Methodenartikel

Het meten van veranderingen in de integriteit van de endotheliale barrière van de hersenen met twee op impedantie gebaseerde biosensoren als reactie op kankercellen en cytokines

DOI:

10.3791/65959

⸱

22 september 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 2Centre for Brain Research, University of Auckland, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier demonstreren we de techniek van het gebruik van op impedantie gebaseerde biosensoren: ECIS en cellZscope, voor het meten van de sterkte van de endotheliale barrière van de hersenen. We beschrijven de voorbereiding en techniek van het toevoegen van verschillende stimuli aan een in vitro model van het hersenendotheel. We meten, registreren en geven een representatieve analyse van de bevindingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bloed-hersenbarrière (BBB) beschermt het hersenparenchym tegen schadelijke ziekteverwekkers in het bloed. De BBB bestaat uit de neurovasculaire eenheid, bestaande uit pericyten, astrocytaire voetprocessen en nauw aanhangende endotheelcellen. Hier vormen de endotheelcellen van de hersenen de eerste barrièrelijn tegen door bloed overgedragen ziekteverwekkers. Bij aandoeningen zoals kanker en neuro-inflammatie kunnen circulerende factoren in het bloed deze barrière verstoren. Ziekteprogressie verergert aanzienlijk na verstoring van de barrière, wat toegang tot of verslechtering van hersengebieden mogelijk maakt. Dit verslechtert de prognoses aanzienlijk, vooral vanwege de beperkte behandelingsopties die beschikbaar zijn op het niveau van de hersenen. Daarom zijn opkomende studies gericht op het onderzoeken van mogelijke therapieën die kunnen voorkomen dat deze schadelijke factoren in het bloed interageren met de endotheelcellen van de hersenen.

De in de handel verkrijgbare instrumenten voor elektrische celsubstraatimpedantiedetectie (ECIS) en cellZscope meten de impedantie over cellulaire monolagen, zoals het BBB-endotheel, om hun barrièresterkte te bepalen. Hier beschrijven we het gebruik van beide biosensoren bij het beoordelen van de integriteit van de endotheelbarrière van de hersenen bij de toevoeging van verschillende stimuli. Cruciaal is dat we het belang benadrukken van hun high-throughput-capaciteit voor gelijktijdig onderzoek van meerdere variabelen en biologische behandelingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel bespreekt de huidige trends in de beoordeling van microvasculaire cellen. We beschrijven specifiek het gebruik van twee in de handel verkrijgbare platforms voor het meten van de barrière-eigenschappen van cerebrale microvasculaire endotheelcellen. Endotheelcellen zijn naar bloed gerichte cellen, die de vaatwand bekleden. Cerebrale microvaten zijn echter uniek omdat ze helpen bij het vormen van de beschermende bloed-hersenbarrière (BBB)1,2,3. De BBB functioneert om het transport van moleculen van het bloed naar de hersenen te reguleren. Perifere ziekten die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantasten, worden vaak in verband gebracht met een functioneel falen van de BBB 4,5. De anatomische structuren die de BBB vormen, zijn niet aanwezig op de bloed-weefselinterface elders in het lichaam6. Deze anatomische structuren bestaan uit pericyten, die zich dicht bij de endotheelcellen van de hersenen bevinden, en reguleren hun proliferatie en permeabiliteit; astrocytische voetprocessen, die betrokken zijn bij het schudden van voedingsstoffen en anatomische ondersteuning 7,8; Microglia, de inwonende macrofagen in de hersenen, vaak betrokken bij neuro-inflammatie en ischemie 9,10,11,12, en het hersenendotheel, dat een monolaag vormt van strak aangehechte cellen zonder vensters 13,14. Het hersenendotheel staat doorgaans bekend als de 'endotheliale barrière van de hersenen' en vormt op vijf verschillende manieren een structurele en functionele barrière. Ten eerste wordt de paracellulaire barrièrecomponent gevormd door adhesie bij laterale cel-celovergangen. Ten tweede wordt de transcellulaire barrièrecomponent in stand gehouden door endocytose te reguleren. Ten derde verankert en ondersteunt een gespecialiseerd basaalmembraan het endotheel via een rijke extracellulaire matrix die grotendeels uit collageen bestaat15,16. De laatste twee mechanismen zijn via enzymen en transporters die helpen bij het reguleren van respectievelijk het metabolisme van geneesmiddelen en de opname van grote moleculen17.

