Kristallisatie en in situ verzameling van gegevens over kamertemperatuur met behulp van de kristallisatiefaciliteit in Harwell en Beamline VMXi, Diamond Light Source

Summary

We presenteren een protocol voor de kristallisatie van eiwitten met behulp van de kristallisatiefaciliteit in het Research Complex in Harwell en de daaropvolgende in situ röntgenkristallografische gegevensverzameling van kristallen in de platen bij Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We beschrijven monstervereisten, kristallisatieprotocollen en richtlijnen voor gegevensverzameling.

Abstract

Protocollen voor robotische eiwitkristallisatie met behulp van de kristallisatiefaciliteit in Harwell en het in situ verzamelen van gegevens bij kamertemperatuur van kristallisatieplaten bij Diamond Light Source beamline VMXi worden beschreven. Deze aanpak maakt het mogelijk om op een eenvoudige manier kristalstructuren van hoge kwaliteit op kamertemperatuur te bepalen uit meerdere kristallen en geeft zeer snelle feedback over de resultaten van kristallisatieproeven en maakt seriële kristallografie mogelijk. De waarde van structuren bij kamertemperatuur bij het begrijpen van eiwitstructuur, ligandbinding en dynamiek wordt steeds meer erkend in de structurele biologiegemeenschap. Deze pijplijn is toegankelijk voor gebruikers van over de hele wereld met verschillende beschikbare toegangsmodi. Kristallisatie-experimenten die worden opgezet, kunnen op afstand worden afgebeeld en bekeken, waarbij kristallen automatisch worden geïdentificeerd met behulp van een machine learning-tool. Gegevens worden gemeten in een op wachtrijen gebaseerd systeem met datasets tot 60° rotatie van door de gebruiker geselecteerde kristallen in een plaat. Gegevens van alle kristallen binnen een bepaalde put of monstergroep worden automatisch samengevoegd met behulp van xia2.multiplex, waarbij de uitgangen rechtstreeks toegankelijk zijn via een webbrowserinterface.

Introduction

Röntgenkristallografie blijft een belangrijk hulpmiddel voor het begrijpen van de structuur en functie van eiwitten, en levert structuren met hoge resolutie van eiwitten of hun complexen met bijvoorbeeld substraten of kandidaat-geneesmiddelen. In veel gevallen blijft het verkrijgen van kristallen met gewenste eigenschappen - sterk diffracterend, kristalvorm die vatbaar is voor inweken en zonder kristalpathologieën zoals twinning - echter een aanzienlijk knelpunt¹. Aangezien geschikte chemische omstandigheden voor de productie van eiwitkristallen in het algemeen niet kunnen worden voorspeld, is kristallisatiescreening waarbij duizenden potentiële chemische mengsels worden onderzocht standaard, vaak geholpen door automatisering/robotica bij het instellen van schermen en kristalhotels voor het bewaken, vaak op afstand, van de kristallisatiedruppelbeelden die worden opgenomen.

Wanneer kristallen verschijnen, moeten ze meestal worden geoogst uit de kristallisatieomgeving met behulp van een nylon- of Kapton-lus en vervolgens worden overgebracht naar een druppel die een cryoprotectiemiddel bevat (waarvan het zoeken een extra variabele is) voordat ze worden ondergedompeld in vloeibare stikstof. Deze extra stappen tussen kristallisatie en het verzamelen van röntgengegevens kunnen onder andere betrekking hebben op uitdroging van de kristallisatiedruppel wanneer de afgesloten omgeving wordt verbroken, mechanische spanningen op het kristal wanneer het wordt gehanteerd en schade door de cryoprotectiemiddelen aan het kristalrooster (wat meestal resulteert in een verhoogde mozaïekspreiding)². Bovendien is het oogsten van kristallen tijd- en arbeidsintensief en kan het leiden tot inhomogeniteit tussen monsters, vooral wanneer zich tijdens het oogstproces huid vormt op druppels. De VMXi-bundellijn geeft toegang tot bruikbare gegevens van kristallen die op de plaat zijn geplakt en die anders zouden worden weggegooid voor gegevensverzameling.

