Monitoring van fijn en associatief motorisch leren bij muizen met behulp van de Erasmusladder

Samenvatting

Dit artikel presenteert een protocol dat een niet-invasieve en geautomatiseerde beoordeling van fijne motorische prestaties mogelijk maakt, evenals adaptief en associatief motorisch leren bij uitdagingen, met behulp van een apparaat genaamd de Erasmusladder. De moeilijkheidsgraad van de taak kan worden getitreerd om motorische stoornissen te detecteren, variërend van grote tot subtiele gradaties.

Samenvatting

Gedrag wordt gevormd door acties, en acties vereisen motorische vaardigheden zoals kracht, coördinatie en leren. Geen van de gedragingen die essentieel zijn voor het in stand houden van het leven zou mogelijk zijn zonder het vermogen om van de ene positie naar de andere over te gaan. Helaas kunnen motorische vaardigheden worden aangetast bij een breed scala aan ziekten. Daarom is het onderzoeken van de mechanismen van motorische functies op cellulair, moleculair en circuitniveau, evenals het begrijpen van de symptomen, oorzaken en progressie van motorische stoornissen, cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve behandelingen. Hiervoor worden vaak muismodellen gebruikt.

Dit artikel beschrijft een protocol dat het mogelijk maakt om verschillende aspecten van motorische prestaties en leren bij muizen te monitoren met behulp van een geautomatiseerd hulpmiddel genaamd de Erasmusladder. De test omvat twee fasen: een eerste fase waarin muizen worden getraind om te navigeren op een horizontale ladder die is opgebouwd uit onregelmatige sporten ("fijne motoriek"), en een tweede fase waarin een obstakel wordt gepresenteerd op het pad van het bewegende dier. De verstoring kan onverwacht zijn ('uitgedaagd motorisch leren') of worden voorafgegaan door een auditieve toon ('associatief motorisch leren'). De taak is eenvoudig uit te voeren en wordt volledig ondersteund door geautomatiseerde software.

Dit rapport laat zien hoe verschillende uitlezingen van de test, wanneer geanalyseerd met gevoelige statistische methoden, een nauwkeurige monitoring van de motoriek van muizen mogelijk maken met behulp van een klein cohort muizen. We stellen voor dat de methode zeer gevoelig zal zijn voor het evalueren van motorische aanpassingen die worden aangedreven door veranderingen in de omgeving, evenals subtiele motorische tekorten in een vroeg stadium bij gemuteerde muizen met gecompromitteerde motorische functies.

Inleiding

Er zijn verschillende tests ontwikkeld om motorische fenotypes bij muizen te beoordelen. Elke test geeft informatie over een specifiek aspect van motorisch gedrag¹. De open veldtest informeert bijvoorbeeld over de algemene motoriek en angsttoestand; de rotarod- en loopbalktests op coördinatie en evenwicht; Voetafdrukanalyse gaat over lopen; de loopband of het loopwiel bij gedwongen of vrijwillige lichaamsbeweging; En het complexe wiel gaat over het leren van motorische vaardigheden. Om motorische fenotypes van muizen te analyseren, moeten onderzoekers deze tests opeenvolgend uitvoeren, wat veel tijd en moeite kost en vaak meerdere diercohorten. Als er informatie is op cellulair of circuitniveau, kiest de onderzoeker normaal gesproken voor een test die een gerelateerd aspect bewaakt en van daaruit volgt. Het ontbreekt echter aan paradigma's die verschillende aspecten van motorisch gedrag op een geautomatiseerde manier onderscheiden.

