Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65921

⸱

20 oktober 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De bloed-hersenbarrière (BBB) speelt een cruciale rol bij het in stand houden van een stabiele en gezonde hersenomgeving. BBB-disfunctie wordt in verband gebracht met veel neurologische aandoeningen. We hebben een 3D, stamcel-afgeleid model van de BBB ontwikkeld om cerebrovasculaire pathologie, BBB-integriteit te onderzoeken en hoe de BBB wordt veranderd door genetica en ziekte.

Samenvatting

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een belangrijk fysiologisch onderdeel van het centrale zenuwstelsel (CZS), dat voedingsstoffen in stand houdt, afvalstoffen opruimt en de hersenen beschermt tegen ziekteverwekkers. De inherente barrière-eigenschappen van de BBB vormen een uitdaging voor therapeutische medicijnafgifte in het CZS om neurologische aandoeningen te behandelen. Een verminderde BBB-functie is in verband gebracht met neurologische aandoeningen. Cerebrale amyloïde angiopathie (CAA), de afzetting van amyloïde in de cerebrale vasculatuur die leidt tot een gecompromitteerde BBB, is een comorbiditeit in de meeste gevallen van de ziekte van Alzheimer (AD), wat suggereert dat BBB-disfunctie of -afbraak betrokken kan zijn bij neurodegeneratie. Vanwege de beperkte toegang tot menselijk BBB-weefsel blijven de mechanismen die bijdragen aan een goede BBB-functie en BBB-degeneratie onbekend. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een van menselijke pluripotente stamcellen afgeleide BBB (iBBB) ontwikkeld door endotheelcellen, pericyten en astrocyten in een 3D-matrix op te nemen. De iBBB assembleert zichzelf om de anatomie en cellulaire interacties in de BBB te recapituleren. Het zaaien van iBBB's met amyloïd legt de belangrijkste aspecten van CAA vast. Daarnaast biedt de iBBB een flexibel platform om genetische en omgevingsfactoren die betrokken zijn bij cerebrovasculaire aandoeningen en neurodegeneratie te moduleren, om te onderzoeken hoe genetica en levensstijl het ziekterisico beïnvloeden. Ten slotte kan de iBBB worden gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen en medicinale chemische studies om de therapeutische afgifte aan het CZS te optimaliseren. In dit protocol beschrijven we de differentiatie van de drie soorten cellen (endotheelcellen, pericyten en astrocyten) die voortkomen uit menselijke pluripotente stamcellen, hoe de gedifferentieerde cellen in de iBBB kunnen worden samengevoegd en hoe CAA in vitro kan worden gemodelleerd met behulp van exogeen amyloïde. Dit model overwint de uitdaging om levend menselijk hersenweefsel te bestuderen met een systeem dat zowel biologische getrouwheid als experimentele flexibiliteit heeft, en maakt het mogelijk om de menselijke BBB en zijn rol in neurodegeneratie te ondervragen.

Inleiding

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een belangrijk microvasculair netwerk dat het centrale zenuwstelsel (CZS) scheidt van de periferie om een ideale omgeving te behouden voor een goede neuronale functie. Het speelt een cruciale rol bij het reguleren van de instroom en uitstroom van stoffen in het CZS door de metabole homeostase 1,2,3,4 te handhaven, afvalstoffen 4,5,6 op te ruimen en de hersenen te beschermen tegen ziekteverwekkers en toxines 7,8.

Het primaire celtype van de BBB is de endotheelcel (EC). Endotheelcellen, afgeleid van de mesodermlijn, vormen de wanden van het vaatstelsel 1,9. Microvasculaire EC's vormen tight junctions met elkaar om de permeabiliteit van hun membraan sterk te verminderen 10,11,12,13,14 terwijl transporters tot expressie worden gebracht om de beweging van voedingsstoffen in en uit het CZS te vergemakkelijken 1,4,12,14 . Microvasculaire EC's worden omringd door pericyten (PC's)-murale cellen die de microvasculaire functie en homeostase reguleren en van cruciaal belang zijn voor het reguleren van de permeabiliteit van de BBB voor moleculen en immuuncellen 15,16,17. De astrocyt, een belangrijk gliaceltype, is het uiteindelijke celtype waaruit de BBB bestaat. Astrocyten-eindvoeten wikkelen zich rond de EC-PC-vaatbuizen, terwijl de cellichamen zich uitstrekken tot in het hersenparenchym en een verbinding vormen tussen neuronen en vasculatuur1. Verschillende transporters van opgeloste stoffen en substraat zijn gelokaliseerd op astrocyt-eindvoeten (bijv. aquaporine 4 [AQP-4]) die een cruciale rol spelen in de BBB-functie 18,19,20,21.