De overgrote meerderheid van de röntgenkristalstructuren wordt bepaald bij 100K met behulp van de bovenstaande benadering, waardoor eenvoudig kristaltransport en -hantering mogelijk is en de levensduur van het kristal in de röntgenstraal met ordes van grootte wordt verlengd. Er is echter steeds meer belangstelling voor het bepalen van structuren onder niet-cryogene omstandigheden, dat wil zeggen veel dichter bij de fysiologische omstandigheden die relevant zijn voor de eiwitfunctie ^2,3,4. Dit maakt een veel betere beoordeling van de dynamische structuur van eiwitten mogelijk, voorkomt dat aminozuurconformaties of lussen worden bevroren in functioneel niet-relevante toestanden⁵, en maakt het mogelijk om ligandbinding te onderzoeken onder omstandigheden die veel dichter bij die in de natuurlijke omgeving van het eiwit in de cel en het organisme^{liggen 6}.

Een alternatieve benadering, geïmplementeerd bij de Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline bij de Diamond Light Source-synchrotron, VK, is om de diffractiegegevens rechtstreeks te meten van kristallen in de omgeving waarin ze zijn gegroeid (d.w.z. binnen de kristallisatieplaat), onder omgevingsomstandigheden en zonder verstoring ^7,8. Dit maakt zeer snelle feedback van kristallisatieschermen en optimalisaties mogelijk om een gebruiker naar een optimale kristalvorm voor zijn vereisten te leiden. Het maakt het ook mogelijk om op geautomatiseerde wijze hoogwaardige structuren voor kamertemperatuur te produceren⁹.

Dit protocol gaat ervan uit dat een gebruiker een zeer zuiver eiwitmonster klaar heeft voor kristallisatie. We beschrijven de gebruikerservaring die toegang heeft tot de kristallisatiefaciliteit in Harwell om eiwitkristallen te produceren en vervolgens beamline VMXi te gebruiken voor het verzamelen van gegevens (Figuur 1).

De kristallisatiefaciliteit in Harwell

De kristallisatiefaciliteit in Harwell (CF) bevindt zich in het onderzoekscomplex in Harwell (RCaH) naast de diamantlichtbron. De faciliteit biedt gebruikers een geautomatiseerd laboratorium met hoge doorvoer voor macromoleculaire kristallisatie, met behulp van robotica voor kristallisatiescreening, kristaloptimalisatie, kristalbeeldvorming en karakterisering. Door nauwe integratie met de sterk geautomatiseerde VMXi-bundellijn is het tempo van het bepalen van structuren bij kamertemperatuur sterk versneld en is de karakterisering van nieuwe eiwitstructuren, eiwit-ligand- en DNA-ligandcomplexen mogelijk, evenals geautomatiseerde fragmentscreening (Figuur 1), allemaal onder niet-cryogene omstandigheden.

De CF-pijplijn is een reeks instrumenten die nanoliterkristallisatierobots⁹ omvatten voor de kristallisatie van oplosbare en membraaneiwitten, vloeistofbehandelingsrobots voor het bereiden van commerciële kristallisatieschermen en complexe aangepaste optimalisatieschermen, en vier beeldvormingsinstrumenten (één bij 4 °C en drie bij 20 °C voor de beeldvorming van kristallisatieplaten (zie de materiaaltabel). Eén imager is in staat om lipide kubische fase (LCP) glasplaten af te beelden en één imager is uitgerust met multifluorescentie-optiek (beide bij 20 °C).

De faciliteit wordt nu op grote schaal gebruikt door een breed spectrum van academische en industriële gebruikers, waaronder het Membrane Protein Laboratory (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), de XChem fragment screening faciliteit ¹⁰, MX beamlines, de XFEL-hub, evenals het Rosalind Franklin Institute (RFI). Deze gevestigde en geoptimaliseerde pijplijn heeft het mogelijk gemaakt om kristallisatie-experimenten uit te voeren in een breed spectrum van structurele biologische projecten. Dit artikel beschrijft de pijplijn voor kristallen die bedoeld zijn voor gegevensverzameling bij VMXi, hoewel kristallen ook kunnen worden geoogst en cryogekoeld of naar de XChem-pijplijn kunnen worden geleid.