Dit artikel beschrijft een protocol voor het gebruik van de Erasmus Ladder ^2,3, een systeem dat een uitgebreide beoordeling van een verscheidenheid aan motorische leerkenmerken bij muizen mogelijk maakt. De belangrijkste voordelen zijn de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van de methode, samen met het vermogen om motorische moeilijkheden te titreren en om tekorten in motorische prestaties te scheiden van verminderd associatief motorisch leren. Het hoofdonderdeel bestaat uit een horizontale ladder met afwisselend hoge (H) en lage (L) sporten uitgerust met aanraakgevoelige sensoren die de positie van de muis op de ladder detecteren. De ladder is gemaakt van 2 x 37 sporten (L, 6 mm; H, 12 mm) op een onderlinge afstand van 15 mm en in een afwisselend patroon van links naar rechts met tussenruimten van 30 mm (figuur 1A). Sporten kunnen afzonderlijk worden verplaatst om verschillende moeilijkheidsgraden te genereren, dat wil zeggen een obstakel creëren (de hoge sporten met 18 mm verhogen). In combinatie met een geautomatiseerd registratiesysteem en het associëren van modificaties van het sportpatroon met sensorische stimuli, test de Erasmus-ladder voor fijn motorisch leren en aanpassing van motorische prestaties als reactie op omgevingsuitdagingen (verschijnen van een hogere sport om een obstakel te simuleren, een ongeconditioneerde stimulus [VS]) of associatie met sensorische stimuli (een toon, een geconditioneerde stimulus [CS]). Het testen omvat twee verschillende fasen, die elk de verbetering van de motorische prestaties gedurende 4 dagen beoordelen, waarin muizen een sessie van 42 opeenvolgende proeven per dag ondergaan. In de beginfase worden muizen getraind om door de ladder te navigeren om "fijn" of "bekwaam" motorisch leren te beoordelen. De tweede fase bestaat uit interleaved proeven waarbij een obstakel in de vorm van een hogere sport wordt gepresenteerd in het pad van het bewegende dier. De verstoring kan onverwacht zijn om "uitgedaagd" motorisch leren te beoordelen (alleen in de VS onderzocht) of aangekondigd door een auditieve toon om "associatief" motorisch leren te beoordelen (gepaarde onderzoeken).

De Erasmusladder is relatief recent ontwikkeld ^2,3. Het is niet op grote schaal gebruikt omdat het opzetten en optimaliseren van het protocol gerichte inspanning vergde en specifiek was ontworpen om cerebellair-afhankelijk associatief leren te beoordelen zonder in detail het potentieel ervan te onderzoeken om andere motorische stoornissen aan het licht te brengen. Tot op heden is het gevalideerd voor zijn vermogen om subtiele motorische stoornissen te onthullen die verband houden met cerebellaire disfunctie bij muizen 3,4,5,6,7,8. Bijvoorbeeld, connexine36 (Cx36) knock-out muizen, waar gap junctions zijn aangetast in olivaire neuronen, vertonen vuurtekorten als gevolg van een gebrek aan elektrotonische koppeling, maar het motorfenotype was moeilijk te lokaliseren. Testen met behulp van de Erasmus-ladder suggereerden dat de rol van inferieure olivaire neuronen in een cerebellaire motorische leertaak is om nauwkeurige temporele codering van stimuli te coderen en leerafhankelijke reacties op onverwachte gebeurtenissen te vergemakkelijken ^3,4. Fragile X Messenger Ribonucleoproteïne 1 (Fmr1) knock-out muis, een model voor Fragile-X-Syndrome (FXS), vertoont een bekende cognitieve stoornis samen met mildere defecten in procedurele geheugenvorming. Fmr1-knock-outs vertoonden geen significante verschillen in staptijden, misstappen per proef of verbetering van de motorische prestaties tijdens sessies in de Erasmus-ladder, maar slaagden er niet in hun looppatroon aan te passen aan het plotseling verschijnende obstakel in vergelijking met hun wild-type (WT) nestgenoten, wat specifieke procedurele en associatieve geheugentekorten bevestigt ^3,5. Bovendien vertoonden celspecifieke mutante muizenlijnen met defecten in de cerebellaire functie, waaronder verminderde output van Purkinje-cellen, potentiëring en interneuron- of korrelceloutput van de moleculaire laag, problemen in de motorische coördinatie met veranderde verwerving van efficiënte stappatronen en in het aantal stappen dat werd gezet om de ladder over te steken⁶. Neonataal hersenletsel veroorzaakt cerebellaire leerachterstanden en Purkinje-celdisfunctie die ook met de Erasmusladder ^7,8 konden worden opgespoord.