De BBB is van cruciaal belang voor het handhaven van een goede hersengezondheidsfunctie, en disfunctie van de BBB is gemeld bij veel neurologische aandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD) 22,23,24,25, multiple sclerose 7,26,27,28, epilepsie29,30 en beroerte 31,32. Het wordt steeds meer erkend dat cerebrovasculaire afwijkingen een centrale rol spelen bij neurodegeneratie, wat bijdraagt aan een verhoogde gevoeligheid voor ischemische en hemorragische gebeurtenissen. Meer dan 90% van de AD-patiënten heeft bijvoorbeeld cerebrale amyloïde angiopathie (CAA), een aandoening die wordt gekenmerkt door de afzetting van amyloïde β (Aβ) langs het cerebrale vaatstelsel. CAA verhoogt de BBB-permeabiliteit en vermindert de BBB-functie, waardoor het CZS kwetsbaar wordt voor ischemie, hemorragische gebeurtenissen en versnelde cognitieve achteruitgang33.

We hebben onlangs een in vitro model van de menselijke BBB ontwikkeld, afgeleid van door de patiënt geïnduceerde pluripotente stamcellen, dat EC's, PC's en astrocyten bevat die zijn ingekapseld in een 3D-matrix (Figuur 1A). De iBBB recapituleert fysiologisch relevante interacties, waaronder vasculaire buisvorming en lokalisatie van astrocyt-eindvoeten met vasculatuur24. We pasten de iBBB toe om de gevoeligheid van CAA gemedieerd door APOE4 te modelleren (Figuur 1B). Dit stelde ons in staat om de causale cellulaire en moleculaire mechanismen te identificeren waarmee APOE4 CAA bevordert, en deze inzichten te gebruiken om therapeutische strategieën te ontwikkelen die CAA-pathologie verminderen en het leren en geheugen in vivo verbeteren in APOE4-muizen24. Hier bieden we een gedetailleerd protocol en video-tutorial voor het reconstrueren van de BBB uit menselijke iPSC's en het modelleren van CAA in vitro.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Differentiëren van iPSC's in iBBB-cellen

OPMERKING: Deze differentiatieprotocollen zijn eerder beschreven in Mesentier-Louro et al.34.