Gebruikerstoegang wordt toegewezen via het Diamond MX-voorstelsysteem (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) en industriële gebruikers worden ondersteund via de Diamond Industry Liaison-groep. Alle gebruikers kunnen naar de locatie komen met hun monster(s) of platen, die met de hand kunnen worden vervoerd. Het wordt niet aanbevolen om platen per koerier te verzenden, omdat onze ervaring suggereert dat druppels kunnen weggaan van de locatie waar ze zijn afgegeven, of dat druppels kunnen worden beschadigd door het kristallisatiereservoir. Als alternatief kunnen gebruikers, op afspraak, hun eiwitmonsters naar het CF sturen, waar medewerkers namens hen kristallisatie-experimenten opzetten. De experimenten kunnen op afstand door de gebruiker worden gevolgd door in te loggen op Rock Maker Web in het geval van CF of via ISPyB in het geval van VMXi. Toegang tot de CF kan op een iteratieve manier worden uitgevoerd op basis van de röntgendiffractieresultaten die bij Diamond zijn verzameld.

Beamline VMXi bij Diamond Light Source

Beamline VMXi (hierna "de beamline" genoemd) is een uniek en recent ontwikkeld instrument dat volledig is gewijd aan sterk geautomatiseerde röntgenkristallografie bij kamertemperatuur met een focus op het meten van gegevens van kristallen in geschikte kristallisatieplaten. De bundellijn biedt een microfocus (10 x 10 μm), roze bundel (banddoorlaat van <5 × ^10-2ΔE/E) met een hoge flux van ~2 × 10¹³ fotonen/s (bij 16 KeV)⁷. Deze hogefluxbundel, in combinatie met een snelle detector, maakt een zeer hoge doorvoer van monsters en het verzamelen van gegevens van monsters met een grootte van meer dan 10 μm mogelijk.

Kristallisatieplaten komen in de bundellijn terecht door te worden opgeslagen in een monsteropslagsysteem en afgebeeld op basis van het schema dat door de gebruiker is verstrekt tijdens het registreren van de platen met behulp van de ISPyB^11-interface SynchWeb¹². Doorgaans wordt gebruikers geadviseerd om een Fibonacci-reeks van tijdstippen voor beeldvorming te selecteren (0, 12, 24, 36, 60... 7.320 uur vanaf het invoeren van de plaat in het systeem). De gebruiker wordt per e-mail op de hoogte gebracht zodra een plaat is afgebeeld. Zowel beeldvorming in zichtbaar licht als in UV-licht zijn op aanvraag beschikbaar voor gebruikers. De beelden die door het monsteropslagsysteem worden gemaakt, worden geanalyseerd door een machine learning-algoritme; Dit lokaliseert en definieert automatisch aandachtspunten van objecten die op kristallen lijken en registreert de aandachtspunten die de gebruiker kan toevoegen aan een wachtrij voor gegevensverzameling. Gebruikers kunnen ook handmatig op de afbeeldingen in zichtbaar licht klikken om nuttige punten te registreren of kunnen op een gebied klikken en slepen dat moet worden geanalyseerd door middel van rasterscan. Deze punten zijn beschikbaar voor gebruikers om toe te voegen aan de wachtrij naast de automatisch gelokaliseerde punten.

Zodra alle monsters de juiste parameters hebben voor het verzamelen van gegevens, komt de plaat in een wachtrij. Wanneer de plaat de top van de wachtrij bereikt, wordt deze automatisch afgegeven aan de bundellijn. De kristallisatieplaten worden automatisch door een robotarm vanuit de kristalhotels in de bundellijn geladen en na beeldafstemming worden kristallografische datasets met een rotatie tot 60° gemeten van elk geselecteerd kristal volgens de door de gebruiker gedefinieerde instructies. Alle druppels binnen een plaat kunnen worden gebruikt voor deze experimenten op de bundellijn. Gegevens van meerdere kristallen worden samengevoegd om op geautomatiseerde wijze isomorfe, optimaal samengevoegde datasets te produceren ^7,9. Zodra alle datasets in de wachtrij zijn verzameld, ontvangt de gebruiker een e-mail met een link die hij moet volgen om de datasets in ISPyB¹¹ te bekijken, net als in andere Diamond MX-bundellijnen. Gebruikers worden ook doorverwezen naar de beamline-webpagina (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protocol

1. Het produceren van kristallen in in situ platen met behulp van de kristallisatiefaciliteit in Harwell

OPMERKING: Toegang tot het CF wordt ondersteund door een aantal verschillende routes en is afhankelijk van de toepassing van het project en het type gebruiker (academisch of industrieel). XChem- en MPL-projecten hebben een eigen aanvraagsysteem voor voorstellen via het User Administration System (UAS) en kunnen worden ingediend via de standaard toegangsroute (inclusief iNEXT Discovery en EUbOPEN) of BAG Access. Onderstaand protocol is specifiek voor VMXi-gebruikers.