De paracellulaire interacties vormen het belangrijkste onderdeel van de endotheelbarrière van de hersenen, gefaciliteerd door tight junctions (TJ's), bestaande uit membraaneiwitten claudines, occludine en junctionele adhesiemoleculen (JAM's)18. Sterke homotypische binding van de membraaneiwitten vormt de eerste structurele barrière, hoewel JAM's ook koppelen aan accessoire-eiwitten zonula occludens, waardoor de TJ's worden gekoppeld aan het actine-cytoskelet19,20. De actineverbindingen plaatsen de TJ's in het apicale gebied van het endotheel21, dat de endotheelcellen functioneel polariseert om de structurele barrière aan deze apicale of "bloedgerichte" kant te vormen. In het basolaterale gebied van het endotheel spelen zeer gespecialiseerde adherens junctions (AJ's) een regulerende rol bij het handhaven van de celmorfologie. AJ's omvatten calciumafhankelijke cadherines, die het cytoskelet van naburige endotheelcellen verbinden via het catenine-familiecomplex20,22. Vasculaire endotheliale cadherine (VE-Cadherin) is zo'n cadherine, die de expressie van TJ-eiwitten en de algehele endotheliale barrièrefunctie reguleert om de integriteit van de endotheliale monolaag te behouden 23,24,25,26,27. Inflammatoire modulatoren, zoals tumornecrosefactor-alfa (TNFα), signaleren VE-cadherine-internalisatie weg van celovergangen, wat leidt tot destabilisatie van de endotheelbarrière 28,29,30. Bloedplaatjes endotheelcel adhesiemolecuul (PECAM)31 is een ander AJ-cadherine dat endotheelverbindingen stabiliseert en hermodelleert32,33. De dichtheid van deze junctionele eiwitten beperkt de stroom van elektronen door de paracellulaire ruimte tussen endotheelcellen. Deze eigenschap wordt gebruikt om de sterkte van de endotheliale barrière of trans-endotheliale elektrische weerstand (TER) te meten over monolagen van confluente cellen zoals het endotheel van de hersenen.

Therapeutische studies richten zich op het endotheel van de hersenen vanwege zijn vitale rol op het bloed-hersengrensvlak. Verschillende ziekten hebben een negatieve invloed op het endotheel van de hersenen, waaronder neuro-inflammatoire aandoeningen zoals multiple sclerose, beroerte, neurodegeneratieve ziekten en kanker 34,35,36,37. Zodra de endotheelbarrière van de hersenen wordt verstoord, verslechtert de ziekteprogressie aanzienlijk omdat de hersenen effectief worden blootgesteld aan de schadelijke prikkels in het bloed38. We hebben eerder aangetoond dat ontstekingsmediatoren en uitgezaaide melanoomcellen de endotheelbarrière van de hersenen verstoren door twee technologieën te gebruiken die de sterkte van de endotheelbarrière meten: 39,40,41.

Elektrische cel-substraatimpedantiedetectie (ECIS) is een op impedantie gebaseerde biosensor die real-time en labelvrije beoordeling van de integriteit van de endotheelcelbarrière mogelijk maakt. Hierin zijn de testputten bekleed met vergulde elektroden, waardoor wisselstroom (AC) in het testsysteem wordt geïntroduceerd. In deze putjes worden endotheelcellen van de hersenen gezaaid, wat betekent dat AC via de cellen kan worden aangebracht. (Figuur 1A-put; zijaanzicht). Hiermee wordt het elektrische circuit tot stand gebracht, dat wordt gebruikt om de impedantie te berekenen (figuur 1A-schakelschema). De impedantie neemt toe wanneer de endotheelcellen van de hersenen zich aan de plaat hechten en hun paracellulaire knooppunten beginnen te vormen. De impedantie bereikt een plateau wanneer de endotheelcellen samenvloeien, een monolaag vormen en de stroomstroom beperken. Toepassing van AC op verschillende frequenties beïnvloedt de stroomroute door de endotheelcellen. Stroom vloeit door het endotheelcellichaam wanneer deze met een hogere frequentie (>104 Hz) wordt toegepast. Dit geeft informatie over de capaciteit van de monolaag van de cel, die wordt gebruikt om de aanhechting en verspreiding van cellen te beoordelen. Bij lage frequenties (102-10 4 Hz) is de membraanimpedantie hoog, waardoor de stroom door de cellen wordt beperkt. In dit geval navigeert het grootste deel van de stroom tussen de cellen. Bij ongeveer 4.000 Hz wordt de weerstand tegen de stroom voornamelijk toegeschreven aan de endotheelcel-celjuncties, via de intercellulaire ruimte. Daarom geeft elke verandering in weerstand bij deze frequentie informatie over de integriteit van de endotheliale barrière.

Terwijl ruwe impedantiemetingen inzicht kunnen geven in barrière-eigenschappen, kan de ECIS-software vervolgens de totale gemeten weerstand over meerdere AC-frequenties wiskundig modelleren en, nauwkeuriger, deze scheiden in twee belangrijke parameters van barrière-integriteit. Deze parameters zijn de paracellulaire weerstand tussen de laterale membranen van naburige cellen (resistentie bèta-Rb; paracellulaire barrière; Figuur 1A - groene pijlen), en de basolaterale weerstand tussen de basale cellaag en de elektrode (weerstand alfa-alfa; basolaterale barrière; Figuur 1A-blauwe pijlen). Een derde gemodelleerde parameter wordt ook gemeten als de celmembraancapaciteit (Cm; Figuur 1A - rode pijlen). De Cm geeft de capacitieve stroom door de cellen weer, een indicatie van de samenstelling van het celmembraan. Hierin duiden veranderingen in de Rb- of paracellulaire barrière op veranderingen in de TJ's en AJ's, cruciaal voor het behoud van de integriteit van de endotheliale barrière. Om de Rb betrouwbaar te interpreteren worden vier belangrijke aannames gemaakt, zoals uitgewerkt door Giaever en Keese42 en kritisch besproken door Stolwijk et al.43. Hoewel deze aannames belangrijk zijn om de validiteit van ECIS-modellering te waarborgen, worden ze gemakkelijk beantwoord door een confluente endotheliale monolaag.

