Methodenartikel

Intrapulmonale tracheale transplantatie bij muizen: een model voor het onderzoeken van obliteratieve luchtwegaandoeningen na longtransplantatie

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65953

⸱

10 november 2023

 ,  ,  , 
1Latner Thoracic Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Het muizen intrapulmonale tracheale transplantatie (IPTT) model is waardevol voor het bestuderen van obliteratieve luchtwegaandoeningen (OAD) na longtransplantatie. Het biedt inzicht in longspecifiek immunologisch en angiogeen gedrag bij luchtwegvernietiging na allotransplantatie met een hoge reproduceerbaarheid. Hier beschrijven we de IPTT-procedure en de verwachte resultaten.

Samenvatting

Intrapulmonale tracheale transplantatie bij muizen (IPTT) wordt gebruikt als model voor obliteratieve luchtwegaandoeningen (OAD) na longtransplantatie. Aanvankelijk gerapporteerd door ons team, is dit model gebruikt in de studie van OAD vanwege de hoge technische reproduceerbaarheid en geschiktheid voor het onderzoeken van immunologisch gedrag en therapeutische interventies.

In het IPTT-model wordt een tracheaal transplantaat van knaagdieren rechtstreeks via het borstvlies in de long van de ontvanger ingebracht. Dit model onderscheidt zich van het heterotope tracheale transplantatie (HTT)-model, waarbij transplantaten worden getransplanteerd in subcutane of omentale plaatsen, en van het orthotope tracheale transplantatiemodel (OTT) waarbij de donorluchtpijp de luchtpijp van de ontvanger vervangt.

Succesvolle implementatie van het IPTT-model vereist geavanceerde anesthesie- en chirurgische vaardigheden. Anesthesievaardigheden omvatten endotracheale intubatie van de ontvanger, het instellen van de juiste beademingsparameters en op de juiste manier getimede extubatie na herstel van anesthesie. Chirurgische vaardigheden zijn essentieel voor een nauwkeurige plaatsing van het transplantaat in de long en voor een effectieve afdichting van het viscerale borstvlies om luchtlekkage en bloedingen te voorkomen. Over het algemeen duurt het leerproces ongeveer 2 maanden.

In tegenstelling tot de HTT- en OTT-modellen, ontwikkelt in het IPTT-model de allotransplantaat-luchtweg luchtwegvernietiging in de relevante longmicro-omgeving. Dit stelt onderzoekers in staat om longspecifieke immunologische en angiogene processen te bestuderen die betrokken zijn bij het wegvagen van de luchtwegen na longtransplantatie. Bovendien is dit model ook uniek omdat het tertiaire lymfoïde organen (TLO's) vertoont, die ook worden gezien in menselijke longtransplantaten. TLO's bestaan uit T- en B-celpopulaties en worden gekenmerkt door de aanwezigheid van hoge endotheliale venulen die de rekrutering van immuuncellen sturen; Daarom spelen ze waarschijnlijk een cruciale rol bij de acceptatie en afwijzing van transplantaten. We concluderen dat het IPTT-model een nuttig hulpmiddel is voor het bestuderen van intrapulmonale immuun- en profibrotische routes die betrokken zijn bij de ontwikkeling van luchtwegvernietiging in het longtransplantatietransplantaat.

Inleiding

Longtransplantatie is vastgesteld als een effectieve behandeling voor patiënten met aandoeningen van de luchtwegen in het eindstadium. Het mediane overlevingspercentage voor ontvangers van een menselijke longtransplantatie is echter slechts ongeveer 6 jaar, waarbij de ontwikkeling van obliteratieve bronchiolitis (OB), een type obstructieve luchtwegaandoening (OAD), een belangrijke doodsoorzaak is na het eerste jaar na transplantatie1.

Er zijn verschillende diermodellen gebruikt om het mechanisme dat ten grondslag ligt aan OAD te onderzoeken. Een voorbeeld van zo'n model is het heterotope tracheale transplantatie (HTT) model2. In dit model worden tracheale transplantaten geïmplanteerd in het onderhuidse weefsel of omentum van de ontvanger. Ischemie-geïnduceerd verlies van tracheale transplantaatepitheelcellen treedt op, gevolgd door alloreactieve lymfocytinfiltratie en apoptose van donorepitheelcellen. Fibroblasten en myofibroblasten migreren rond de luchtpijp en produceren een extracellulaire matrix. Ten slotte treedt volledige fibreuze vernietiging van het luchtweglumen op. Het HTT-model is technisch eenvoudig, biedt een in vivo omgeving en biedt een hoge reproduceerbaarheid.

