkwater (<20 EU/ml)²⁵ (figuur 1B). Aangezien het vehiculumlysaat een vergelijkbare hoeveelheid endotoxine bevatte als het T4-faaglysaat, werd het als een geschikte controle beschouwd. Het door warmte geïnactiveerde faaglysaat (2 x 10⁷ pfu/ml voorafgaand aan de warmtebehandeling) bevatte minder endotoxine dan zowel het vehiculum als het T4-faaglysaat. Volgens de instructies van de kit werden monsters die met 1-octanol waren behandeld, getest op remming van de test door toevoeging van een endotoxinestandaard aan het mediumlysaat (verrijkt medium), om een uiteindelijke concentratie van 0,5 EU/ml te verkrijgen. De endotoxineniveaus met pieken minus de endotoxineniveaus van het vehiculum bedroegen 0,5 EU/ml ±25%, volgens de aanbevelingen van de fabrikant (figuur 1B). Dit toonde aan dat 1-octanol met succes was verwijderd en dat er geen remming van de test was veroorzaakt door de lysaten die de resultaten van de test zou kunnen verstoren.

E. coli K-12 (BW25113) monocolonized C57BL/6 muizen werden gefokt in een steriele flexibele film vinylisolator onder gnotobiotische omstandigheden (Figuur 2A). Muizen van de F0-generatie werden gekoloniseerd met E. coli door toevoeging aan hun omgeving en co-housing. Alleen de nakomelingen (F1- en F2-generatie) die vanaf de geboorte met E. coli werden gekoloniseerd door verticale transmissie en co-housing werden gebruikt voor experimenten. Deze strategie controleerde voor de veranderingen in het immuunsysteem, de slijmproductie en de ontwikkeling van het maagdarmkanaal die optreden als reactie op bacteriële inoculatie^22,37, waardoor veranderingen kunnen worden gemeten die alleen optreden als gevolg van de introductie van fagen. Eenmaal volgroeid, werden experimentele muizen overgebracht naar steriele isocages, waar ze elk 2 x 10⁶ pfu T4-faag of een gelijk volume vehiculumlysaat kregen via een orale sonde op een leeftijd van 6-8 weken. De overvloed aan T4-fagen en E. coli werd gedurende vier weken gecontroleerd door het verzamelen van fecale pellets en spotplating-assays op respectievelijk 0,5% (zachte) agar of 1,5% agar. In de loop van dit experiment konden T4-faag en E. coli naast elkaar bestaan zonder dat een van beide populaties werd uitgeput (Figuur 2B, C). Orale toediening van T4-faag in lagere doses van 2 x 10² en 2 x 10⁴ pfu/muis verminderde het vermogen van de T4-faag om de darm te koloniseren niet in vergelijking met 2 x 10⁶ pfu (Figuur 2D). Evenzo werd geen dosisafhankelijk effect van T4-inoculatie op de E. coli-spiegels waargenomen (figuur 2E).

Belangrijk is dat consistentie in beplating tussen monsters cruciaal bleek te zijn voor het aantal plaques. Bij het toevoegen van bacteriën aan de zachte agar werd bijvoorbeeld vastgesteld dat de dichtheid van bacteriën de uitkomst van de test sterk beïnvloedde. Toevoeging van E. coli die gedurende 1 uur, 1,5 uur of 2 uur werd gesubcultureerd, resulteerde in een lager aantal plaques dan bij de toevoeging van E. coli die gedurende 2,8 uur of langer werd gesubcultureerd. Bovendien stabiliseerde de kwantificering van plaque zich op ~1 x 10⁹ pfu/ml wanneer E. coli gedurende 2,8 uur tot 16 uur ('s nachts) werd gesubcultureerd, wat ongeveer een 5-voudige toename was in vergelijking met de waarde berekend op basis van een subcultuur van 1 uur (~2 x 10⁸ pfu/ml) (Figuur 3A). In plaats van subculturing kunnen doelbacteriën worden geïnoculeerd in zachte agar uit nachtelijke culturen. Hier had het volume van de 16 uur ('s nachts) E. coli-cultuur die in de zachte agar werd geïnoculeerd, invloed op het aantal plaques (Figuur 3B). Deze resultaten geven aan dat de dichtheid van E. coli in de agar het aantal plaquetests kan beïnvloeden. In beide benaderingen bleven de resultaten van de kwantificering van de fagen steken op dezelfde waarde (10⁹ pfu/ml), wat suggereert dat de doelbacteriën een voldoende hoge dichtheid in de zachte agar moeten hebben om de nauwkeurigheid van het aantal plaques te garanderen.