Net als ECIS maakt de cellZscope het mogelijk om veranderingen in de weerstand van de endotheliale barrière te meten; De cellen worden echter gekweekt op een poreus membraaninzetstuk. In dit systeem bevindt het elektrische circuit zich tussen twee elektroden aan weerszijden van een membraaninzetstuk. De endotheliale monolaag wordt bovenop dit membraaninzetstuk gekweekt, waardoor de trans-endotheliale elektrische weerstand (TER) kan worden gemeten (Figuur 1B-put; zijaanzicht). Net als bij ECIS kan in dit systeem de totale impedantie worden toegeschreven aan verschillende barrièrecomponenten, afhankelijk van de frequentie van de toegepaste stroom44. Bij lage frequenties domineert de elektrodecapaciteit (CEl) de totale impedantie van het systeem. Als alternatief domineert bij hoge frequenties de weerstand van het medium (R-medium) de totale impedantie. Daarom vallen de meest bruikbare metingen binnen het middenfrequentiebereik (102-10 4 Hz), dat informatie geeft over twee belangrijke componenten van de endotheelbarrière (Figuur 1B-schakelschema). Ten eerste domineert bij 103-10 4 Hz de capaciteit van de cellaag (CCl) de totale impedantie, aangezien de membraanweerstand (R-membraan) hoog genoeg is om te worden verwaarloosd en de stroom voornamelijk over de condensator stroomt. Vandaar dat de CCl veranderingen in de weerstand door het celmembraan aangeeft. Als alternatief geeft TER voornamelijk de totale impedantie op 102-10 3 Hz, waarbij de stroom wordt gekanaliseerd door junctionele ruimtes tussen naburige cellen, bij elkaar gehouden door junctionele eiwitten. Dit geeft dus informatie over de paracellulaire component van de endotheelbarrière, zoals eerder gezien bij Rb op ECIS.

Figuur 1C laat zien hoe specifieke delen van het endotheel in de hersenen worden verstoord door behandeling met melanoomcellen. Deze verstoring wordt door de biosensoren gedetecteerd door een verandering in de stroom door de paracellulaire ruimte (gemeten als Rb of TER); de basolaterale ruimte (gemeten als Alpha); en het celmembraan (gemeten als C, m of CCl). We hebben beide biosensoren die in deze inleiding worden beschreven, gebruikt om de verandering van de endotheelbarrière van de hersenen te meten na behandeling met verschillende stimuli zoals cytokines of invasieve melanoomcellen. De gemeten weerstand neemt af als een bepaalde stimulus de endotheelbarrière verstoort, waardoor een pad van de minste weerstand ontstaat om stroom mogelijk te maken. Daarom suggereert een afname van de "barrièreweerstand" verlies van barrière-integriteit of verstoring van de endotheliale barrière van de hersenen. In deze analyses hebben we deze verstoring bestudeerd door weerstand te interpreteren en parameters in realtime te modelleren. De toepassing van ECIS en cellZscope bij het beantwoorden van dergelijke onderzoeksvragen wordt elders beschreven 39,41,45,46.

In vitro onderzoek maakt de ontdekking van cruciale ziektemechanismen mogelijk door moleculen en functionele routes te onthullen die de ziekte verergeren. Dit vereist echter een betrouwbare replicatie van de ziekte in vitro, wat aanzienlijk verschilt van een functionerend lichaam. In een ideaal scenario zou in-vitroonderzoek reproduceerbaar, niet-invasief, labelvrij, kwantitatief moeten zijn en structurele invloeden moeten nabootsen die in vivo worden aangetroffen. In dit artikel beschrijven we de methodologie voor het gebruik van deze twee concurrerende technologieën om door behandeling geïnduceerde veranderingen in de integriteit van de endotheelbarrière van de hersenen te meten. We bespreken de voordelen van het combineren van hun resultaten om een uitgebreider beeld te geven van barrièreverstoring en delen beperkingen die nog moeten worden overwonnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ECIS gebruiken om veranderingen in de integriteit van de endotheelbarrière van de hersenen te monitoren als reactie op verschillende behandelingen