Een ander model voor het bestuderen van OAD is het orthotope tracheale transplantatie (OTT)-model bij ratten, waarbij tracheale transplantaten in de luchtpijp van de ontvanger worden geplaatst om fysiologische ventilatie te behouden3. In dit model resulteert ischemie-geïnduceerde uitputting van donorepitheelcellen in hun vervanging door ontvangende epitheelcellen in de luchtpijp, waardoor een onbelemmerde luchtweg wordt gevormd die gepaard gaat met matige fibrose. Hoewel deze modellen hebben bijgedragen aan het begrip van luchtwegvernietiging na longtransplantatie, hebben ze beperkingen in termen van recapitulatie van de longparenchymale micro-omgeving.

Onze onderzoeksgroep introduceerde het intrapulmonale tracheale transplantatiemodel (IPTT) bij ratten, waarbij tracheale transplantaten worden geïmplanteerd in de ontvangende long4 (Figuur 1). Het IPTT-model vertoont fibreuze vernietiging van het luchtweglumen dat optreedt in de micro-omgeving van de longen. Bovendien is het met succes toegepast op muizen die technisch uitdagender zijn dan rat IPTT 5,6,7,8,9,10. Deze aanpassing van het IPTT-model bij muizen stelde ons in staat om dieper in te gaan op de ingewikkelde details van de longimmunologische omgeving van OAD na longtransplantatie met behulp van transgene muizen.

Het IPTT-model beschikt over een aantal unieke kenmerken. Een daarvan is neoangiogenese, die wordt vergemakkelijkt door de longcirculatie en een cruciale rol speelt bij het uitwissen van de luchtwegen 4,10. Bovendien vertoont het IPTT-model lymfoïde aggregaten, waarvan sommige hoge endotheliale venulen hebben die perifere knoopadressering tot expressie brengen, wat aangeeft dat het tertiaire lymfoïde organen (TLO's) zijn7,8. TLO's lijken op lymfeklieren en bestaan uit T-cellen, B-cellen en vaak een kiemcentrum vergezeld van folliculaire dendritische cellen11,12. TLO's zijn gemeld bij verschillende chronische ontstekingsziekten, waaronder luchtwegvernietiging, waardoor het IPTT-model geschikt is voor het onderzoeken van de rol van TLO's bij luchtwegvernietiging 7,8,11,12,13. Dit artikel presenteert de methodologie van het IPTT-model bij muizen, met als doel onderzoekers vertrouwd te maken met dit model en verder onderzoek naar luchtwegvernietiging na longtransplantatie te vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen die zijn uiteengezet door de Canadian Council on Animal Care in de Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Animal Care Committee van het Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network.

1. Donoroperatie

OPMERKING: BALB/c-muizen worden gebruikt als voorbeeld van donoren voor het experiment. Alle procedures moeten worden uitgevoerd met behulp van een steriele techniek.

  1. Noteer voorafgaand aan de procedure het gewicht van elke muis.
  2. Euthanaseer de muis met behulp van een CO2 -kamer.
  3. Zodra de dood is bevestigd, plaatst u de muis in rugligging en zet u de ledematen vast met tape.
  4. Bereid het operatiegebied voor door het te steriliseren met 70% isopropylalcohol.
    NOTITIE: Knip indien nodig en zoals aanbevolen door de plaatselijke ethische commissie voor dieren de vacht van de incisieplaats.
  5. Maak een incisie in de middellijn op de huid, beginnend bij het midden van de buik en zich uitstrekkend tot het voorste cervicale gebied.
  6. Toegang tot de luchtpijp door de vetkussentjes voorzichtig in te trekken, de bandspieren zijdelings te bewegen en de luchtpijp te scheiden van het omliggende bindweefsel. Gebruik een tang om ruimte te creëren tussen de luchtpijp en de slokdarm.
  7. Til de xiphoid op en snijd het diafragma door.
  8. Til het borstbeen op en zorg voor een vrij pad van het borstbeen naar het nekgebied door een hemostaat in te brengen. Klem de ribbenkast aan beide kanten vast en snijd door het borstbeen, waarbij je je uitstrekt door de nekspieren.
  9. Verwijder de thymus en al het vet of de spier die de luchtpijp blokkeert om de tracheale vertakking bloot te leggen.
  10. Snijd beide hoofdbronchiën door en scheid voorzichtig de luchtweg van de slokdarm.
  11. Snijd het strottenhoofd door en verwijder het.
  12. Spuit de ontlede luchtpijp in met een steriele zoutoplossing of conserveringsoplossing met een steriel gaas gedrenkt in steriele zoutoplossing of conserveringsoplossing en plaats deze op ijs om de levensvatbaarheid te behouden.

