Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor snelle en gelijktijdige optische clearing, multi-round labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties door de (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT weefseltransformatietechniek te combineren met light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldvorming in een routinematig high-throughput protocol.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Optische opheldering en etikettering voor lichtbladfluorescentiemicroscopie in grootschalige beeldvorming van het menselijk brein
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ondanks de talrijke ophelderingstechnieken die in het afgelopen decennium zijn ontstaan, blijft het verwerken van postmortale menselijke hersenen een uitdagende taak vanwege de afmetingen en complexiteit, die beeldvorming met micrometerresolutie bijzonder moeilijk maken. Dit artikel presenteert een protocol om de reconstructie van volumetrische delen van het menselijk brein uit te voeren door tegelijkertijd tientallen secties te verwerken met het SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) weefseltransformatieprotocol, dat clearing, labeling en sequentiële beeldvorming van de monsters mogelijk maakt met light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM). SHORT zorgt voor een snelle weefselopruiming en homogene multi-labeling van dikke plakken met verschillende neuronale markers, waardoor de identificatie van verschillende neuronale subpopulaties in zowel witte als grijze stof mogelijk wordt. Na het opruimen worden de plakjes via LSFM met micrometerresolutie en in meerdere kanalen tegelijk in beeld gebracht voor een snelle 3D-reconstructie. Door SHORT te combineren met LSFM-analyse binnen een routinematig high-throughput protocol, is het mogelijk om in korte tijd de 3D-cytoarchitectuurreconstructie van grote volumetrische gebieden met hoge resolutie te verkrijgen, waardoor een uitgebreide structurele karakterisering van het menselijk brein mogelijk wordt.
Inleiding
Het analyseren van de 3D-moleculaire organisatie en cytoarchitectuur van grote volumes van het menselijk brein vereist optische transparantie van monsters, bereikt door protocollen met een lange verwerkingstijd. Optische ophelderingstechnieken werden ontwikkeld om de heterogeniteit in brekingsindex (RI) in de weefsels te minimaliseren, waardoor lichtverstrooiing wordt verminderd en de lichtpenetratiediepte wordt vergroot voor beeldvorming met hoge resolutie 1,2,3,4,5. De huidige vooruitgang op het gebied van opruimings- en diepe weefsellabelingmethoden maakt volumetrische beeldvorming van intacte knaagdierorganen en embryo's mogelijk door gebruik te maken van geavanceerde microscopietechnieken 6,7,8,9,10,11,12.
Volumetrische 3D-reconstructie van grote delen van het postmortale menselijke brein is echter nog steeds een uitdagende taak in vergelijking met modelorganismen. De complexe biologische samenstelling en de variabele postmortale fixatie- en opslagomstandigheden kunnen de efficiëntie van het opruimen van weefsel, de penetratiediepte van antilichamen en de epitoopherkenning in gevaar brengen 13,14,15,16,17,18,19. Bovendien is het mechanisch doorsnijden van weefsel en het vervolgens wissen en labelen van elke plak nog steeds nodig om een efficiënte opruiming en uniforme etikettering van grote menselijke hersengebieden te bereiken, wat resulteert in lange verwerkingstijden en de behoefte aan geavanceerde aangepaste apparatuur, vergeleken met modelorganismen 15,20,21,22.
De SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (KORTE) weefseltransformatietechniek is speciaal ontwikkeld om grote volumes van het menselijk brein te analyseren18,23. Deze methode maakt gebruik van het weefselstructurele behoud van het SWITCH-protocol11 en hoge concentraties peroxidewaterstof om weefselautofluorescentie te verminderen, in combinatie met epitoopherstel. SHORT maakt uniforme kleuring van menselijke hersenplakjes mogelijk met markers voor verschillende neuronale subtypes, gliacellen, vasculatuur en gemyeliniseerde vezels18,24. De resultaten zijn compatibel met de analyse van eiwitten met zowel lage als hoge dichtheid. De resulterende hoge transparantieniveaus en uniforme etikettering maken volumetrische reconstructie van dikke plakjes mogelijk met fluorescentiemicroscopie, met name voor snelle acquisitie kan light-sheet-apparatuur worden gebruikt 18,24,25,26,27.