1. Indiening van het voorstel en voorbereiding van het bezoek
   1. Geef informatie over het project aan een BAG offerte applicatie of voeg het toe aan een actieve BAG offerte. Er is meestal een BAG-coördinator, die het papierwerk regelt. U kunt ook een voorstel voor snelle toegang indienen voor toegang tot de bundellijn.
   2. Zorg ervoor dat het monster is geregistreerd en dat de veiligheid is gevalideerd in UAS op een voorstel voordat het ter plaatse aankomt, hetzij per koerier of persoonlijk.
   3. Zorg ervoor dat de gebruiker is geregistreerd (met FedID en wachtwoord).
   4. Zorg ervoor dat de gebruiker door de BAG-coördinator is toegevoegd aan een MX-voorstel als medewerker in UAS.
   5. Vul het formulier met details van het beamline-kristallisatiemonster in en stuur het formulier naar VMXi@diamond.ac.uk.
   6. Communiceer met het beamline-personeel over de experimentvereisten en de beschikbaarheid van beamline.
   7. Als eiwitmonsters worden verzonden, stuur dan alleen monsters op afspraak. Zie paragraaf 1.2 voor meer informatie.
   8. Als de gebruiker naar de locatie komt om kristallisatieplaten in de CF op te zetten, neem dan contact op met het personeel van de faciliteit over de beschikbaarheid van een tijdslot voor het gebruik van de faciliteitsinstrumentatie en volg paragraaf 1.2.1.
   9. Als de gebruiker platen op de locatie brengt, zorg er dan voor dat het monster in het juiste plaattype wordt gedoseerd en plaats de kristallisatiedruppels op de juiste locatie en in de juiste hoeveelheid. Volg paragraaf 1.2.2. De bundellijn accepteert alleen specifieke in situ kristallisatieplaten (Greiner CrystalQuickX en MiTeGen In Situ-1); zorg ervoor dat de druppels niet groter zijn dan 200 nL.
2. Kristallisatie-experiment uitgevoerd in CF
   OPMERKING: De faciliteit biedt een aantal macromoleculaire kristallisatiemethoden met hoge doorvoer, zoals dampdiffusie en batchkristallisatie onder olie en LCP. Het wordt aanbevolen om te beginnen met 70-100 μL puur eiwit en dampdiffusie-experimenten uit te voeren voor oplosbare eiwitten met drie zeven met een verhouding van 100 nL eiwitoplossing en 100 nL kristallisatiereservoiroplossing en de platen te incuberen bij 20 °C. Binnen de faciliteit zijn een aantal commerciële schermen beschikbaar. Vochtigheids- en temperatuurregeling zijn beschikbaar, waarbij 4 °C en 20 °C het meest worden gebruikt. Gebruikers die de CF bezoeken, krijgen gestandaardiseerde training en ondersteuning bij het bedienen van de kristallisatie-instrumentatie en zullen de hierin beschreven instellingen gebruiken.
   1. Verzendmonsters voor opstelling bij het CF
      LET OP: Voorafgaand aan aankomst ter plaatse moet het eiwitmonster gevalideerd zijn op een voorstel binnen het UAS-systeem. Zodra het eiwitmonster ter plaatse is aangekomen, zullen medewerkers kristallisatie-experimenten opzetten volgens de instructies in eerdere communicatie met de gebruiker. Bevestiging wordt per e-mail verzonden met barcode-informatie voor de experimentele kristallisatieplaten. De gebruiker wordt gevraagd om de kristallisatieplaten als containers toe te voegen aan het betreffende voorstel. Zodra dit is gebeurd, kunnen de platen worden opgeslagen in geautomatiseerde imagers in de kristallisatiefaciliteit of aan de bundellijn. ISPyB zal de interface zijn die wordt gebruikt voor interactie op de bundellijn.
      1. Verstrek de eiwitmonsteroplossing in de concentratie voor kristallisatie in veelvouden van 25 μl aliquots. Etiketteer duidelijk de monsterbuisjes met het eiwitmonster.
      2. Zorg indien nodig voor een eiwitbufferoplossing, ligandoplossing of reservoiroplossing.
      3. Informeer het facilitair personeel welke schermen en drop-ratio's moeten worden gebruikt.
   2. Instellingen van de kristallisatieplaat
      OPMERKING: We vereisen dat de kristallisatiedruppels in de Greiner CrystalQuickX- en MiTeGen In Situ-1-plaat zich op een bepaalde locatie bevinden; platen die elders zijn opgesteld, moeten de volgende Mosquito^{13-instellingen} gebruiken die hier worden beschreven.
      1. Om de plaatdefinitie voor MiTeGen In Situ-1 aan te passen, opent u de Mosquito SPT-software en klikt u op de standaard MiTeGen In Situ-1 plaatdefinitiepagina door te klikken op Setup | 96 Well | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 druppels) (Figuur 2A). Klik op de knop Bewerken en wijzig de waarden voor de locatie van subput 2: X Offset naar - 1,2 en Y Offset naar 1,8 en voor subput 3 locatie: X Offset naar 1,3 en Y Offset naar 1,8 (Figuur 2B,C).
      2. Om de plaatdefinitie voor Greiner CrystalQuickX aan te passen, opent u de Mosquito SPT-software en klikt u op de standaard Greiner CrystalQuickX-plaatdefinitiepagina door te klikken op Setup | 96 Well | Greiner CrystalQuickX (Figuur 2D). Klik op de knop Bewerken en wijzig de waarden voor de locatie van subput 1: X Offset naar - 1,95 en Y Offset naar 1,45 en voor subput 2 locatie: X Offset naar 1,95 en Y Offset naar 1,45 (Figuur 2E,F).