Alles bij elkaar benadrukken deze resultaten het belang van het ontwikkelen van een begrip van de kinetiek van faag-bacteriën door middel van in vitro en in vivo pilotexperimenten voorafgaand aan het uitvoeren van experimentele manipulaties.

Figuur 1: Bereiding van faaglysaten. (A) Workflow voor het starten van een faaglysaat uit een faag met een hoge titer. Lysaten werden vermeerderd, gereinigd, geconcentreerd en endotoxinen werden verwijderd. Verontreinigende 1-octanol werd verwijderd door middel van snelheidsvacuüm. (B) Endotoxinen werden gekwantificeerd in faag- en mediumlysaten met behulp van een chromogene endotoxinekwantificeringskit. Blauwe stippellijnen geven de boven- en ondergrens aan om de productremming in de productremmingscontrole te weerleggen (0,5 EU/ml ± 25%). Elk punt vertegenwoordigt een van de twee technische replicaten. De hoogte van de staaf vertegenwoordigt het gemiddelde van de replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Generatie van monokoloniseerde muizen en monitoring van faag- en bacterieniveaus in fecale pellets. (A) Workflow voor het koloniseren van kiemvrije muizen met een enkele bacteriesoort en het genereren van F1- en F2-monokoloniseerde muizen. (B-E) Niveaus van T4-faag en E. coli gedetecteerd in fecale pellets van C57BL/6-muizen die monokoloniseerd met E. coli werden geboren en werden geïnoculeerd met T4-faag op 6-8 weken oud. Op dag 0 (pre-kolonisatie) en de aangegeven dagen na kolonisatie werden T4-faagniveaus gemeten door middel van spotplating en plaque-assays met behulp van de enkele agarlaagmethode. E. coli-niveaus werden gemeten door middel van spotplating op 1,5% LB-agar. (B, C) Kinetiek van (B) T4-faag- en (C) E. coli-niveaus in teruggewonnen fecale pellets na inoculatie met 2 x 10⁶ pfu T4-faag of voertuiglysaat (genormaliseerd voor volume- en endotoxineniveaus). (D, E) D) T4-faag en E) E. coli in teruggewonnen fecale pellets na inoculatie met 2 x 10² pfu, 2 x 10⁴ pfu of 2 x 10⁶ pfu T4-faag. Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Nauwkeurigheid van probleemoplossing bij plaque-assays. (A) T4-faaglysaattiter met behulp van E. coli-nachtculturen of subculturen voor de bereiding van zachte agar (0,5% agar, LB). Subculturen werden gemaakt met behulp van een 1:50 verdunning van een nachtelijke E. coli-cultuur in verse LB. 5 ml zachte agarpreparaten werden geënt met 100 μL E. coli en 20 μL T4-faag. CaCl₂ en MgSO₄ werden voor deze tests niet aan zachte agar toegevoegd, maar kunnen desgewenst worden toegevoegd. E. coli-subcultuurtijden van minder dan 2,8 uur resulteerden in een lagere schijnbare fagtiter. (B) T4-faaglysaattiter met verschillende E. coli-dichtheden in zachte agarbereiding. Het toevoegen van verschillende volumes E. coli uit een nachtelijke cultuur (niet gesubcultureerd, zoals in A) aan de zachte agar resulteerde in verschillende schijnbare faagtiters. Foutbalken vertegenwoordigen de berekende onzekerheid van de faagtiter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De studie van fagen in het microbioom vormt een aanzienlijke uitdaging in vergelijking met hun bacteriële tegenhangers. In het bijzonder bevatten fagen geen geconserveerde fylogenetische marker die alle fagen gemeen hebben en die verwant is aan de 16S- en 18S-ribosomale subeenheden die het gemakkelijker maken om respectievelijk prokaryote en eukaryote soorten te sequencen en te identificeren⁴². Echter, met de vooruitgang in de volgende generatie sequencing-benaderingen, waaronder toenemende leeslengtes, doorvoer en dalende kosten, komt de snelle uitbreiding van bacteriofaag-genoomdatabases 42,43,44. Nu er veel voorbereidend werk is gedaan voor het ontdekken van fagen, is faagonderzoek nu toegankelijker dan ooit. Als belangrijke leden van het darmmicrobioom en de meest genetisch diverse organismen op aarde, bieden fagen een opwindende invalshoek voor nieuw onderzoek naar de complexiteit van het microbioom. De hier beschreven protocollen richten zich op het onderzoeken van bekende faagsoorten bij muizen die gekoloniseerd zijn met hun doelbacteriën. Opgemerkt moet worden dat deze protocollen een richtlijn bieden voor het bestuderen van fagen in vivo en kunnen worden uitgebreid met de groei van het veld.