In dit werk beschrijven we hoe de SHORT-weefseltransformatietechniek kan worden gebruikt voor het gelijktijdig opruimen en labelen van tientallen met formaline gefixeerde menselijke hersensecties. Vier verschillende fluorescerende markers kunnen samen worden gebruikt, wat leidt tot de identificatie van verschillende cellulaire subpopulaties. Na het klaren kan volumetrische beeldvorming met hoge resolutie worden uitgevoerd met fluorescentiemicroscopie. Hier gebruikten we een op maat gemaakte omgekeerde LSFM 18,24,25,26,27, die een snelle optische doorsnede van het monster en een snelle verwerving van meerdere kanalen parallel mogelijk maakt. Met dit routinematig high-throughput protocol is het mogelijk om een uitgebreide cellulaire en structurele karakterisering te verkrijgen met een subcellulaire resolutie van grote delen van het menselijk brein, zoals al is aangetoond in het in kaart brengen van een volledig Broca-gebied23.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Formaline-gefixeerde menselijke weefselmonsters werden geleverd door de afdeling Neuropathologie van de Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, VS). Schriftelijke toestemming werd verkregen van gezonde deelnemers voorafgaand aan het overlijden, volgens IRB-goedgekeurde weefselafnameprotocollen van de Partners Institutional Biosafety Committee (PIBC, protocol 2003P001937). De autorisatiedocumenten worden bewaard bij de MGH Autopsy Services in Boston, MA, Verenigde Staten, en zijn op verzoek verkrijgbaar.
1. Agarose-inbedding en monstersnijden
- Bereid een agarose-oplossing van 4% g/v in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) in een bekerglas en plaats het weefselblok erin. Wacht tot het op kamertemperatuur is (RT) en bewaar vervolgens 24 uur bij 4 °C.
- Om zeer nauwkeurige secties te verkrijgen, lijmt u het monster op de trilschijf van het monster en vult u de bak met koude 1x PBS (pH 7,4). Pas de trillingsparameters zoals frequentie, amplitude en snelheid aan op basis van het type weefsel dat moet worden gesneden (gebruikte waarden: frequentie = 5 (50 Hz); amplitude = 0,4; snelheid = 3 (0,15 mm/s).
OPMERKING: Afhankelijk van het monstervolume moeten verschillende vibratomen worden gebruikt. Voor monsters met een maximaal volume van 70 x 40 x 15 mm kan een vibratoom (bijv. Leica VT1000 S) worden gebruikt; voor grotere monsters is het mogelijk om een compresstoom (bijv. VF-900-0Z Microtome18) of een op maat gemaakt apparaat21 te gebruiken. Hier presenteren we plakjes gesneden met een dikte van 400 μm of 500 μm. - Leg na het snijden alle plakjes in een conserveringsoplossing bestaande uit 1x PBS (pH 7,4) met 0,01% m/v natriumazide (NaN3) en bewaar bij 4 °C.
OPMERKING: Wacht voor het inbedden tot de agarose-oplossing 37 °C bereikt. Een hogere temperatuur kan het preparaat beschadigen. Het wordt aanbevolen om de monsters niet langer dan 48 uur in PFA te laten staan, omdat langdurige fixatie de etiketteringsprocedure kan verstoren door antigenen te beschadigen en de autofluorescentie van het weefsel te verhogen. Voor langdurige opslag van menselijke weefsels wordt PBS met NaN3 gebruikt om microbiële besmetting te voorkomen. Vanwege de toxiciteit van NaN3 bereidt u de conserveringsoplossing onder een chemische kap.
2. Weefselfixatie
OPMERKING: Alle oplossingen die in het volgende protocol worden gebruikt, worden in grote hoeveelheden bereid, voldoende om alle plakjes van hetzelfde weefselblok te verwerken en de technische variabiliteit te minimaliseren en de tijd voor afzonderlijke stappen te verkorten.