2. Operatie aan de ontvanger

OPMERKING: C57BL/6-muizen worden gebruikt als voorbeeld van ontvangers voor het experiment.

  1. Dien buprenorfine met verlengde afgifte subcutaan toe in een dosis van 1 mg/kg op de ochtend van de operatiedag.
  2. Induceer anesthesie in een inductiekamer met 5% isofluraan.
  3. Zodra de muis licht verdoofd is, injecteert u intraperitoneaal een cocktail bestaande uit (0,1 mg/g) xylazine en (0,01 mg/g) ketamine.
  4. Breng de muis terug naar de inductiekamer met behoud van 2-3% isofluraan.
  5. Scheer de vacht op de plaats van de operatie. Dien bupivacaïne ook subcutaan toe als lijnblok langs de geplande insicionplaats in een dosis van 7 mg/kg.
  6. Bevestig de afwezigheid van reflexrespons op een teenknijp vóór orotracheale intubatie. Intubeer de muis orotracheaal met behulp van een 20 G intraveneuze katheter en sluit deze aan op een beademingsapparaat met een ademvolume van 500 μL, een ademhalingsfrequentie van 120 slagen per minuut, 100% zuurstof en 2% isofluraan. Gebruik een standaard met een klem op de tong en houd het dier in een verticale positie met de nek gestrekt, om deze procedure te vergemakkelijken.
  7. Activeer een verwarmingskussen en plaats de muis in een zijwaartse positie op de bovenkant van het kussen, met het hoofd weg van de chirurg en de staart naar de chirurg gericht (Figuur 2). Zet de ledematen vast met tape. Breng veterinaire zalf op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
  8. Schrob het operatiegebied met 7,5% povidonjodium, steriliseer met 70% isopropylalcohol en scrub opnieuw met 10% povidonjodium. Breng steriele operatielakens aan om het operatiegebied te bedekken.
  9. Laad de donorluchtpijp gedurende deze tijd in een intraveneuze katheter van 16 G (Figuur 3C,D).
  10. Gebruik een scalpel om een incisie in de huid van de ontvanger te maken en de spier en het bindweefsel dicht te schroeien.
  11. Open de vijfde of zesde tussenribruimte en houd de ribbenkast open met behulp van twee oprolmechanismen.
  12. Ontleed het inferieure longligament met wattenstaafjes en een schaar.
  13. Simuleer het ontstaan van de route voor de donorluchtpijp (Figuur 3G,H).
  14. Zet de uitstroombuis van het beademingsapparaat vast door deze gedeeltelijk af te sluiten met een driewegkraan om het opblazen van de linkerlong te vergemakkelijken.
  15. Creëer een pad door de linkerlong te doorboren met een naald van 20 G. Zorg ervoor dat de punctiediepte ongeveer gelijk is aan de lengte van het tracheale allotransplantaat. Selecteer de prikplaats aan de rand van de long (zoals aangegeven in figuur 3I) en zorg ervoor dat het pad evenwijdig loopt aan het tafelblad (zoals gemarkeerd door een blauwe cirkel in figuur 3J).
    OPMERKING: Een opwaartse insteekhoek zal resulteren in penetratie van de pleuralaag, terwijl een diepere hoek kan leiden tot bloedingen uit grote bloedvaten (zoals aangegeven door rode kruisen in figuur 3J).
  16. Breng de intraveneuze katheter van 16 G in de linkerlong in en extrudeer de donorluchtpijp in de linkerlong. Laat na het inbrengen van het tracheale allotransplantaat de driewegkraan los om een onbelemmerde uitademingsstroom door de uitstroombuis mogelijk te maken.
  17. Sluit de pleurale injectieplaats af met een clip (Figuur 3K,L). Plaats de clip precies op de prikplaats, met de rand uitgelijnd om overeen te komen met de contouren van de rand van de long (aangegeven door de blauwe cirkel in figuur 3L).
    NOTITIE: Een onjuiste locatie voor de scheerplaats kan leiden tot ineffectieve afdichting en luchtlekkage, terwijl onvoldoende clipdiepte ertoe kan leiden dat de clip na de operatie losraakt (zoals weergegeven door de rode kruisen in afbeelding 3L).
  18. Vul de borstholte met een zoutoplossing en absorbeer de zoutoplossing met een gaasje.
  19. Blaas de linkerlong weer op en sluit de ribben met behulp van een lopende hechttechniek.
  20. Sluit de spier en huid met onderbroken hechtingen.
  21. Dien meloxicam analgeticum subcutaan toe in een dosis van 5 mg/kg aan het einde van de operatie.
  22. Observeer de ontvangende muis totdat deze wakker is. Verwijder vervolgens de tracheale tube en plaats de ontvangende muis in een kooi.
    OPMERKING: Ontvangende muizen moeten individueel worden gehuisvest.
  23. Dien meloxicam (5 mg/kg) eenmaal daags toe via subcutane injectie, vanaf 24 uur na de operatie en ga door tot 3 dagen na de operatie.