Bacteriofaagonderzoek voor therapeutische behandeling van bacteriële infecties raakte grotendeels uit de mode met de komst van antibiotica in de jaren 1940. Overmatig voorschrijven en verkeerd gebruik van antibiotica heeft echter de opkomst van multiresistente ziekteverwekkers versneld als een groot probleem voor de^{volksgezondheid3}. Fagen vormen een aantrekkelijk potentieel alternatief voor antibiotica, vanwege hun hoge mate van^{gastheerspecificiteit3}. Belangrijk is dat, aangezien fagen van nature hun intrek nemen als leden van het menselijke darmmicrobioom, het noodzakelijk is om eerst de rol te begrijpen die fagen spelen in deze complexe omgevingen. Hoewel veel studies de relatie tussen een faag en zijn doelbacteriën in vitro hebben onderzocht, is het belangrijk om na te gaan hoe deze relaties stand kunnen houden in het landschap van het maagdarmkanaal. Net als in verkennende studies die de bacteriële componenten van de microbiota onderzoeken, stellen vereenvoudigde muismodellen zoals GF en monocolonized muizen ons in staat om de effecten van fagen op de doelsoort te isoleren en hoe deze relatie bijdraagt aan de immuunrespons. Dit is een belangrijke stap in de richting van faagtherapie, omdat sommige fagen mogelijk geen voordeel bieden wanneer ze in de darm worden geïntroduceerd. De Pseudomonas aeruginosa-faag Pf4 verergert bijvoorbeeld de ziekte die door zijn gastheer wordt veroorzaakt, door zowel antibacteriële immuunresponsen als keratinocytenmigratie te remmen, wat resulteert in verminderde wondgenezing ^18,45. De hier beschreven procedures zijn bedoeld om technieken te standaardiseren voor het bestuderen van fagen als leden van de muizenmicrobiota. In navolging van baanbrekende studies die de impact van de microbiota op de metazoaire gastheer onderzoeken, kan voortgezet onderzoek naar fagen binnen de context van de microbiota opwindend en belangrijk zijn voor het bredere begrip van het^multibioom46.

Beperkingen
De hier beschreven protocollen zijn geoptimaliseerd voor het bestuderen van de competitie tussen T4-faag en zijn doelbacterie, E. coli, wanneer T4-fagen via een orale maagsonde worden toegediend aan E. coli-monocolonized muizen. Net als bacteriën gedragen verschillende faagsoorten zich anders van elkaar, met verschillende replicatietijden, burstgroottes en bereiken van bacteriële doelen⁴⁷. Daarom moet men bij het onderzoeken van andere faag-bacterieparen in vergelijkbare diermodellen ervoor zorgen dat deze protocollen bij alle stappen worden geoptimaliseerd. Fagen met een langere replicatietijd en/of een kleinere burstgrootte kunnen bijvoorbeeld een langere incubatie met hun bacteriële doelwit nodig hebben voor de productie van een lysaat met een hoge titer. Evenzo kan het nodig zijn de incubatietijd van de plaat te verlengen voor plaque-assays. Bovendien kunnen fagen met een korte replicatietijd en/of een hoge barstgrootte kortere plaatincubaties nodig hebben, omdat nachtelijke incubatie kan leiden tot overgroei van plaque. Als de vermeerderingsomstandigheden voor een specifieke faag van belang onbekend zijn, moet de basis voor het bepalen van de groeiomstandigheden worden gelegd voordat met in-vivowerk ^{wordt begonnen 48}.