  1. Coaten van celkweekplaten
    1. Ontdooi de membraanmatrix met gereduceerde groeifactor (GF) 's nachts bij 4 °C. Verdun 500 μL basale membraanmatrix in 49,5 ml DMEM. Houd deze oplossing koud om voortijdige polymerisatie van de coatingoplossing te voorkomen.
    2. Voeg 1-2 ml per putje toe van een met 6-wells weefselkweek behandelde plaat. Laat de coatingoplossing minimaal 20 minuten bij 37 °C intrekken voordat u deze vervangt door het juiste verwarmde kweekmedium.
  2. Differentiatie van menselijke iPSC's in ETV2-induceerbare endotheelcellen
    timing: 8 dagen
    OPMERKING: Dit protocol is overgenomen van Blanchard et al.24 en Qian et al.35. We gebruiken de doxycycline-induceerbare expressie van de transcriptiefactor ETV2, zoals beschreven door Wang et al.36 om de opbrengst te verbeteren. ETV2 werd geïntroduceerd via PiggyBac-plasmide en de cellen werden vervolgens getransfecteerd.
    1. Kweek iPSC's op gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix-gecoate platen in feedervrij pluripotent stamcelmedium totdat de cellen ~70% confluentie bereiken.
      OPMERKING: We raden aan om de induceerbare iPSC's te handhaven met selectie voor het PiggyBac-plasmide (d.w.z. puromycine)
    2. Dag 0: Dissocieer de cellen met een protease-collagenasemengsel gedurende 5 minuten. Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis met een verhouding van 1:3 van het protease-collagenasemengsel tot stamcelmedium. Draai de cellen af bij 300 × g gedurende 3 min. Resuspendeer de celpellet met stamcelmedium en plaat de cellen bij 20.800 cellen/cm2 op gereduceerde GF-basaalmembraanmatrixgecoate platen in stamcelmedium aangevuld met 10 μM Y27632.
    3. Dag 1: Vervang het medium door DeSR1 [DMEM/F12 + glutamine supplement, 1x Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA), 1% penicilline-streptomycine (P/S)], aangevuld met 10 ng/ml BMP4, 6 μM CHIR99021 en 5 μg/ml doxycycline.
    4. Dag 3: Vervang het medium door DeSR2 [DMEM/F12 + glutamine supplement, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] aangevuld met 5 μg/ml doxycycline.
    5. Dag 5: Vervang het medium door hECSR [Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] aangevuld met 50 ng/ml VEGF-A, 2 μM forskoline en 5 μg/ml doxycycline.
    6. Dag 7: Vervang het medium door hECSR aangevuld met 50 ng/ml VEGF-A, 2 μM forskoline en 5 μg/ml doxycycline.
    7. Dag 8: Splits EC's 1:3 met een protease-collagenasemengsel en zaai opnieuw uit op verse gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix-gecoate platen in hECSR aangevuld met 50 ng/ml VEGF-A en 5 μg/ml doxycycline.
      OPMERKING: Dit is het beste tijdstip om EC's in iBBB's in te kapselen voor uniforme vasculatuurvorming.
    8. Dag 10+: Voed de cellen elke 2-3 dagen met hECSR aangevuld met 50 ng/ml VEGF-A en 5 μg/ml doxycycline. Ga door met het splitsen van de cellen 1:3 met een protease-collagenasemengsel wanneer de platen samenvloeien.
      OPMERKING: iPSC-afgeleide EC's kunnen vanaf dag 8 op elk moment worden ingevroren. Til de cellen op, alsof ze doorgang vinden. Resuspendeer de pellet in EC-vriesmedium [60% knock-out serum replacement (KSR), 30% hECSR, 10% DMSO, 50 ng/ml VEGF-A en 10 μM Y27632], splits de cellen 1:3 en vries in met een vriescontainer bij -80 °C. Ontdooien op gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix-gecoate platen in hECSR aangevuld met 50 ng/ml VEGF-A, 5 μg/ml doxycycline.
    9. Bevestig microvasculaire endotheelceldifferentiatie in de hersenen door immunocytochemie met behulp van antilichamen tegen CD31/PECAM1 of VE-cadherine (Figuur 2A).
  3. Differentiatie van menselijke iPSC's in pericyten
    timing: 6 dagen
    OPMERKING: Dit protocol is overgenomen van Patsch et al.36.
    1. Kweek iPSC's op gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix-gecoate platen in feedervrije omstandigheden in stamcelmedium totdat de cellen ~70% confluentie bereiken.
    2. Dag 0: Dissocieer de cellen met een protease-collagenasemengsel gedurende 5 minuten. Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis met een verhouding van 1:3 van het protease-collagenasemengsel tot stamcelmedium. Draai de cellen af bij 300 × g gedurende 3 min. Resuspendeer de celpellet met stamcelmedium en plaat de cellen bij 37.000-40.000 cellen/cm2 (afhankelijk van de cellijn) op gereduceerde GF-basaalmembraanmatrixgecoate platen in stamcelmedium aangevuld met 10 μM Y27632.
    3. Dag 1: Vervang de media door N2B27 [50% DMEM/F12 + glutamine supplement, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, glutamine supplement, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P/S] aangevuld met 25 ng/ml BMP4 en 8 uM CHIR99021.