2. De bundellijn gebruiken bij Diamond Light Source

OPMERKING: Alle interactie met de beamline door gebruikers wordt op afstand uitgevoerd met behulp van de ISPyB^11-interface . Er is geen fysieke aanwezigheid bij de beamline vereist en gegevens worden verzameld met behulp van een op wachtrijen gebaseerd systeem in plaats van op een bepaald tijdstip te worden gepland. Gebruikers krijgen een voorstel dat is gekoppeld aan hun toegang tot de Diamond Light Source. Aan de bundellijn krijgt elke kristallisatieplaat een uniek bezoek toegewezen en wordt gedefinieerd als een 'container' binnen ISPyB¹¹ , analoog aan een puck met monsters op 100 K. Optimalisatieschermen kunnen niet worden gemaakt met behulp van de SynchWeb-interface en als zodanig wordt informatie meestal toegevoegd aan de commentaarsectie (zie stap 2.1.4.). De persoon die de plaat registreert, moet het e-mailadres controleren, aangezien de eigenaar van de plaat e-mails ontvangt met betrekking tot beeldvorming en meldingen over het invullen van de plaat.

1. Kentekenplaten registreren
   1. Log in op ISPyB met een geschikte Diamond FedID en selecteer Voorstellen. Zoek naar het voorstel van interesse door te scrollen of het voorstelnummer in de zoekbalk te typen. Selecteer Zending in het vervolgkeuzemenu onder het voorstelnummer (Afbeelding 3A), waardoor het venster Zendingen met zendingen in dat voorstel wordt geopend. Klik op +Zending toevoegen in de rechterbovenhoek (Figuur 3B) om het venster Nieuwe zending toevoegen te openen, geef de zending een naam, klik op Automated/Imager en klik vervolgens op de knop Zending toevoegen linksonder (Figuur 3C).
   2. Klik in het verzendvenster (Afbeelding 3D) op +Container toevoegen, waarna de paginaweergave Container toevoegen wordt weergegeven (Afbeelding 3E). Kies in het vervolgkeuzemenu Containertype een van de relevante plaattypen. De pagina wordt gewijzigd om het gekozen containertype weer te geven. Voer een streepjescode en containernaam in volgens de e-mailinstructies van het beamline-personeel dat specifiek is voor de experimentele platen. Houd er rekening mee dat het hoofdlettergevoelig is.
   3. Selecteer VMXi 20 °C-imager in het vervolgkeuzemenu Aangevraagde imager , het Fibonacci-beeldvormingsschema in het vervolgkeuzemenu Beeldschema , het kristallisatiescherm in het vervolgkeuzemenu Kristallisatiescherm en de gebruikersnaam in het vervolgkeuzemenu Eigenaar , klik op de knop Beeld en voer het juiste e-mailadres van de contactpersoon in het vak E-mail in (Afbeelding 3F).
   4. Voer meer informatie over de plaat in het vak Opmerkingen in. Selecteer het relevante monster in het vervolgkeuzemenu Eiwit en gebruik het acroniem dat is geregistreerd in UAS en is goedgekeurd door Diamond in het experimentele voorstel. Typ dezelfde naam in het vak Voorbeeldnaam . Laat de overige dozen leeg.
   5. Klik op het pictogram +Plaat om het monster over de hele plaat te repliceren en vul de hele container met groene vierkanten. Klik op +Container toevoegen onderaan de pagina om de plaat te registreren. Vraag een medewerker bij de beamline om de plaat over te brengen naar de juiste imager, waar deze zal worden opgeslagen en afgebeeld. Er wordt een bezoek gegenereerd wanneer de container is opgeslagen in de imagers en de gebruiker ontvangt een e-mail met een link naar de plaat en de afbeeldingen.
2. Beeldvormingsresultaten bekijken