3. Verzameling van monsters van ontvangende muizen

  1. Induceer anesthesie in een inductiekamer met 5% isofluraan.
  2. Bevestig de afwezigheid van reflexrespons op de teenknijp vóór orotracheale intubatie. De intubatiemethode en de instelling van het beademingsapparaat zijn hetzelfde als bij een operatie aan de ontvanger.
  3. Plaats de muis in rugligging en zet de ledematen vast.
  4. Bereid het operatiegebied voor door het te steriliseren met 70% isopropylalcohol.
  5. Maak een incisie in de middellijn op de huid, beginnend bij het midden van de buik en zich uitstrekkend tot het voorste cervicale gebied.
  6. Verbloeden van de muis via de inferieure vena cava met behulp van een spuit van 1 ml die is aangesloten op een naald van 25 G, wat resulteert in euthanasie.
  7. Open de borstkas en krijg toegang tot de luchtpijp op dezelfde manier als een donormuis. Bind de luchtpijp rond de intuberende buis met 7-0 zijde.
  8. Verwijder de thymus, het vet en de spieren om het hart bloot te leggen.
  9. Snijd het linker atrium, het rechter atrium en de inferieure vena cava. Doordrenk de longen met 3 ml steriele zoutoplossing via de rechterventrikel.
  10. Voor histologische analyse blaast u de longen op met 10% formaline via een intubatiebuis.
  11. Extubie de ventilatiebuis en bind de luchtpijp af met 7-0 zijde.
  12. Verdeel het strottenhoofd en de slokdarm. Trek ze in een inferieure richting en haal vervolgens het hart- en longblok eruit en plaats het in 10% formaline.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Op basis van onze ervaring vereist vaardigheid in dit model doorgaans ongeveer 2 maanden training. Zodra de vaardigheid is bereikt, duren de donorprocedures doorgaans 15 minuten, terwijl de ontvangerprocedures ongeveer 30 minuten duren. Het verwachte sterftecijfer voor een getrainde operator is 0%.

In figuur 4A vertoont een tracheaal allotransplantaat volledige obstructie met fibroblastisch weefsel en zijn de epitheelcellen zichtbaar vernietigd. Omgekeerd blijft i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De IPTT-procedure voor muizen omvat kritieke stappen. Wat anesthesie betreft, is de eerste cruciale stap endotracheale intubatie. Het is essentieel om de muis op een geschikte hoogte te houden met zijn poten op tafel om de stembanden te visualiseren en onmiddellijke intubatie te vergemakkelijken. Bovendien is een zorgvuldige aanpassing van het ademhalingsvolume en de positieve eind-expiratoire druk (PEEP) noodzakelijk. Doorgaans zijn een ademhalingsvolume van 500 μL en een PEEP van 2 cmH2O voldoende voor muize...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs van dit manuscript hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Jerome Valero bedanken voor het redigeren van dit manuscript. Figuur 1 en Figuur 3I,J,L zijn gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BALB/cJThe Jackson Laboratory8-10 weken 25-30 gMannetje, Donor
BD 1 mL SyringeBecton Dickinson309659
BD PrecisionGlide Naald Aiguile BD
PrecisionGlide		Becton Dickinson305122
Bovie Change-A-Tip Deluxe High-TempertureBovieDEL1
C57BL/6JThe Jackson Laboratory8-10 weken 25-30 gMannetje, Ontvanger
Dumont #5/45 ForcepsF·S·T11251-35
Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers-EthiconLX107
Extra Fine Graefe ForcepsF·S·T11150-10
Glover Bulldog ClampIntegra320-127
Halsted-Mosquito HemostatsF·S·T13009-12
Horizon Titanium Ligating ClipsTeleflex001201
Leica M651 Manuele chirurgische microscoop voor microchirurgische proceduresLeica
Magnetix Fixator met veervergrendelingCD+ LABSACD-001
Microchirurgische schaarJarit277-051
Muis en perinatale rat ventilator Model 687Harvard55-0001
Perfadex PlusXVIVO19850
Retractor Tip Blunt - 2,5 mmCD+ LABSACD-011
kleine dieren tafelCD+ LABSACD-003
Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, DubbelgewapendCovidienVP702X
Systane zalfAlconn1444062
System ElastomerCD+ LABSACD-007
Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 inchTerumo Medical CorporationSR-OX2025CA
VMT tafel Topbenson91803300