In deze video presenteren we een uitgebreide stap-voor-stap handleiding, waarin de inrichting van de gedragskamer, het gedragstestprotocol en de daaropvolgende gegevensanalyse worden beschreven. Dit rapport is opgesteld om toegankelijk en gebruiksvriendelijk te zijn en is speciaal ontworpen om nieuwkomers te helpen. Dit protocol geeft inzicht in verschillende fases van motorische training en verwachte motorische patronen die muizen aannemen. Ten slotte stelt het artikel een systematische workflow voor data-analyse voor met behulp van een krachtige niet-lineaire regressiebenadering, compleet met waardevolle aanbevelingen en suggesties voor het aanpassen en toepassen van het protocol in andere onderzoekscontexten.

Protocol

In de huidige studie werden volwassen (2-3 maanden oude) C57BL/6J-muizen van beide geslachten gebruikt. De dieren werden twee tot vijf per kooi gehuisvest met ad libitum toegang tot voedsel en water in een dierunit onder observatie en gehouden in een temperatuurgecontroleerde omgeving op een donker/licht-cyclus van 12 uur. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese en Spaanse regelgeving (2010/63/UE; RD 53/2013) en werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Generalitat Valenciana en de commissie voor dierenwelzijn van de Universidad Miguel Hernández.

1. Gedragsmatige kameropstelling

1. Reserveer de gedragstestruimte elke dag op hetzelfde tijdstip en stel de lijst en volgorde van de te gebruiken muizen vast, evenals regelingen voor hun hosting.
2. Houd de experimentele muizen buiten de testruimte, zodat ze de geluiden van de luchtcompressor en de Erasmus Ladder-tonen niet horen wanneer ze niet worden getest.
3. Controleer of alle onderdelen van het Erasmus Ladder-systeem in orde en klaar voor gebruik zijn: de netwerkrouter, de computer met de software (zie Materiaaltabel), de luchtcompressor, twee doelkasten en de ladder met de sporten goed geplaatst.
4. Reinig de doelkasten, ladder en sporten uitgebreid met water na elk dier en met water en 70% ethanol aan het einde van elke trainingsdag.