    4. Dagen 3-4: Vervang de media door N2B27 aangevuld met 2 ng/ml Activine A en 10 ng/ml PDGF-BB en voer dagelijks.
    5. Dag 5: Splits PC's met een protease-collagenasemengsel en zaad op 0,1% gelatine-gecoate platen bij 35.000 cellen/cm2 in N2B27 aangevuld met 10 ng/ml PDGF-BB.
      OPMERKING: Splits cellen alleen als ze eenmaal samenvloeiend zijn. Sommige lijnen kunnen nog een paar dagen nodig hebben voordat ze klaar zijn om te splitsen; Blijf de media dagelijks verversen totdat de cellen samenvloeien.
    6. Breid pc's uit in N2B27 aangevuld met 10 ng/ml PDGF-BB, waarbij u elke 2-3 dagen van media wisselt. Verwijder PDGF-BB uit de media nadat de cellen opnieuw samenvloeiing hebben bereikt en een tweede passage hebben ondergaan.
      OPMERKING: Perocyten zijn klaar om te worden gebruikt in iBBB's na de tweede passage. Eenmaal uitgevouwen, kunnen pc's worden bevroren. Til de cellen op alsof ze moeten passeren, suspendeer de celpellet in vriesmedia [90% KSR en 10% DMSO] en vries in met een vriescontainer bij -80 °C. Ontdooien op 0,1% met gelatine beklede platen bij 35.000 cellen/cm2 in N2B27.
    7. Bevestig perocytendifferentiatie door immunocytochemie met behulp van antilichamen tegen PDGFRB en NG2 (Figuur 2B).
  4. Differentiatie van menselijke iPSC's in neurale voorlopercellen (NPC's) en astrocyten
    timing: 45 dagen totaal (15 dagen voor NPC's gevolgd door 30 dagen voor astrocyten)
    OPMERKING: Het NPC-differentiatieprotocol is aangepast van Chambers et al.38, en de astrocytendifferentiatie is zoals beschreven in TCW et al.39.
    1. Kweek iPSC's op gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix-gecoate platen in feedervrije omstandigheden in stamcelmedium totdat de cellen ~70% confluentie bereiken.
    2. Dissocieer de cellen met een protease-collagenasemengsel gedurende 5 minuten. Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis met een verhouding van 1:3 van het protease-collagenasemengsel tot stamcelmedium. Draai de cellen af bij 300 × g gedurende 3 min. Resuspendeer de celpellet met stamcelmedium en plaat de cellen bij 100.000 cellen/cm2 op gereduceerde GF-basaalmembraanmatrixgecoate platen in stamcelmedium aangevuld met 10 μM Y27632.
    3. Vervang het stamcelmedium de volgende dag. Blijf de cellen om de dag voeden totdat ze >95% confluentie bereiken (3-4 dagen, afhankelijk van de cellijn).
    4. NPC Dag 0: Vervang de media door N2B27 [50% DMEM/F12 + glutaminesupplement, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, glutaminesupplement, 1x N-2, 1X-B-27, 1% P/S] aangevuld met 10 μM SB43152 en 100 nM LDN193189.
    5. NPC Dagen 1-9: Voed de cellen dagelijks met N2B27 aangevuld met 10 μM SB43152 en 100 nM LDN193189.
    6. NPC Dag 10: Splits NPC's 1:3 met het protease-collagenasemengsel en zaad op verse gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix-gecoate platen in N2B27 aangevuld met 20 ng/ml FGF-base en 10 μM Y27632.
    7. NPC Dagen 11 - 13: Voer NPC's dagelijks met N2B27 aangevuld met 20 ng/ml FGF-basis.
    8. NPC Dag 14: Splits NPC's 1:3 met het protease-collagenasemengsel en zaai opnieuw in op verse gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix-gecoate platen in N2B27 aangevuld met 20 ng/ml FGF-base en 10 μM Y27632.
    9. NPC Dag 15/Astrocyt Dag 0: Dit is dag 0 van de astrocytendifferentiatie. Voed de cellen met volledig Astrocyte medium (AM).
      OPMERKING: NPC's kunnen worden gehandhaafd in N2B27 aangevuld met 20 ng/ml FGF-basisch en gepasseerd wanneer ze samenvloeien. Om NPC's in te vriezen, resuspendeert u de celpellet in vriesmedia [90% KSR en 10% DMSO], splitst u de cellen 1:3 en vriest u in met een vriescontainer bij -80 °C. Ontdooien op gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix-gecoate platen in N2B27 aangevuld met 20 ng/ml bFGF en 10 μM Y27632.
    10. Astrocyten Dagen 1-30: Voed de cellen elke 2-3 dagen met AM. Wanneer cellen >90% confluent zijn, passage met behulp van het protease-collagenasemengsel en plaat bij 15.000 cellen/cm2 op verse gereduceerde GF-basaalmembraan matrix-gecoate platen in AM.
      OPMERKING: Astrocyten moeten binnen 30 dagen volledig worden gedifferentieerd. Astrocyten kunnen worden ingevroren in vriesmedia [90% KSR en 10% DMSO] in een vriescontainer bij -80 °C. Ontdooien op gereduceerde GF-basaalmembraan matrix-gecoate platen in AM bij 25.000-35.000 cellen/cm2.
    11. Bevestig NPC-differentiatie door immunocytochemie met behulp van antilichamen tegen Nestin en SOX2. Bevestig astrocytendifferentiatie door immunocytochemie met behulp van antilichamen tegen S100B en CD44 (Figuur 2C).