Ig-achtige domeinen die worden aangetroffen in de Hoc-capside-eiwitten van de T4-faag vergemakkelijken de hechting aan darmslijm¹¹. Afhankelijk van het slijmbindende vermogen van de faag naar keuze, kan de kinetiek van faagbacterieniveaus in fecale monsters afwijken van de resultaten in figuur 2B-E. In darm-op-een-chip-systemen werd bijvoorbeeld aangetoond dat fagen die intacte Hoc-eiwitten bevatten, een verhoogde E. coli-dodende capaciteit hadden in vergelijking met Hoc-deficiënte faag¹¹. Hoewel wordt vermoed dat T4-fagen worden vastgehouden door slijmbinding in vivo 11,12,13, kan de impact van herinoculatie door het coprofagische gedrag van muizen niet worden uitgesloten. Deze effecten kunnen worden verminderd door het gebruik van draadkooibodems of door regelmatig van kooi te wisselen. Aangezien Ig-achtige domeinen niet zijn geïdentificeerd in ssDNA- of RNA-fagen⁴⁹, zal het interessant zijn om de andere strategieën die door fagen worden gebruikt om zich in het darmslijmvlies te vestigen, uit elkaar te halen.

Ten slotte hebben deze verkennende studies alleen faag-bacterie-gastheerinteracties bij homeostase onderzocht. In diermodellen van menselijke ziekten is het onbekend hoe veranderingen in de integriteit van de darmbarrière, zoals bij IBD, deze interacties kunnen beïnvloeden. Recente studies hebben aangetoond dat Caudovirales-fagen de rijkdom en diversiteit hebben vergroot bij patiënten met IBD ^7,8. In muismodellen werd aangetoond dat continue faagbehandeling dextraannatriumsulfaat (DSS)-geïnduceerde experimentele colitis verergerde⁸. Het moet nog worden bepaald hoe faag-bacterie-gastheerinteracties zich afspelen in inflammatoire omgevingen, en of verminderde barrière-integriteit faag-geïnduceerde ontsteking faag vergemakkelijkt.

Problemen oplossen en alternatieve methoden

Muis modellen
Monocolonized muismodellen maken het mogelijk om een enkele bacteriesoort te ondervragen over de fysiologie van de gastheer¹⁶. Onderzoek met muizen met monokolonisatie heeft een cruciale rol gespeeld bij het ophelderen van hoe de microbiota het immuunsysteem beïnvloedt²². Als modelsysteem recapituleren muizen met monokolonisatie niet de fysiologie van hun conventionele microbiota-tegenhangers. Meer vergelijkbaar met GF-muizen, hebben E. coli-monocolonized muizen een verminderde slijmproductie (vergelijkbaar met GF-muizen⁵⁰) en een onvolgroeid immuunsysteem²³. Muizen met monokolonisatie zijn echter van onschatbare waarde geweest voor het ontrafelen van de microbe-specifieke effecten van individuele soorten op de ontwikkeling van het maagdarmkanaal en het immuunsysteem. Een klassiek voorbeeld is de ontdekking dat gesegmenteerde filamenteuze bacteriën (SFB) krachtige inductoren zijn van CD4⁺ T-helper 17-cellen bij muizen²⁴. Met betrekking tot slijm zijn er microbe-specifieke effecten op slijm-gentranscriptie⁵¹en slijmdikte⁵⁰. Hoewel beperkt, bieden muizen met monokolonisatie mogelijkheden om de impact van één faag-bacteriepaar op de zoogdiergastheer in een gecontroleerd model te onderzoeken. Belangrijk is dat fagen kunnen en moeten worden onderzocht in de context van een complexe microbiota. Op het moment van schrijven hebben maar weinig studies de effecten van faagpredatie van commensale bacteriesoorten binnen een conventioneel microbioom onderzocht. Dit is een toekomstige toepassing van de protocollen die in dit document worden gepresenteerd, die kunnen worden aangepast om deze studies te vergemakkelijken.