2. Gedragstestprotocol

1. Maak een experiment en voer het protocol in de software in (aanvullende afbeelding S1).
   1. Zet de software aan.
   2. Als u een experiment wilt maken, kiest u Bestand | Nieuw experiment | Nieuw of ingesteld | Experiment protocol.
      OPMERKING: Het standaardprotocol dat in dit onderzoek wordt gebruikt, heet EMC en is ontworpen in het Erasmus Universitair Medisch Centrum, Rotterdam.
   3. Geef het experiment een naam en klik op OK.
   4. Controleer of het standaard geselecteerde EMC-protocol bestaat uit 4 dagen ongestoorde sessies (42 ongestoorde proeven per dag) en 4 dagen uitdagingssessies (42 dagelijkse gemengde proeven: ongestoord, alleen CS (toon), alleen VS (obstakel), Gekoppeld (obstakel aangekondigd door toon) (zie afbeelding 1B). Controleer in het rechterzijpaneel ook de lichtcue (maximale duur van 3 s), de luchtcue (maximale duur van 45 s) en de wind in de rug (Ja in alle soorten proeven), die worden gebruikt om de muis aan te moedigen de ladder over te steken, en de toon (250 ms, Ja alleen in CS-only en Paired-proeven).
   5. Als u een ander protocol wilt maken, kiest u Instellen | Experimenteerprotocol | Nieuw | Helemaal opnieuw of kopieer van het EMC-protocol en wijzig het eenvoudig, bewerk de tabelregels met betrekking tot het aantal sessies (experimenteerdagen) en het aantal en type proeven per dag.
      OPMERKING: Rusttijd, type cues en activering, duur, intensiteit en interval kunnen ook worden aangepast aan de experimentele vragen.
   6. Als u de sessielijst wilt openen en de onderwerpen een naam wilt geven, kiest u Instellen | Sessie lijst.
   7. Klik op Onderwerpen en variabelen toevoegen.
   8. Voer elke specifieke muisidentificatie, geboortedatum, geslacht, genotype en relevante categorieën in, volgens de geordende lijst met muizen.
2. Start de sessie (aanvullende figuur S2).
   1. Controleer voordat u begint of de software is geopend en schakel vervolgens de ladder in.
   2. Controleer of de luchtcompressor is aangesloten en ingeschakeld.
   3. Als u het venster Acquisitie wilt openen, opent u het gemaakte experiment.
   4. Kies Acquisitie | Open Acquisitie.
   5. Plaats de muis met de door de software aangegeven identifier in het startdoelvak (rechterkant van de ladder).
   6. Selecteer de muis-id die u in de eerste sessie wilt verkrijgen.
   7. Klik op Start Acquisitie.
   8. Druk 3x op de rode laddermenuknop . Controleer of de sessie wordt gestart en muisbewegingen automatisch worden bestuurd en geregistreerd tot het einde van de laatste proefversie van de sessie.
3. Beëindig de sessie.
   1. Controleer of aan het einde van de 42e^{proef de} berichten Gegevens verzenden en Verkregen op het display worden weergegeven.
   2. Plaats de muis terug in de thuiskooi.
   3. Reinig de ladder en de doeldozen.
   4. Plaats de volgende muis en herhaal vanaf stap 2.2.6.
4. Voer het geselecteerde type sessie elke dag uit tot het einde van het protocol. Herhaal stap 2.2 en 2.3 elke dag volgens het gekozen protocol.
5. Exporteer de gegevens (aanvullende afbeelding S2).
   1. Als u de opgenomen gegevens wilt visualiseren, kiest u uit het menu Analyse , Proefstatistieken, Sessiestatistieken en Groepsstatistieken en -grafieken.
      OPMERKING: Gegevens kunnen worden gedownload als een spreadsheet met gegevens voor individuele onderzoeken en de middelen van dezelfde soorten onderzoeken binnen een sessie. Sessies kunnen ook worden gefilterd op variabelen die zijn gekozen voor specifieke analyse.
   2. Klik op de knop Exporteren in de rechterbovenhoek en kies het bestandsformaat (spreadsheet) en de maplocatie.
   3. Klik met de rechtermuisknop op de automatisch gegenereerde grafieken en selecteer Opslaan in bestand als *.jpg.

3. Data-analyse

OPMERKING: Een lijst met parameters wordt automatisch gemeten door de Erasmus Ladder op basis van de onmiddellijke registratie van de activiteiten van de aanraakgevoelige sensoren. Voor analyse worden de door de gebruiker geselecteerde uitvoerparameters georganiseerd en verwerkt in de spreadsheets. Samen met de door software gegenereerde grafieken kunnen gebruikers grafieken genereren met behulp van de grafische software naar keuze om specifieke veranderingen in verschillende parameters tijdens sessies te visualiseren.