2. Montage van de iBBB

  1. Ontdooi de basaalmembraanmatrix met verlaagde groeifactor (GF) 's nachts bij 4 °C. Verdun deze matrix niet in DMEM, aangezien de iBBB's zijn ingekapseld in een 100% gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix. Elke iBBB heeft 50 μL van de matrix nodig.
  2. Dissocieer de gedifferentieerde EC's met een protease-collagenasemengsel bij 37 °C gedurende 5 min. Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis met een verhouding van 1:3 van het protease-collagenasemengsel tot hECSR (Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). Centrifugeer de cellen op 300 × g gedurende 3 min. Resuspendeer de celpellet in hECSR.
    NOTITIE: Gebruik een conische buis, 15 ml of 50 ml, die groot genoeg is voor het volume van gedissocieerde cellen plus media. Cellen kunnen ook worden verdeeld over meerdere buisjes en vervolgens opnieuw worden gecombineerd bij hersuspensie.
  3. Dissocieer de gedifferentieerde PC's met het protease-collagenasemengsel bij 37 °C gedurende 5 min. Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis met een verhouding van 1:3 van het protease-collagenasemengsel tot N2B27 (50% DMEM/F12 + glutaminesupplement, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x glutaminesupplement, 1x N-2, 1x B-27, 1% penicilline-streptomycine [P/S]). Draai de cellen af bij 300 × g gedurende 3 min. Resuspendeer de celpellet in N2B27.
  4. Dissocieer de gedifferentieerde astrocyten met het protease-collagenasemengsel bij 37 °C gedurende 5 min. Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis met een verhouding van 1:3 van het protease-collagenasemengsel om Astrocyte Medium (AM) te voltooien. Draai de cellen af bij 300 × g gedurende 3 min. Resuspendeer de celpellet in AM.
  5. Tel met behulp van een hemocytometer elk celtype. Verdun elk type celsuspensie tot een eindconcentratie van 1 × 106 cellen/ml in het daarvoor bestemde medium.
  6. Combineer het berekende aantal cellen voor elk celtype in een conische buis: 50 μL iBBB vereist 2,5 × 105 EC's, 5 × 104 PC's en 5 × 104 astrocyten. Neem 10% meer dan het berekende aantal cellen op om rekening te houden met pipetteerfouten. Draai het celmengsel gedurende 3 minuten rond op 300 × g .
    OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om enkele overgebleven cellen van elk celtype in 2D-monoculturen te plaatsen om te fixeren en te kleuren voor kwaliteitscontrole van de invoercellen. Plaat elk celtype bij 35.000 cellen/cm2 op eerder voorbereide platen bedekt met gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix en fixeer na 3-4 dagen. Zie tabel 1 voor celtype-specifieke antilichamen.
  7. Zuig het medium uit de celpellet op en laat ongeveer 50 μl van het supernatans boven de celpellet achter. Gebruik een P200 om de celpellet voorzichtig in het restmedium te suspenderen om een eencellige suspensie te creëren.
  8. Meng de celslurry in voldoende gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix aangevuld met 10 ng/ml VEGF-A voor het gewenste aantal iBBB's bij 50 μL gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix per iBBB, waarbij u ervoor zorgt dat de cellen homogeen worden gemengd zonder luchtbellen te introduceren.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de cellen en de gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix in dit stadium op ijs te houden om voortijdige polymerisatie te voorkomen.
  9. Pipetteer 50 μl gereduceerd GF-basaalmembraanmatrixmengsel in het putje van een 48-wells kweekschaal met glazen bodem. Verdeel het volume gelijkmatig over de bodem van de schaal (Figuur 1C).
  10. Incubeer de iBBB's bij 37 °C gedurende 30-40 minuten om de gereduceerde GF-basaalmembraanmatrix te laten polymeriseren, waardoor de cellen in de matrix worden ingekapseld.
  11. Voeg 500 μL AM toe aangevuld met 10 ng/ml VEGF-A, 5 μg/ml doxycycline en 10 μM Y27632.
  12. Vervang het medium de volgende dag door AM aangevuld met 10 ng/ml VEGF-A. Blijf het medium elke 2-3 dagen vervangen. Stop na 2 weken met suppletie met VEGF-A; iBBB's zijn na 2 weken klaar voor downstream-tests.