  1. De software, het arraystation en de machine instellen
    1. Sluit het array-station met 96 putjes aan op de machine. Plaats het array-station in een plastic zak en plaats het ten minste 1 uur voor de test in de incubator om het op te warmen. Verwijder de plastic zak vlak voor het experiment.
    2. Als u klaar bent, zet u de machine aan en opent u de bijbehorende software op de computer. Druk op de knop Setup onder het tabblad Gegevens verzamelen . De software voert een verbindingscontrole uit, die het type adapter detecteert dat is aangesloten (bijv. een array-station met 96 putjes) en rode putjes weergeeft op de afgebeelde plaatkaart. Dit geeft aan dat de software de adapter detecteert, maar niet kan detecteren dat er een plaat is bevestigd. Het systeem is nu klaar voor de plaat met 96 putjes.
  2. Voorbereiding van de biosensorplaat met 96 putjes
    OPMERKING: De plaatopstelling met 96 putjes wordt gebruikt. De basis van elk putje is voorzien van een patroon met verstrengelde vingers van vergulde elektroden. De platen worden geleverd in steriele verpakkingen die alleen mogen worden geopend in een steriele kap/biologische veiligheidskast. De gouden elektroden moeten eerst chemisch worden gestabiliseerd door 10 mM cysteïne toe te voegen om de elektrodecapaciteit te behouden.
    1. Bereid de 10 mM cysteïne voor in een steriele trog en pipetteer met behulp van een meerkanaals voorzichtig 100 μL in elk putje. Incubeer de cysteïne gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en zuig vervolgens voorzichtig op, pipetteren alleen aan de randen van de put, om krassen op de elektrode te voorkomen. Spoel de cysteïne minstens 2x af met steriel gedeïoniseerd water (geen PBS) met dezelfde pipetteertechniek.
      OPMERKING: De plaatelektroden kunnen ook elektrisch worden gestabiliseerd met behulp van warme media op het ECIS-apparaat, in plaats van met behulp van cysteïnecoating, zoals beschreven in het protocol van de fabrikant.
    2. Bereid het ECM-substraat voor om als basaalmembraan op de bodem van de put te fungeren.
      OPMERKING: ECM-substraten zoals collageen of laminine kunnen worden gekozen, afhankelijk van de vereisten van de endotheelcellijn van de hersenen. Hier gebruiken we collageen voor een humane cerebrale microvasculaire endotheelcellijn (hCMVEC).
    3. Bereid 1 μg/cm2 rattenstaartcollageen I opgelost in 0,02 M azijnzuur in een verse, steriele trog (100 μL per putje). Laat het collageen 1 uur bij weinig licht in de steriele kap staan, was daarna 2x zorgvuldig met gedeïoniseerd water en voorzichtig pipetteren.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat zoveel mogelijk van het gedeïoniseerde water zo voorzichtig mogelijk wordt verwijderd na de laatste wasbeurt en laat de plaat in de kap drogen. Het wordt aanbevolen om de plaat snel na het coaten te gebruiken; het kan echter tijdelijk (minder dan een week) in water van 4 °C worden bewaard. De plaat is nu klaar voor gebruik.
  3. De endotheelcellen van de hersenen voorbereiden op het zaaien op de biosensorplaat met 96 putjes
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om eerst de groeifase en zaaidichtheid van de te gebruiken endotheelcellijn te optimaliseren. De hCMVEC-lijn werd gebruikt in dit protocol, dat 48 uur nodig heeft om confluentie te bereiken na het zaaien van 20.000 cellen per put in een plaat met 96 putjes.
    1. Oogst de endotheelcellen van de hersenen in een steriele kap met behulp van een zacht dissociatiereagens en voer een nauwkeurige celtelling uit. Gebruik 20.000 hCMVEC's in 100 μl media per putje voor een gestage groeifase gedurende 48 uur. Bereid overtollige endotheelcellen in de hersenen voor om een optimaal pipetteren van alle 96 putjes te garanderen.
      OPMERKING: Voor een plaat met 96 putjes zijn dus ongeveer 2.000.000 cellen in 10 ml voorverwarmde media nodig.
    2. Breng de endotheelcellen van de hersenen over naar een verse steriele trog en voeg met behulp van een meerkanaalspipet voorzichtig 100 μL (20.000 cellen) van de celsuspensie per putje toe. Resuspendeer de cellen regelmatig voorzichtig in de trog om te voorkomen dat de endotheelcellen na verloop van tijd bezinken. Zorg ervoor dat 1 put alleen media heeft en geen cellen om wiskundige modellering mogelijk te maken (celvrije put) en dat de hele plaat binnen 30 s is gezaaid.
  4. Het experiment starten
    1. Bevestig de plaat voorzichtig aan de adapter in de broedmachine door de rode clips aan weerszijden van de plaatadapter naar buiten te bewegen. Lijn het A1-putje van de plaat uit met het A1-gebied van de adapter. Houd de plaat voorzichtig op zijn plaats met één hand bovenop en klik met de andere hand de rode clips weer op hun plaats.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de plaat stabiel in de adapter zit.
    2. Sluit de couveuse en druk nogmaals op Setup . Zoek naar groene putten op de plaatkaart die correct gedetecteerde putten aangeven. Alle putten die rood zijn, hebben een verbindingsfout. Om dit op te lossen, bevestigt u de plaat snel,
      OPMERKING: Overmatige tijd die wordt besteed aan het repareren van putten met slechte verbindingen kan de gezondheid van de cel in gevaar brengen.