Gebruik van geschikte bedieningsorganen voor voertuigen
Passende controles zijn essentieel in elk experiment. Hier werd een geschikt medium voor orale toediening aan muizen gedefinieerd dat controleert voor de meerstapsreiniging en zuivering van T4-faaglysaten. Een belangrijke vereiste is dat de mediumcontrole een gelijk niveau van bacteriële endotoxinen bevat als het faaglysaat, om te controleren op een endotoxine-gemedieerde immuunrespons. Chloroform en 1-octanol worden als onderdeel van het zuiveringsproces aan het lysaat toegevoegd en vervolgens verwijderd. Om te controleren op mogelijke immuunresponsen die kunnen worden gegenereerd op sporenniveaus van deze chemicaliën, kan een faagvrij bacterieel lysaat worden geproduceerd als voertuigcontrole. T4-faag- en mediumlysaten bevatten een zeer lage concentratie bacteriële endotoxinen, ruim onder de niveaus die in drinkwater^{zijn toegestaan 25} (figuur 1B). Alternatieve controles kunnen worden gebruikt en kunnen worden aangepast aan de beoogde onderzoeksvraag. Het meest eenvoudige is dat faagbuffer met een equivalente hoeveelheid endotoxine kan worden gebruikt, hoewel dit geen rekening houdt met de reinigings- en zuiveringsprocessen die uit meerdere stappen bestaan. Gogokhia et ^al.8rapporteerden het gebruik van door warmte geïnactiveerde faag als controle om te bepalen of faageiwit zonder DNA voldoende was om een immuunrespons op te wekken. In onze handen had de door warmte geïnactiveerde faag lagere niveaus van endotoxine dan het T4-faaglysaat (Figuur 1B), en werd daarom niet gebruikt om te controleren op endotoxineniveaus in deze studie. We moedigen echter het testen van beide protocollen aan om te bepalen welke methode het meest geschikt is voor individuele experimentele doeleinden. Als het vehiculum en de T4-faaglysaten significant verschillen in de hoeveelheid aanwezig endotoxine, kan het lysaat dat de lagere niveaus bevat, worden aangevuld met gezuiverd endotoxine. 1-Octanol wordt tijdens het zuiveringsproces aan lysaten toegevoegd, maar inactiveert de chromogene endotoxine-kwantificeringskittest. Het is belangrijk om productremming door mogelijk storende stoffen in het monster te testen om ervoor te zorgen dat endotoxinemetingen nauwkeurig zijn. Als productremming wordt vermoed, is het mogelijk dat het monster niet lang genoeg snel is gevacumeerd. Als de problemen aanhouden, kan dialyse worden gebruikt om de resterende 1-octanol²⁵ te verwijderen.

Toedieningsweg en dosis
Vanwege het slijmbindende vermogen van T4-faag werden muismodellen geïnoculeerd in een enkele orale maagsondedosis. Het doel hiervan was om de duur van het samenleven van faag en E. coli in het maagdarmkanaal te volgen; Er zijn echter andere benaderingen voor het bestuderen van faag in in vivo modellen gemeld. Zo is met fagen verrijkt drinkwater gebruikt^{om muizen} continu van faag te voorzien ^8,20. Het voordeel van deze toedieningsmethode is dat fagen voortdurend worden aangevuld, zelfs als er geen bacteriële gastheer is, zoals aangetoond door Gogokhia et al.⁸. Deze experimentele opzet maakte het mogelijk om de immuunrespons op fagen in afwezigheid van bacteriën te evalueren en zorgde voor voortdurende immuunstimulatie in de loop van het experiment. Fysiologisch gezien vertegenwoordigt deze methode geen natuurlijk verloop van faaginfectie of faagkolonisatie van een darmomgeving, maar het geeft wel belangrijke inzichten in hoe herhaalde blootstelling aan fagen het immuunsysteem kan prikkelen. Dit is van belang in de context van de ontwikkeling van faagtherapie, aangezien faagcocktails kunnen worden toegediend als een behandelingskuur om bacteriële infecties in de darm te behandelen, vergelijkbaar met antibioticaregimes. In de context van het T4-faag-E. coli-paar werd vastgesteld dat het verlagen van de dosis T4-faag die oraal werd toegediend aan muizen met monokolonisatie de fecale faag- of bacterieniveaus niet veranderde (Figuur 2D, E). Daarom is in dit geval de inoculatiedosis van T4-faag niet cruciaal voor het behoud van stabiele T4-faag-E. coli-kolonisatie in de darm van gebikoloniseerde muizen. Opgemerkt wordt dat de laagste toegediende dosis 200 pfu/muis was, en de hoogste dosis 2 x 10⁶ pfu/muis (volgens Hsu et al.) ². Daarom zijn er in deze studie geen gegevens beschikbaar die de kinetiek van T4-faag-E. coli buiten dit bereik ondersteunen.