3. Inducerende cerebrale amyloïde angiopathie (CAA) met Aβ-fibrillen

  1. Bereid stockoplossingen van amyloïde-β1-40 en amyloïde-β1-42 bij 200 μM in PBS.
  2. Voeg Aβ toe aan iBBB-medium op iBBB's van 2 weken tot een eindconcentratie van 20 nM. Incubeer de cellen gedurende 96 uur (4 dagen) in een met Aβ aangevuld medium.
  3. Verwijder na 96 uur het medium en ga verder met fixeren (hoofdstuk 4).

4. Bevestigen en beitsen van de iBBB

  1. Om de iBBB te fixeren, verwijdert u het medium, wast u in 1 ml PBS en incubeert u het gedurende een nacht bij 4 °C in 500 μl 4% paraformaldehyde.
  2. Verwijder de 4% paraformaldehyde-oplossing en spoel gedurende 4 x (minstens) 15 minuten in 1 ml PBS.
  3. Permeabiliseer de monsters in 0,3% PBST (PBS met 0,3% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.
  4. Incubeer de culturen in een blokkeerbuffer (5% Normal Serum in 0,3% PBST) bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur met zacht schudden.
    OPMERKING: Het type serum dat wordt gebruikt, is afhankelijk van de gastheersoort voor de gebruikte secundaire antilichamen. Als de gastheersoort voor de secundaire antilichamen bijvoorbeeld geit is, gebruik dan normaal geitenserum; Als de gastheersoort ezel is, gebruik dan normaal ezelserum. Dit kan ook 's nachts bij 4 °C met zacht schudden.
  5. Verdun primaire antilichamen tot de aanbevolen of bepaalde concentratie in de blokkeerbuffer.
  6. Vervang de blokkerende oplossing door de primaire antilichaamverdunning. Zorg ervoor dat de iBBB's volledig zijn ondergedompeld in een antilichaamoplossing voor een gelijkmatige incubatie; 100-150 μL is voldoende om een iBBB van 50 μL te bedekken in een 48-wells kweekschaal met glazen bodem. Incubeer een nacht bij 4 °C met zacht schudden.
  7. Verwijder het primaire antilichaam. Was iBBB's 3 x 10-20 min in 0,3% PBS.
  8. Verdun het secundaire antilichaam tot de aanbevolen of bepaalde concentratie in de blokkeerbuffer. Voeg bovendien een nucleaire kleuring, zoals Hoechst, toe aan de secundaire antilichaamoplossing in de aanbevolen of vastgestelde concentratie.
  9. Vervang de laatste PBS-wasbeurt door de secundaire antilichaamverdunning. Zorg ervoor dat de iBBB's volledig zijn ondergedompeld in een antilichaamoplossing voor een gelijkmatige incubatie; 100-150 μL is voldoende om een iBBB van 50 μL te bedekken in een 48-wells kweekschaal met glazen bodem. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.
    OPMERKING: Dit kan ook 's nachts bij 4 °C met zacht schudden.
  10. Was iBBB's 4-5x gedurende minimaal 1 uur per wasbeurt in PBS. Bewaren in PBS of anti-fading montagemedia bij 4 °C totdat de monsters zijn afgebeeld.
  11. Om een beeld te krijgen op een omgekeerde microscoop, bewaart u iBBB's in platen of schalen met glazen bodem. Plaats een glazen dekglaasje over de glasbak om de iBBB's op hun plaats te houden (Figuur 1D).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een correct gevormde iBBB stolt tot een enkele doorschijnende schijf (Figuur 3A). Het is normaal dat de iBBB na een paar dagen loskomt van het oppervlak waarop hij voor het eerst werd gepipetteerd. Dit kan niet worden vermeden, maar is geen groot probleem voor de juiste vorming van de iBBB als er bij het wisselen van media op wordt gelet dat de iBBB niet per ongeluk wordt opgezogen. Na 24 uur kunnen onder een helderveldmicroscoop afzonderlijke cellen worden geïdentificee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