    3. Druk op Controleren om de bijlagen opnieuw te controleren als absolute impedantie-uitlezingen. Dit duurt enkele minuten.
    4. Druk op de pijl onder de plaatkaart om er zeker van te zijn dat de juiste plaatcatalogus is geselecteerd. In dit geval is het 96w20idf.
    5. Druk op de multifrequentieknop om ervoor te zorgen dat de impedantie wordt gemeten op meerdere AC-frequenties om toekomstige wiskundige modellering mogelijk te maken.
    6. Druk op Start om het experiment te starten. Laat de cellen ~48 uur prolifereren en hun typische monolaag met hoge weerstand vormen, gemeten aan de hand van een toename van ohm.
  5. Behandeling van de endotheelcellen van de hersenen met kankercellen of cytokinen op de plaat met 96 putjes
    OPMERKING: Aangezien de plaat met 96 putjes het gelijktijdig testen van meerdere stimuli mogelijk maakt, bereidt u een duidelijke plaatkaart voor met de gewenste behandelingsopties (Aanvullende figuur S1-bodem). Elke behandeling kan en moet worden uitgevoerd minstens in drievoud (drie dupliceerbare putjes) om statistische analyses mogelijk te maken; Er worden echter vier replicaten getoond in Aanvullende figuur S1.
    1. Controleer na 48 uur de groei van de endotheelcellen van de hersenen. Zorg ervoor dat een plateau wordt bereikt voordat u behandelingsoplossingen bereidt.
      OPMERKING: Verschillende endotheelcellijnen kunnen verschillende tijdsperioden nodig hebben om een plateau te bereiken. Daarom moeten hun groeifase en zaaidichtheid worden geoptimaliseerd voordat dit experiment wordt uitgevoerd. Putten zouden doorgaans binnen hetzelfde uur moeten plateauren. Als dit niet het geval is, kunnen ze worden gecompromitteerd of onnauwkeurig worden gepipetteerd en mogen ze niet worden opgenomen.
    2. Bereid voor behandeling met cytokinen de juiste concentraties van de cytokinen in voorverwarmde volledige media, samen met de relevante medium- en mediacontroles.
      1. Bereid de cytokinen voor in 2x de uiteindelijke gewenste concentratie, aangezien ze 1:1 worden verdund wanneer ze worden toegevoegd aan elk putje met endotheelcellen in de hersenen.
      2. Om ervoor te zorgen dat elke behandeling in drievoud kan worden uitgevoerd, bereidt u alle cytokines voor in meer dan 300 μl totaal volume (d.w.z. ten minste 350 μl totaal), voor een behandelingstoevoeging van 100 μl per putje.
    3. Voor behandeling met cellen oogst u de cellen (drie verschillende van de patiënt afgeleide melanoomcellijnen die in dit protocol worden gebruikt) met een zacht dissociatiereagens en voert u een nauwkeurige celtelling uit. Voer celgebaseerde behandelingen uit met topeffector:doelverhoudingen (E:T-verhoudingen) van 1:1, waarbij de behandelingscellen de effectorcellen zijn (bijv. melanoomcellen) en de endotheelcellen in de hersenen de doelcellen zijn, d.w.z. voeg 20.000 melanoomcellen toe aan 20.000 hersenendotheelcellen per putje.
      1. Serieel verdunnen voor kleinere E:T-verhoudingen van 1:10 of 1:100 waar nodig. Om behandeling in drievoud mogelijk te maken, telt u de cellen en bereidt u ze voor op meer dan 300 μl totaal volume (d.w.z. ten minste 350 μl totaal) voor behandelingstoevoeging van 100 μl per putje.
    4. Label 1,1 ml polypropyleen clusterbuizen, die worden geleverd in stripformaat met 8 buizen (d.w.z. stripbuizen van 1 ml), volgens de plaatkaart met 96 putjes (aanvullende afbeelding S1-Top). Plaats de stripbuizen in de stripbuisplaten en autoclaaf ze voor het experiment. Voeg het totale volume van de behandelingscytokinen of -cellen (d.w.z. de volledige 350 μL behandeling) toe aan de steriele stripbuisjes en laat ze in de incubator om warm te blijven.
    5. Druk in de software op Pauzeren om het experiment te pauzeren. Dit kan enkele seconden duren om te voltooien. Eenmaal gepauzeerd, opent u de couveuse en klikt u beide rode clips voorzichtig los met één hand terwijl u de plaat met de andere hand stabiliseert. Houd het experiment gepauzeerd en breng het bord naar de steriele kap.
    6. Verwijder de buisjes met de behandelingsstrip uit de couveuse. Gebruik een meerkanaalspipet om de inhoud van de buisjes van de behandelingsstrip voorzichtig te resuspenderen en voeg vervolgens 100 μl behandeling uit de stripbuisjes toe aan de juiste putjes op de plaat met 96 putjes zonder de bodem van het putje aan te raken. Voeg de behandeling van alle putjes en media voorzichtig alleen toe aan de celvrije put en voltooi deze stap in minder dan 5 minuten voor een volledige plaat met 96 putjes, aangezien overmatige afkoeling de weerstand van de endotheliale monolaag zal beïnvloeden.
    7. Plaats de behandelde plaat terug in de machine, bevestig deze zoals eerder gedaan en controleer vervolgens de elektrodeverbindingen op de adapter opnieuw door op Setup | Controleren.
    8. Zorg ervoor dat de juiste instellingen voor plaatcatalogus en multifrequentie-acquisitie zijn geselecteerd en druk op Hervatten om het experiment te hervatten. Laat het experiment vorderen en voer het uit tot het gewenste eindpunt.
    9. Druk op Voltooien om het experiment te voltooien, waardoor het opgenomen abp.-bestand automatisch wordt opgeslagen. Navigeer naar Bestand | Exporteer gegevens om dit bestand als een xls op te halen. Ofwel CSV. bestand voor verdere analyses.