- Bereid de uitschakeloplossing met 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0,1 M zoutzuur (HCl), 25% v/v 0,1 M kaliumwaterstofftalaat (KHP) en vers 4% v/v glutaaraldehyde. Plaats alle monsters in schalen met schroefdeksels (70 x 23 mm) en incubeer ze gedurende 1 dag met de uitschakeloplossing met zacht schudden bij 4 °C, waarbij u ze met aluminiumfolie tegen licht beschermt.
- Bereid de Switch-on oplossing met 1x PBS (pH 7,4) en verse 1% v/v glutaaraldehyde. Plaats alle monsters in nieuwe schalen en incubeer ze met de Switch-on-oplossing met zacht schudden bij 4 °C gedurende 1 dag, waarbij ze met aluminiumfolie tegen licht worden beschermd.
NOTITIE: Vanwege de hoge toxiciteit en lichtgevoeligheid van glutaaraldehyde, moeten zowel Switch-off- als Switch-on-oplossingen altijd vers worden bereid en onder de chemische kap op ijs worden bewaard. Vul de schaal altijd met 20 ml van elke oplossing en sluit deze af met parafilm.
3. Inactivatie en opruiming
OPMERKING: Reactief glutaaraldehyde in de monsters moet worden geïnactiveerd door incubatie met een inactiveringsoplossing bestaande uit 1x PBS pH 7,4, 4% w/v acetamide, 4% w/v glycine, pH 9,0. De oplossing kan maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard. Om lipiden te verwijderen en het weefsel transparant te maken, gebruiken we de klaringsoplossing bestaande uit 200 mM natriumdodecylsulfaat (SDS), 20 mM natriumsulfiet (Na2SO3) en 20 mM boorzuur (H3BO3), pH 9,0. De oplossing moet bij RT worden opgeslagen, aangezien SDS neerslaat bij 4 °C. Alle volgende stappen worden uitgevoerd in buizen gevuld met de oplossing.
- Verplaats de monsters van de vaat naar de buizen en was ze gedurende 3 x 2 uur met 1x PBS pH 7.4 bij RT in zacht schudden.
OPMERKING: Voor stap 3.1 is het noodzakelijk om onder de chemische kap te werken vanwege de glutaaraldehydetoxiciteit. De acetamide, SDS en boorzuur zijn ook giftige reagentia en moeten onder een chemische kap worden gehanteerd. Vul de tube altijd met 50 ml van elke oplossing. - Incubeer de monsters in een inactiveringsoplossing bij 37 °C in een waterbad gedurende een nacht (o/n).
- Was gedurende 3 x 2 uur in 1x PBS pH 7.4 bij RT in zacht schudden.
- Incubeer de monsters in een klaringsoplossing bij 55 °C in een waterbad gedurende 3-7 dagen. Vervang de oplossing om de 2 dagen (tabel 1).
4. Immuno-etikettering
NOTITIE: Vóór de etiketteringsstap is het noodzakelijk om de resterende SDS te verwijderen, de autofluorescentie te verminderen en de epitopen te ontmaskeren met een antigeenoplossing bestaande uit 10 mM Tris-base, 1 mM EDTA en 0.05% v/v Tween 20, pH 9. De pH van 9 van de oplossing is geoptimaliseerd voor een efficiënt ophaalproces; Tris-base werkt als een buffermiddel om een stabiele pH-omgeving te behouden; EDTA, een chelaatvormer, verbetert de toegankelijkheid van het antigeen. Het niet-ionische wasmiddel Tween 20 helpt bij het verbeteren van de doorlaatbaarheid van het weefsel. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 °C. Het is belangrijk op te merken dat waterstofperoxide in combinatie met de stap voor het ophalen van antigeen een synergetisch effect heeft bij het verminderen van het autofluorescentiesignaal, door de endogene fluoroforen die verantwoordelijk zijn voor niet-specifiek achtergrondsignaal (zoals lipofuscine) af te breken en/of te wijzigen.
- Bereid 1x PBS met 0,1% v/v Triton X-100 (PBST), verwarm het voor tot 37 °C en was de monsters 3 x 3 uur gedurende de dag in zacht schudden bij 37 °C in de incubator. Laat de laatste wasbeurt o/n.