Referenties

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-fifth adult lung and heart-lung transplant report-2018; Focus theme: Multiorgan Transplantation. J Heart Lung Transplant. 37 (10), 1169-1183 (2018).
  2. Hertz, M. I., Jessurun, J., King, M. B., Savik, S. K., Murray, J. J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American J Pathol. 142 (6), 1945-1951 (1993).
  3. Ikonen, T. S., Brazelton, T. R., Berry, G. J., Shorthouse, R. S., Morris, R. E. Epithelial re-growth is associated with inhibition of obliterative airway disease in orthotopic tracheal allografts in non-immunosuppressed rats. Transplantation. 70 (6), 857(2000).
  4. Dutly, A. E., et al. A novel model for post-transplant obliterative airway disease reveals angiogenesis from the pulmonary circulation. Am J Transplant. 5 (2), 248-254 (2005).
  5. Wagnetz, D., et al. Rejection of tracheal allograft by intrapulmonary lymphoid neogenesis in the absence of secondary lymphoid organs. Transplantation. 93 (12), 1212-1220 (2012).
  6. Hirayama, S., et al. Local long-term expression of lentivirally delivered IL-10 in the lung attenuates obliteration of intrapulmonary allograft airways. Hum Gene Ther. 22 (11), 1453-1460 (2011).
  7. Watanabe, T., et al. Recipient bone marrow-derived IL-17 receptor A-positive cells drive allograft fibrosis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Transpl Immunol. 69, 101467(2021).
  8. Matsuda, Y., et al. Spleen tyrosine kinase modulates fibrous airway obliteration and associated lymphoid neogenesis after transplantation. Am J Transplant. 16 (1), 342-352 (2016).
  9. Suzuki, Y., et al. Effect of CTLA4-Ig on Obliterative bronchiolitis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Ann Thorac Cardiovasc Surg. 27 (6), 355-365 (2021).
  10. Watanabe, T., et al. A potent anti-angiogenic factor, vasohibin-1, ameliorates experimental bronchiolitis obliterans. Transplant Proc. 44 (4), 1155-1157 (2012).
  11. Aloisi, F., Pujol-Borrell, R. Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 6 (3), 205-217 (2006).
  12. Cupedo, T., Jansen, W., Kraal, G., Mebius, R. E. Induction of secondary and tertiary lymphoid structures in the skin. Immunity. 21 (5), 655-667 (2004).
  13. Sato, M., et al. The role of intrapulmonary de novo lymphoid tissue in obliterative bronchiolitis after lung transplantation. J Immunol. 182 (11), 7307-7316 (2009).
  14. Okazaki, M., et al. Maintenance of airway epithelium in acutely rejection orthotopic vascularized mouse lung transplants. A J Resp Cell Mol Biol. 37 (6), 625-630 (2007).
  15. Yamada, Y., et al. Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-an experimental reappraisal. Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).
  16. Watanabe, T., et al. A B cell-dependent pathway drives chronic lung allograft rejection after ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Transplant. 19 (12), 3377-3389 (2019).
  17. Guo, Y., et al. Vendor-specific microbiome controls both acute and chronic murine lung allograft rejection by altering CD4+Foxp3+ regulatory T cell levels. Am J Transplant. 19 (10), 2705-2718 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tracheale allograftluchtwegobliteratiechronische longallografttertiaire lymfo de organenimmunologische gedragingenfibreuze obliteratiemuis transplantatiemodel

Gerelateerde artikelen