2. CellZscope gebruiken om veranderingen in de integriteit van de endotheliale barrière van de hersenen te monitoren als reactie op verschillende behandelingen

  1. Voorbereiding van de metalen onderdelen, adapter en poreuze membraaninzet van het apparaat
    1. Reinig de metalen onderdelen achtereenvolgens met gedeïoniseerd water, vervolgens 70% ethanol en vervolgens opnieuw gedeïoniseerd water.
    2. Autoclaaf de onderste elektrode of "potten" en bovenste dompelelektroden en steriliseer alle andere componenten van de celmodule met 70% ethanol.
    3. Installeer in een steriele kap alle 24 onderste elektroden/"potten" door ze in de celmodule te schroeven en zorg ervoor dat de steriliteit overal behouden blijft.
    4. Voeg 900 μL basismedia toe aan de putjes.
      OPMERKING: Basismedia wordt toegevoegd aan de bodemput, die fungeert als het basale compartiment van het endotheel. Het wordt aanbevolen om geen serum in dit compartiment te gebruiken om de basale omgeving van het hersenendotheel betrouwbaarder na te bootsen.
    5. Sluit de dompelelektroden magnetisch aan op het deksel van de celmodule en sluit het deksel over de putjes zodat de dompelelektroden in de onderste elektrodepotjes passen.
    6. Sluit de celmodule aan op de adapter in een incubator en laat deze minimaal 1 uur in evenwicht komen. Open in dit stadium de software om de experimentele plaatkaart onder het tabblad Lay-out te laden, waardoor de behandelingsplaatkaart wordt ingesloten in de bestanden, die uiteindelijk de gegevens zullen bevatten.
    7. Waar coating vereist is, bedek dan de membraaninzetstukken in een steriele kap met behulp van een steriele kweekplaat met 24 putjes om de inzetstukken vast te houden en voeg het ECM-substraat (bijv. collageen) toe aan het binnenste gedeelte van de put, zoals beschreven in paragraaf 1.2.3 Gebruik een eenkanaalspipet om het ECM-substraat voorzichtig in elk putje te laden.
  2. De endotheelcellen van de hersenen voorbereiden op het zaaien op het membraaninzetstuk en het starten van het experiment
    1. Oogst en tel de endotheelcellen van de hersenen volgens paragraaf 1.3, maar bereid de uiteindelijke vereiste celtitratie voor in een centrifugebuisje van 50 ml. Zorg ervoor dat de geoogste cellen zich in warme, volledige media bevinden, inclusief alle vereiste groeifactoren en serum.
    2. Gebruik een eenkanaalspipet om de endotheelcellen van de hersenen (80.000 in dit protocol) voorzichtig in de apicale kamer van een putje in 350 μL volledige media te plaatsen.
    3. Voeg een celvrij putje toe door volledige media alleen in een van de inzetstukken te pipetteren.
    4. Haal de Cell Module uit de couveuse en plaats deze in de steriele kap. Breng de voorbereide inzetstukken over in de onderste elektrodepotten met behulp van een pincet om alleen de bovenste steunen van het inzetstuk vast te pakken. Voorkom dat er luchtbellen onder het membraan ontstaan.
    5. Plaats de Cell Module terug in de incubator over de adapter.
    6. Selecteer in de software op het tabblad experiment , onder het gedeelte Spectrum , Start bij 1 Hz en Stop bij 100 kHz om gegevens over het gehele frequentiebereik te verkrijgen; Selecteer Fijne stappen.
    7. Selecteer onder Wachttijd 15 minuten om continue metingen met de snelste snelheid die door de software wordt uitgevoerd, toe te staan.
    8. Druk op Start om het experiment te starten en laat de endotheelcellen van de hersenen zich vermenigvuldigen en een monolaag met hoge weerstand vormen. Deze stap duurt ongeveer 48 uur.
  3. Behandeling van de endotheelcellen van de hersenen met kankercellen en cytokinen op de membraaninzetstukken
    1. Bereid na 48 uur de cytokines of cellen van de behandeling (bijv. melanoomcellen) voor volgens paragraaf 1.5, inclusief het uitvoeren van celtellingen indien van toepassing, en verzamel ze in stripbuisjes van 1 ml of gelijkwaardig.
    2. Bereid de behandeling voor in de juiste concentraties voor het toevoegen van 70 μL aan elk putje (inzetstuk). Plaats behandelingen in de couveuse om warm te blijven.
    3. Aangezien het instrument hierin elke 15 minuten metingen uitvoert, kiest u een behandelingstijd die onmiddellijk begint nadat een meting is voltooid. Verwijder op dit moment de celmodule uit de couveuse en veeg deze voorzichtig af met 70% ethanol met pluisvrije doekjes.
    4. Open in een steriele kap de celmodule en pipetteer voorzichtig 70 μl van de behandeling in de apicale kamer van het betreffende inzetstuk. Doe dit met behulp van een enkelkanaalspipet en voeg in een cirkelvormige beweging toe, vermijd luchtbellen. Voltooi deze stap in minder dan 10 minuten om de celmodule terug te plaatsen in de adapter voordat de volgende meting begint.
    5. Druk op Stop om het experiment te beëindigen. Exporteer de gegevens rechtstreeks naar een xls. bestand onder het Bestand | Tabblad exporteren . Geef dit bestand een naam en sla het op de juiste manier op nadat u het hebt geopend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ECIS-impedantiegegevens interpreteren