OPMERKING: Bewaar de PBST-stockoplossing bij 4 °C. Het is van cruciaal belang om SDS uit het weefsel te verwijderen, omdat het bij lage temperaturen onoplosbare neerslag kan vormen die de daaropvolgende acquisitieprocessen kan verstoren. - Voeg de dag erna 10 ml 30% v/v waterstofperoxide (H2O2) toe aan elk monster en laat het 45 minuten zachtjes schudden bij RT.
- Was 3 x 10 min met 1x PBS (pH 7,4) met zacht schudden op RT.
- Verwarm de oplossing voor het terughalen van antigeen bij 95 °C in een waterbad; breng de monsters over in de verwarmde oplossing en laat ze gedurende 10 minuten op 95 °C staan.
- Laat de monsters 40 minuten afkoelen tot RT in zacht schudden.
- Was 3 x 5 min met gedeïoniseerd water in zacht schudden.
- Breng de monsters in evenwicht in PBS bij 4 °C gedurende 15 min.
- Bereid een verse antilichaamoplossing gemaakt van PBST met 0,01% w/v NaN3 (zie de OPMERKING bij stap 1.3) en voeg primaire antilichamen toe. Incubeer de monsters met de oplossing in schalen met schroefdeksel bij 37 °C gedurende n dagen (1-7) in een incubator met zacht schudden en bescherming tegen licht (tabel 2).
OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de grootte en de dikte (tabel 1 en tabel 2). - Verplaats de monsters na n dagen in buisjes en was ze 3 x 2 uur met voorverwarmde PBST op 37 °C met zacht schudden in de incubator.
- Voeg secundaire antilichamen toe in PBST met 0,01% m/v NaN3 en incubeer de monsters in nieuwe schalen met schroefdeksels bij 37 °C gedurende n dagen (1-6) in een incubator met zacht schudden en beschermd tegen licht (tabel 1 en tabel 2).
- Breng de monsters na n dagen over in buisjes en was ze gedurende de dag 3 x 3 uur met voorverwarmde PBST bij 37 °C in een voorzichtig schuddende incubator. Laat de laatste wasbeurt o/n.
OPMERKING: Aangezien Triton X-100 en Tween 20 stroperig zijn, pipet u langzaam zodat de punt zich kan vullen. Vul de tube altijd met 50 ml van elke oplossing. Gebruik 10 ml antilichaamoplossingen voor elk monster en sluit de schaal af met parafilm om verdamping van de oplossing te voorkomen. Omdat de antilichaamoplossingen NaN 3 bevatten, kunnen ze bij 4 °C worden bewaard en binnen 2 weken worden hergebruikt om nieuwe monsters te labelen.
5. Aanpassing van de brekingsindex
OPMERKING: Om een hoge mate van transparantie te bereiken, is het noodzakelijk om de brekingsindex van het weefsel te homogeniseren. Hier gebruiken we 2,2'-thiodiethanol (TDE) verdund in 1x PBS. TDE-oplossingen moeten bij RT worden opgeslagen.
- Breng de monsters over naar nieuwe gerechten, voeg 30% v/v TDE toe en laat ze 4 uur staan met zacht schudden bij RT.
- Verwijder de 30% v/v TDE-oplossing, voeg 68% v/v TDE toe aan de monsters en laat ze zachtjes schudden bij RT.
OPMERKING: Aangezien TDE stroperig is, pipet u langzaam zodat de punt zich kan vullen. Inademing van TDE-damp of -nevel kan de luchtwegen irriteren. Daarom is het raadzaam om in een goed geventileerde ruimte te werken of zuurkasten te gebruiken om de blootstelling tot een minimum te beperken. TDE-oplossingen moeten worden bewaard bij RT. Gebruik 10 ml TDE-oplossingen voor elk monster.
6. Steekproef montage
OPMERKING: Om de montage van monsters en het verkrijgen van LSFM-beelden te vergemakkelijken, gebruiken we een op maat gemaakte, verzegelde monsterhouder ("sandwich" genoemd), die uit drie delen bestaat: een microscoopglaasje, een afstandhouder en een dekglaasje.