Spot- en hele plaatfaagtiters
Voor het meten van T4-faagniveaus in ontlasting en weefsels zijn de hier beschreven protocollen gebaseerd op spotplating-technieken in plaats van hele plaatplaque-assays, die kunnen bijdragen aan de variabiliteit in faagniveaus tussen muizen (Figuur 2B). Bij hele plaattechnieken worden plaques over een groter gebied geteld, waardoor een nauwkeurigere kwantificering mogelijk is. Gewoonlijk moet echter een passende verdunning van elk monster vooraf worden bepaald door middel van spotplating. Aangezien de monsters op de dag van monsterafname werden getest, werd spotplating de meest geschikte methode geacht voor een aanpak met een hogere doorvoer. Daarom wordt de resolutie van deze gegevens het meest nauwkeurig weergegeven door de orde van grootte van de faag in elk monster. Voor nauwkeurige faagmetingen zijn er aanvullende overwegingen voor elke faag. Nauwkeurigere metingen kunnen worden verkregen door tests met hele platen of door kleinere seriële verdunningsbereiken voor elk monster te gebruiken. Als deze methoden nog steeds resulteren in variabele faag- of doelbacterietellingen, zou het verstandig zijn om te beoordelen of unieke interacties tussen de faag en bacteriën verschillen tussen individuele muizen kunnen verklaren via metagenomische sequencing of andere methoden om co-evolutie en resistentie experimenteel te beoordelen. Volgens Bonilla et ^al.25 is het bij het bereiden van zachte agar voor plaque-assays belangrijk om consistent te zijn met de hoeveelheid toegevoegde bacteriële gastheer²⁵. Zoals te zien is in figuur 3, kunnen zelfs relatief kleine veranderingen in de kweektijd van bacteriën (figuur 3A) en de dichtheid (figuur 3B) de nauwkeurigheid van plaquetests beïnvloeden. Deze bevindingen kunnen anders zijn voor andere faag-bacterieparen, en soortgelijke experimenten worden aanbevolen bij het starten met nieuwe organismen. Bovendien moeten voor nieuwe faag-bacterieparen verkennende experimenten worden uitgevoerd om de groeikenmerken van elk te bepalen. Groeicurven kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd om de vertraging, exponentiële en stationaire fasen en groeisnelheid van de bacteriën te bepalen. Het eenstapsgroei-experiment kan worden gebruikt om de latente periode (tijd tot lysis) en burstgrootte (aantal fagen dat vrijkomt bij bacterielysis) van fagen te bepalen^52,53.

Alternatieve T4-faagmeting door qPCR
Het kwantificeren van fagen kan worden uitgevoerd met plaque-assays, zoals hierboven beschreven, of via kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR). Deze twee benaderingen hebben een belangrijk onderscheid: plaque-assays bepalen het aantal levensvatbare fagen dat in staat is om hun bacteriële gastheren te infecteren en te doden, terwijl qPCR faagspecifiek genetisch materiaal kwantificeert (als een proxy van het aantal aanwezige fagen), maar geen informatie geeft over de levensvatbaarheid en besmettelijkheid van de faag. qPCR's werden uitgevoerd om de kwantificering van faaggenkopieën te vergelijken met plaques gevormd in plaque-assays met behulp van primers beschreven door Hsu et ^al.2 (Figuur 4). T4-faag-DNA werd geëxtraheerd en geamplificeerd uit de cecale inhoud van T4-faag/E. coli bikoloniseerde muizen. Bij de meeste muizen detecteerden qPCR- en plaquetests vergelijkbare niveaus van T4-faag in de blindedarminhoud (Figuur 4A, B). Hoewel enige amplificatie werd gedetecteerd in de inhoud van de ingeënte blindedarm van het voertuig, lagen de berekende genkopieën/g onder de detectiegrens (LOD) (Figuur 4A). De afwezigheid van kwantificeerbare fagen in deze monsters werd bevestigd door gelelektroforese. T4-faaggenproducten (96 bp) werden gemakkelijk gevisualiseerd in DNA geïsoleerd uit de cecale inhoud van T4-geïnoculeerde muizen, maar waren afwezig in de voertuigcontroles (Figuur 4C).