Inzicht in optimale experimentele omstandigheden
Hierin kunnen de gegevens direct worden bekeken met behulp van de software (Figuur 2A) of worden geëxporteerd voor analyse en grafiekdiagrammen (Figuur 2B). Figuur 2A toont een voorbeeld van gegevens die worden weergegeven op de daadwerkelijke software-interface. De linkergra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Therapeutische studies naar ziekten die de BBB beïnvloeden, moeten rekening houden met het belang van de integriteit en regulatie van de endotheliale barrière van de hersenen. Verstoring van de endotheliale barrière van de hersenen wordt bijvoorbeeld kritisch onderzocht bij de metastase van kanker naar de hersenen vanuit andere anatomische plaatsen. Dit komt omdat het endotheel in de hersenen de eerste barrière vormt tegen circulerende tumorcellen. Zoals eerder in de inleiding vermeld, moeten in-vitro-onderzoeken

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akshata Anchan werd gefinancierd door de Neurological Foundation of New Zealand voor de Gillespie Scholarship (subsidiereferentie: 1628-GS) en First Fellowship (subsidiereferentie: 2021 FFE). De onderzoekskosten werden ook gedeeltelijk gefinancierd door de Neurological Foundation Fellowship-2021 FFE en het Faculty Research Development Fund van de Universiteit van Auckland. James Hucklesby werd gefinancierd door een beurs van de Auckland Medical Research Foundation. Met dank aan het Bagueley-team en het Auckland Cancer Society Research Centre voor de van patiënten afgeleide Nieuw-Zeelandse melanoom NZM-cellijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
aMEMGibco12561072Melanoma cell base media
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tailGibcoA1048301ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Brain endothelial media supplement
ECIS array Applied BiophysicsECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate Applied Biophysics96W20idf 96-well biosensor plate
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Brain endothelial media supplement
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Brain endothelial cell line
hEGFPeproTechPTAF10015100Brain endothelial media supplement
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain endothelial media supplement
hFGFPeproTechPTAF10018B50Brain endothelial media supplement
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Brain endothelial media supplement
IL-1βPeproTech200-01BCytokine
Insulin-Transferrin-Sodium SeleniteSigma-Aldrich11074547001Melanoma cell media supplement
M199Gibco11150-067Brain endothelial cell base media
MilliQ waterDeionized water
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACytokine
Transwell insertCorningCLS3464Porous membrane insert
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Dissociation reagent