1. Kies specifieke parameters om basale motivatie of angsttoestanden, sensorische reacties, motorische prestaties en fijne motoriek gedurende de eerste 4 dagen te analyseren.
   1. Selecteer en plot controleparameters, waaronder de rusttijd in het doelvak en de tijd om het doelvak te verlaten na de rustperiode als reactie op licht- en luchtsignalen (Figuur 2A).
      OPMERKING: Rusttijden of reactie op signalen zijn relatief constant bij WT-muizen. Andere parameters, zoals de frequentie van uitgangen, zijn in principe te verwaarlozen bij WT-muizen - de dieren verlaten zelden de rustbox zonder de signalen of komen één keer terug in de ladder, wat resulteert in uitgangsfrequenties die gelijk zijn aan 1 per proef. Als een dier naar buiten gaat voordat er aanwijzingen worden gegeven, wordt een luchtstroom geactiveerd die de muis dwingt terug te keren naar het doelgebied; Dit wordt door de software niet als een proefversie beschouwd.
   2. Selecteer en plot de tijd op de ladder na aanwijzingen, gemeten als de tijd die wordt besteed aan het oversteken van de ladder zodra de muis het doelvak verlaat (Figuur 2B).
      OPMERKING: Een niet-lineaire vermogensregressie is een robuuste methode voor het evalueren van leren. De Pearson- of Spearman-coëfficiënten (R) geven een maatstaf voor de vraag of de gegevensaanpassing goed is (R-waarden dicht bij één wanneer de dieren leren/verbeteren tijdens sessies; R-waarden in de buurt van 0 impliceren dat de gegevens constant zijn en dat muizen niet leren).
   3. Selecteer en plot parameters voor stappatronen , zoals het percentage proeven met misstappen , als een gevoelige leerparameter (Figuur 2C).
      1. Definieer een juiste trede als een trede van een hoge trede naar een andere hoge trede (H-H), ongeacht de lengte van de trede. Beschouw staptypen met een lagere sport als misstappen.
      2. Verdeel de juiste stappen en misstappen in korte en lange stappen, achterwaartse stappen en sprongen, afhankelijk van de lengte en richting van de stap tussen de ingedrukte sporten (zie figuur 1A).
2. Selecteer en plot specifieke parameters om uitgedaagd motorisch leren (alleen in de VS onderzoeken) en associatief leren (gepaarde onderzoeken) in de afgelopen 4 dagen te evalueren.
   1. Selecteer en plot de tijd op de ladder na aanwijzingen (Figuur 3).
   2. Selecteer en plot het percentage proeven met misstappen (Figuur 4A).
   3. Selecteer en plot de staptijden voor en na de verstoring, gedefinieerd als een ms-precisieverschil tussen de activering van de sport net voor (controlestap) en na het obstakel (aangepaste trede) aan dezelfde kant van de ladder (figuur 4B).
      OPMERKING: Er moet een analyse van de staptijden voor en na de verstoring worden uitgevoerd om de gegevens binnen elk type sessie te vergelijken. De parameter meet het vermogen van de muizen om de obstakels tijdens associatief leren te voorspellen en te overwinnen.
3. Analyseer de gegevens met speciale statistische software (bijv. SigmaPlot). Voer een krachtige niet-lineaire regressieanalyse uit van gegevens die zijn verzameld van hetzelfde proeftype in verschillende sessies om het leerproces efficiënter te beschrijven en gebruik Two-Way Repeated Measures (RM) ANOVA om verschillende soorten onderzoeken te vergelijken.

Resultaten

Het toegepaste apparaat van de Erasmus Ladder, de opstelling en het toegepaste protocol worden weergegeven in figuur 1. Het protocol bestaat uit vier ongestoorde en vier challenge-sessies (elk 42 proeven). Elke proef is één run op de ladder tussen het start- en einddoelvak. Aan het begin van de sessie wordt een muis in een van de startvakken geplaatst. Na een ingestelde tijd van 15 ± 5 s ("rusttoestand") wordt het licht ingeschakeld (cue 1, voor maximaal 3 s). Een lichte luchtcue (cue 2, max...

Discussie

De Erasmusladder biedt grote voordelen voor de beoordeling van motorische fenotypes die verder gaan dan de huidige benaderingen. Testen is eenvoudig uit te voeren, geautomatiseerd, reproduceerbaar en stelt onderzoekers in staat om verschillende aspecten van motorisch gedrag afzonderlijk te beoordelen met behulp van een enkel muiscohort. In de huidige studie maakte reproduceerbaarheid het mogelijk om robuuste gegevens te genereren met een klein aantal WT-muizen die gebruik maakten van de kenmerken van het apparaat, het ex...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C57BL/6J muizen (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder apparaat	Noldus, Wageningen, Nederland
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Nederland
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.