In deze tests werden T4-faaggenkopieën gedetecteerd in de cecale inhoud van een T4-faagge-gekoloniseerde muis door qPCR (Figuur 4A, pijl) ondanks het onvermogen om T4 te detecteren in plaque-assays van hetzelfde monster (Figuur 4B, pijl). Deze resultaten suggereren dat virale deeltjes die geen plaques vormen, in vivo kunnen ontstaan, hetzij als gevolg van de productie van defecte virale deeltjes, hetzij als gevolg van co-evolutie van fagen en/of bacteriën. Bacteriële uitplatingtechnieken op harde agar kunnen worden gebruikt om de gevoeligheid van fecale bacteriën voor faag¹⁴ te bepalen. We suggereren dat qPCR-gemedieerde detectie een waardevolle aanvulling kan zijn op in vivo faagworkflows, omdat het robuuster kan zijn voor faagevolutie in het darmmilieu, aangezien het zich richt op korte, geconserveerde gensequenties. Niet-bevooroordeelde benaderingen zoals metagenomica zijn waardevol voor het onderzoeken van faag-bacteriële co-evolutie en relatieve abundanties, maar kunnen uiteindelijk duurder zijn.

Figuur 4: Detectie vanT4-faag door qPCR. (A,B) T4-faagbelasting werd gemeten via (A) absolute qPCR of (B) plaquetest in de cecale inhoud van E. coli gekoloniseerde C57BL/6-muizen op dag 29 na inoculatie met T4-faag of -vehiculum. De pijl geeft de resultaten aan van een individuele muis die detecteerbare T4-genoomkopieën had, maar geen plaquabel virus in de cecale inhoud. (C) Gelelektroforese van PCR-producten die de aanwezigheid van de 96 bp-band aantonen in met T4-fagen geïnoculeerde blindedarmmonsters, maar niet in geïnoculeerde monsters van het medium. Er werd gebruik gemaakt van een DNA-ladder van 100 bp. LOD = detectiegrens. Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde en de SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Toepassingen
Bacteriofagen vertegenwoordigen meer dan 90% van de virusachtige deeltjes die aanwezig zijn in het microbioom⁴⁴; De impact van fagen op het darmmicrobioom is echter slecht begrepen. De eerste studies die de bacteriële component van het microbioom onderzochten, deden dit door bepaalde soorten te isoleren en hun impact op de rijping van het immuunsysteem te bestuderen^22,24. Soortgelijke ondervragingen van het fageoom vormen een ontmoedigende maar noodzakelijke taak, en een vereiste om een alomvattend begrip van het multibioom te krijgen⁴⁶. Hoewel de focus van de ontwikkeling van faagtherapie meestal gericht is op het genezen van septische bacteriële infecties, is het belangrijk om te begrijpen hoe de toevoeging van een faagcocktail aan het maagdarmkanaal het darmecosysteem kan veranderen. Bovendien moet de veiligheid van therapeutische faagcocktails worden beoordeeld door een immuunprofiel te genereren. Fagen zijn onderzocht als mogelijke behandelingen voor bacteriële darminfecties zoals C. difficile⁵ en Salmonella enterica serovar Typhimurium⁵⁴. Recente studies hebben ook aangetoond dat FFT's even effectief of effectiever zijn bij de behandeling van necrotiserende enterocolitis bij te vroeg geboren varkens⁹, wat suggereert dat de virale component van fecale microbiota-transplantaties (FMT's) een actieve rol kan spelen bij het verminderen van ziekten. Voortgezet onderzoek naar de rol van fagen in het microbioom is gerechtvaardigd om de ontwikkeling van faagtherapieën tegen darmpathogenen te bevorderen, maar ook om FMT's beter te informeren als behandeling voor ziekten. Door methoden voor de studie van fagen in vivo te standaardiseren, zullen de transparantie en reproduceerbaarheid in faagonderzoek worden vergroot, samen met richtlijnen voor degenen die hun werk uitbreiden naar muismodellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100