   1. Navigeer naar het voorstel van interesse (stappen 2.1.1), selecteer Containers in het vervolgkeuzemenu onder het voorstelnummer en bekijk de lijst met beschikbare containers voor het voorstel. Selecteer de filterplaten als er andere soorten monsterhouders aanwezig zijn. Als u de zoekopdracht verder wilt verfijnen, vinkt u het vakje Mijn containers aan om alleen de meest relevante containers weer te geven die zijn gekoppeld aan de huidige aangemelde gebruikers-ID. Klik op de juiste container door de cursor over de afzonderlijke regel te bewegen en met de linkermuisknop te klikken.
   2. Bij het selecteren van de container wordt een nieuwe weergave weergegeven, met een overzicht van de plaat (Figuur 4A). Klik op een druppel in de plaatweergave aan de linkerkant van het scherm om de meest recente afbeelding van die betreffende druppel weer te geven. Gebruik de pijltjestoetsen om tussen druppels te navigeren of selecteer afzonderlijke druppels met een muis/cursor.
   3. Om historische afbeeldingen van een druppel te bekijken, klikt u op de H-knop en wacht u tot er een pop-upgalerij met afbeeldingen verschijnt over de huidige afbeelding van de put. Beweeg de cursor over de afzonderlijke afbeeldingen om de hoofdafbeelding bij te werken.
   4. Scoor afbeeldingen om de status van elke druppel aan te geven door op de knoppen 0 - 9 te drukken. Als u de afzonderlijke categorieën wilt zien, opent u het vervolgkeuzemenu Score in de linkerbovenhoek van de neerzetafbeelding. Zoek naar blauwe kruisen in elk van de drop-afbeeldingen, die het resultaat zijn van een algoritme (CHiMP) dat is getraind om te zoeken naar "kristallen" in de afbeeldingen.
   5. Klik op de derde pictogramknop genaamd Meten in de rechterbovenhoek van de neerzetafbeelding om toegang te krijgen tot een meetinstrument. Om dit gereedschap te gebruiken, klikt en sleept u een lijn, en een liniaal wordt verlengd en geeft de afstand in μm.
   6. Als u een extra beeldvormingssessie wilt aanvragen, klikt u op Zichtbaar of UV in de vervolgkeuzelijst naast de kop Acties onder aan de pagina. Klik vervolgens op de knop Plaatbeeldvorming aanvragen .
3. Kristal selectie/CHiMP
   1. Om handmatig punten voor gegevensverzameling toe te voegen, drukt u op de knop +Punt markeren . Beweeg de cursor over de gewenste bezienswaardigheid en selecteer. Wacht tot er een rood kruis verschijnt.
      OPMERKING: Er kunnen maximaal 100 objecten per druppel worden gemaakt.
   2. Wanneer alle punten zijn gemarkeerd, klikt u op de knop +Voltooien . Vergeet niet om ook op de knop +Voltooien te klikken voordat u objecten probeert te meten. Als u regio's wilt toevoegen voor gegevensverzameling via rasterscans, klikt u op de knop +Regio markeren . Klik op het punt linksboven en sleep naar beneden en naar rechts om een gebied te maken dat op de bundellijn wordt gescand. Net als bij punten, klikt u op de knop +Voltooien wanneer alle gewenste regio's zijn gemaakt.
      OPMERKING: Het is beter om één grotere regio te maken dan veel kleine regio's.
   3. Let op de blauwe kruisen die al op de drop-afbeeldingen staan, die het resultaat zijn van een algoritme dat is ontworpen om automatisch kristallijne objecten te lokaliseren (CHiMP). Als u de CHiMP-beoordeling van kristallisatiedruppels wilt visualiseren, klikt u op het selectievakje Automatische scores weergeven en wijzigt u vervolgens het vervolgkeuzemenu voor Klasse. Meestal is de meest bruikbare instelling hier de kristaloptie (Figuur 4B).