- Plaats de stalen afstandhouder (56 x 56 x 0,5mm3) over het microscoopglaasje (60 x 60 x 1mm3) en leg het monster op het microscopieglaasje.
- Plaats het kwartsdekglaasje (60 x 60 x 0,5 mm3) voorzichtig, klem alles aan elkaar en bereid een tweecomponenten siliconenlijm in een verhouding van 1:1. Gebruik een dekglaasje van kwarts om de brekingsindex aan te passen en de optische aberratie tijdens het acquisitieproces te verminderen.
- Vul met een spuit van 1 ml de ruimte tussen de afstandhouder en het dekglaasje met een tweecomponenten siliconenlijm en laat deze 10 minuten drogen.
- Verwijder de clips en gebruik een kleine naald om de hele sandwich langzaam te vullen met 68% v/v TDE.
- Maak verse lijm en sluit de sandwich af.
OPMERKING: Als de TDE per ongeluk het afstandsstuk in stap 6.1 bereikt, zal de lijm niet uitharden. Zorg ervoor dat er tijdens stap 6.2 geen luchtbellen ontstaan.
7. Strippen
OPMERKING: De structurele conservering en de verbeterde epitooptoegankelijkheid van SHORT maken het mogelijk om plakjes in meerdere rondes te labelen door de antilichamen te verwijderen en de monsters opnieuw te kleuren met andere markers.
- Open de sandwich met een mes, leg de monsters in nieuwe schalen met schroefdeksels gevuld met 30% v/v TDE en laat ze 3 uur staan.
- Breng de monsters over in buizen, was gedurende 3 x 2 uur in 1x PBS (pH 7.4) bij RT met zacht schudden en laat de laatste was o/n.
- Breng de monsters gedurende 4 uur in een klaringsoplossing in een waterbad van 80 °C.
- 3 x 2 uur wassen in 1x PBST (pH 7,4) op 37 °C in zacht schudden en de laatste wasbeurt o/n laten. Nu is het monster klaar om opnieuw te worden geëtiketteerd vanaf stap 4.8.
NOTITIE: Vul de tube altijd met 50 ml van elke oplossing. Gebruik 10 ml TDE-oplossing voor elk monster.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om meerdere plakken, variërend in dikte van 100 μm tot 500 μm, gelijktijdig te behandelen met behulp van de SHORT-methode. Deze aanpak verkort de totale verwerkingstijd voor de hele procedure aanzienlijk. In dit werk geven we een uitgebreide beschrijving van de hele pijplijn (Figuur 1) voor het gelijktijdig verwerken van meerdere postmortale dikke secties van het menselijk brein en demonstreren we het protocol op 24 plakjes tegelijk (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Beeldvorming met hoge resolutie en 3D-reconstructie van grote menselijke hersengebieden vereisen mechanische weefselsectie, gevolgd door optische opheldering en immunolabeling van afzonderlijke plakjes. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft hoe de SHORT-weefseltransformatiemethode kan worden gebruikt voor snelle en gelijktijdige verwerking van meerdere dikke secties van het menselijk brein voor 3D-hersenreconstructie met een subcellulaire resolutie met LSFM.
In tegenstelling tot andere b...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder dat er commerciële of financiële relaties waren die als een potentieel belangenconflict zouden kunnen worden opgevat.
Dankbetuigingen
We danken Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, AA Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, voor het verstrekken van de menselijke hersenmonsters die in deze studie zijn geanalyseerd. Dit project ontving financiering van het Horizon 2020 Research and Innovation Framework Programme van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 654148 (Laserlab-Europe), van het Horizon 2020-kaderprogramma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van de specifieke subsidieovereenkomst nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) en nr. 945539 (Human Brain Project SGA3), van het General Hospital Corporation Center van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer U01 MH117023, en van het Italiaanse ministerie van Onderwijs in het kader van Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI-onderzoeksinfrastructuur). Ten slotte werd dit onderzoek uitgevoerd met de bijdrage van "Fondazione CR Firenze". De inhoud van dit werk valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide > = 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phosphate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
Referenties
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251(2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84(2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631(2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48(2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684(2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066(2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038(2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447(2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170(2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844(2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234(2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160(2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405(2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808(2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