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fidler, I. J., Schackert, G., Zhang, R. D., Radinsky, R., Fujimaki, T. The biology of melanoma brain metastasis. Cancer Metastasis Reviews. 18 (3), 387-400 (1999).
  2. Tomlinson, E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1 (2), 87-198 (1987).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Neuwelt, E., et al. Strategies to advance translational research into brain barriers. The Lancet. Neurology. 7 (1), 84-96 (2008).
  5. Stolp, H. B., Dziegielewska, K. M. Review: Role of developmental inflammation and blood-brain barrier dysfunction in neurodevelopmental and neurodegenerative diseases. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (2), 132-146 (2009).
  6. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: Beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  7. Kacem, K., Lacombe, P., Seylaz, J., Bonvento, G. Structural organization of the perivascular astrocyte endfeet and their relationship with the endothelial glucose transporter: A confocal microscopy study. Glia. 23 (1), 1-10 (1998).
  8. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  9. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the cns are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science. 239 (4837), 290-292 (1988).
  10. Smith, J. A., Das, A., Ray, S. K., Banik, N. L. Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Research Bulletin. 87 (1), 10-20 (2012).
  11. Denes, A., et al. Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (12), 1941-1953 (2007).
  12. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Celular andl Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  13. Felgenhauer, K. The blood-brain barrier redefined. Journal of Neurology. 233 (4), 193-194 (1986).
  14. Scheinberg, L. C., Edelman, F. L., Levy, W. A. Is the brain "an immunologically privileged site"?I. Studies based on intracerebral tumor homotransplantation and isotransplantation to sensitized hosts. Archives of Neurology. 11, 248-264 (1964).
  15. Carbonell, W. S., Ansorge, O., Sibson, N., Muschel, R. The vascular basement membrane as "soil" in brain metastasis. PLoS One. 4 (6), e5857(2009).
  16. Nag, S. Morphology and molecular properties of cellular components of normal cerebral vessels. Methods in Molecular Medicine. 89, 3-36 (2003).
  17. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 71 (1), 113-128 (2011).
  18. Bauer, H. C., et al. New aspects of the molecular constituents of tissue barriers. Journal of Neural Transmission (Vienna). 118 (1), 7-21 (2011).
  19. Balda, M. S., Matter, K. Tight junctions as regulators of tissue remodelling. Current Opinion in Cell Biology. 42, 94-101 (2016).
  20. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  21. Van Itallie, C. M., Tietgens, A. J., Anderson, J. M. Visualizing the dynamic coupling of claudin strands to the actin cytoskeleton through zo-1. Molecular Biology of the Cell. 28 (4), 524-534 (2017).
  22. Takeichi, M. Historical review of the discovery of cadherin, in memory of tokindo okada. Development, Growth & Differentiation. 60 (1), 3-13 (2018).
  23. Vincent, P. A., Xiao, K., Buckley, K. M., Kowalczyk, A. P. Ve-cadherin: Adhesion at arm's length. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286 (5), C987-C997 (2004).
  24. Brasch, J., et al. Structure and binding mechanism of vascular endothelial cadherin: A divergent classical cadherin. Journal of Molecular Biology. 408 (1), 57-73 (2011).
  25. Gavard, J., Patel, V., Gutkind, J. S. Angiopoietin-1 prevents vegf-induced endothelial permeability by sequestering src through mdia. Developmental Cell. 14 (1), 25-36 (2008).
  26. Romero, I. A., et al. Changes in cytoskeletal and tight junctional proteins correlate with decreased permeability induced by dexamethasone in cultured rat brain endothelial cells. Neuroscience Letters. 344 (2), 112-116 (2003).
  27. Aragon-Sanabria, V., et al. Ve-cadherin disassembly and cell contractility in the endothelium are necessary for barrier disruption induced by tumor cells. Scientific Reports. 7, 45835(2017).
  28. Angelini, D. J., et al. Tnf-alpha increases tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and opens the paracellular pathway through fyn activation in human lung endothelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (6), L1232-L1245 (2006).
  29. Nwariaku, F. E., et al. Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. Surgery. 132 (2), 180-185 (2002).
  30. Orsenigo, F., et al. Phosphorylation of ve-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. Nature Communications. 3, 1208(2012).
  31. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  32. Chen, Z., Tzima, E. Pecam-1 is necessary for flow-induced vascular remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1067-1073 (2009).
  33. Privratsky, J. R., Newman, P. J. Pecam-1: Regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  34. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: Targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 315 (3), C343-C356 (2018).
  35. Bernardo-Castro, S., et al. Pathophysiology of blood-brain barrier permeability throughout the different stages of ischemic stroke and its implication on hemorrhagic transformation and recovery. Frontiers in Neurology. 11, 594672(2020).
  36. Wilhelm, I., Molnár, J., Fazakas, C., Haskó, J., Krizbai, I. A. Role of the blood-brain barrier in the formation of brain metastases. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1383-1411 (2013).
  37. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier". Frontiers in Neuroscience. 17, 1047778(2023).
  38. Abate-Daga, D., Ramello, M. C., Smalley, I., Forsyth, P. A., Smalley, K. S. M. The biology and therapeutic management of melanoma brain metastases. Biochemistry & Pharmacology. 153, 35-45 (2018).
  39. Anchan, A., et al. Real-time measurement of melanoma cell-mediated human brain endothelial barrier disruption using electric cell-substrate impedance sensing technology. Biosensors (Basel). 9 (2), (2019).
  40. Anchan, A., et al. Analysis of melanoma secretome for factors that directly disrupt the barrier integrity of brain endothelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8193(2020).
  41. Hucklesby, J. J. W., et al. Comparison of leading biosensor technologies to detect changes in human endothelial barrier properties in response to pro-inflammatory tnfα and il1β in real-time. Biosensors (Basel). 11 (5), 159(2021).
  42. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (17), 7896(1991).
  43. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of gpcr-mediated changes in endothelial barrier function: Overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 467 (10), 2193-2218 (2015).
  44. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: Barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 5(2013).
  45. Anchan, A., Finlay, G., Angel, C. E., Hucklesby, J. J. W., Graham, S. E. Melanoma mediated disruption of brain endothelial barrier integrity is not prevented by the inhibition of matrix metalloproteinases and proteases. Biosensors (Basel). 12 (8), 660(2022).
  46. Robilliard, L. D., et al. The importance of multifrequency impedance sensing of endothelial barrier formation using ecis technology for the generation of a strong and durable paracellular barrier. Biosensors. 8 (3), 64(2018).
  47. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. The Journal of Clinical Investigation. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  48. Qi, J., Chen, N., Wang, J., Siu, C. H. Transendothelial migration of melanoma cells involves n-cadherin-mediated adhesion and activation of the beta-catenin signaling pathway. Molecular Biology of the Cell. 16 (9), 4386-4397 (2005).
  49. Brayton, J., Qing, Z., Hart, M. N., Vangilder, J. C., Fabry, Z. Influence of adhesion molecule expression by human brain microvessel endothelium on cancer cell adhesion. Journal of Neuroimmunology. 89 (1-2), 104-112 (1998).
  50. Soto, M. S., Serres, S., Anthony, D. C., Sibson, N. R. Functional role of endothelial adhesion molecules in the early stages of brain metastasis. Neuro-oncology. 16 (4), 540-551 (2014).
  51. García-Martín, A. B., et al. Vla-4 mediated adhesion of melanoma cells on the blood-brain barrier is the critical cue for melanoma cell intercalation and barrier disruption. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (10), 1995-2010 (2018).
  52. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  53. Stone, N. L., England, T. J., O'sulli, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230(2019).
  54. Abstracts from the international symposium "signal transduction at the blood-brain barriers" 2022. Fluids and Barriers of the CNS. 20 (1), 26(2023).
  55. Srinivasan, B., et al. Teer measurement techniques for in vitro barrier model systems. SLAS Technology. 20 (2), 107-126 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Blood Brain BarrierBrain Endothelial CellsImpedance Based BiosensorsBarrier IntegrityCancer Cell InteractionCytokine TreatmentElectric Cell Substrate ImpedanceCellZscope InstrumentTransendothelial Electrical ResistanceEndothelial Monolayer

Gerelateerde artikelen