BBB-disfunctie is een comorbiditeit en mogelijk een oorzaak of verergerende factor bij tal van neurologische aandoeningen 7,40,41. Het is echter bijna onmogelijk om de moleculaire en celbiologie te bestuderen die ten grondslag ligt aan de disfunctie en afbraak van de BBB bij mensen met neurovasculaire aandoeningen. De inducible-BBB (iBBB) die in dit protocol wordt gepresenteerd, biedt een in vitro systeem dat belangrijk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation en Brain Injury Association of America. CG wordt ondersteund door NIH F31NS130909. Figuur 1A is gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6e10 amyloid-β antibodyBiolegendSIG-39320Gebruikt bij 1:1000
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Activine APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secundaire antilichamenInvitrogenVerschillendGebruikt bij 1:1000
Amyloid-beta 40 fibrilAnaSpecAS-24235
Amyloid-beta 42 fibrilAnaSpecAS-20276
Aquaporin-4 antilichaamInvitrogenPA5-53234Gebruikt bij 1:300
Astrocyte basale media en supplementenScienCell1801
B-27 serum-vrij supplementGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 met GlutaMAX-mediumGibco10565018
DoxycyclineMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G glijmiddel voor platenVWR100502-406
ForskolinR&D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-gekwalificeerd gereduceerd groeifactor-basement GibcoA1413302
Glass Bottom 48-well Cultuur SchotelsMattek CorporationP48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplementGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
Human Endotheel Serum-vrij mediumGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Minimum Essential Medium Niet-essentiële Aminozuuroplossing (MEM-NEAA) Gibco11140050
N-2 supplementGibco17502048
Neurobasal mediumGibco21103049
Normaal EzelsserumMillipore-SigmaS30-100mLGebruik serum om overeen te komen met secundair antilichaam gastheer
Paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (Trombocyt-afgeleid groeifactorreceptor beta) antilichaamR&D SystemsAF385Gebruikt bij 1:500
Fosfaat Buffered Saline (PBS), pH 7,4Gibco10010031
Pecam1 (Trombocyt en endotheelcel adhesie molecuul 1) antilichaamR&D SystemsAF806Gebruikt bij 1:500
Penicilline-StreptomycineGibco15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene Catalogus #168805
S100B antilichaamSigma-AldrichS2532-100uLGebruikt bij 1:500
SB43152Reprocell04-0010
Thioflavine TChem Impex22870Gebruikt bij 25uM
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antilichaamR&D systemsAF938Gebruikt bij 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R&D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Verdunning = 1:500

Referenties

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19(2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803(2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452(2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857(2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370(2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023(2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606(2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26(2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525(2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

In vitro modelpluripotente stamcellenendotheelcellenastrocyt differentiatiepericyt differentiatieamylo dpathologiecerebrovasculaire ziektendrugscreeningneurodegeneratie
Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.