      OPMERKING: Dit is een nieuwe functie en het is niet gegarandeerd dat alle kristallen worden gevonden en kan ook andere objecten vinden die geen kristallen zijn.
   4. Wanneer alle punten en regio's zijn gemarkeerd in de respectievelijke druppels, klikt u op de knop Voorbereiden voor gegevensverzameling onder aan de pagina.
4. Monsters voorbereiden voor gegevensverzameling
   1. Bekijk de lijst met monsters met de punten of regio's die in de vorige stap zijn geselecteerd of automatisch zijn gelokaliseerd (Figuur 4C). Voeg afzonderlijke punten of regio's toe door op de knop + te drukken of voeg alle weergegeven voorbeelden toe door op de knop Huidige pagina toevoegen aan wachtrij te klikken.
   2. Er zijn filters beschikbaar om alleen Punt-, Regio-, Auto-punten of Handmatige punten weer te geven. Als u alleen de monsters wilt weergeven die niet zijn opgenomen (d.w.z. zijn blootgesteld aan röntgenstralen), klikt u op de opties Zonder gegevens en Niet voltooid boven de filterknoppen.
   3. Selecteer individuele monsters door op de betreffende regel te klikken en werk de afbeelding aan de rechterkant van het scherm bij om de juiste druppel en het juiste punt weer te geven. Als er veel voorbeelden in de lijst staan, verhoogt u het aantal voorbeelden dat per pagina wordt weergegeven door het vervolgkeuzemenu te selecteren met standaard 10 en maximaal 100 als het maximale aantal weergegeven voorbeelden.
   4. Zodra alle punten en regio's aan de wachtrij zijn toegevoegd, moet u ervoor zorgen dat alle parameters voor het verzamelen van experimentele gegevens aan elk experiment zijn gekoppeld.
      1. Gebruik filters voor Punt, Regio, Handmatig en Auto. Klik op het filter Punt en klik op het selectievakje Alles selecteren onder de filterknoppen om tegelijkertijd parameters toe te passen op alle monsters die zichtbaar zijn in de huidige lijst met monsters in de wachtrij .
      2. Selecteer experimentele parameters in het vervolgkeuzemenu aan de rechterkant van het scherm onder de neerzetfoto (Figuur 4D). Selecteer voor regio's de optie Grid Scan DMM stappen van 10 micron, 100 procent transmissie. Voor alle andere puntexperimenten selecteert u andere opties in het vervolgkeuzemenu.
      3. Voor het verzamelen van oscillatiegegevens klikt u op de Omega Scan DMM 60 graden 5 procent transmissieoptie om de maximale hoeveelheid gegevens van een individueel monster te verzamelen. Pas kleine rotaties toe voor zeer kleine kristallen of stralingsgevoelige monsters en varieer de transmissie op basis van eerdere ervaring met een bepaalde kristalvorm. Zodra alle experimentele parameters correct zijn toegepast, klikt u op de knop Wachtrijcontainer onder aan de pagina.
   5. Zodra de plaat de top van de wachtrij heeft bereikt, wordt deze gepresenteerd aan de beamline, worden datasets verzameld en keert deze weer terug naar de monsteropslag binnen de beamline. Zodra het verzamelen van gegevens van een plaat is voltooid, zoekt u naar een e-mail met een link die u kunt volgen om toegang te krijgen tot de relevante gegevens.
5. Voorbeeldgroepen maken
   OPMERKING: Er kunnen monstergroepen worden gemaakt om vergelijkbare monsters over meerdere druppels of platen te groeperen. Alle datasets binnen deze steekproefgroepen worden verwerkt met behulp van de xia2.multiplex^14-pijplijn zodra ze door DIALS zijn verwerkt. Dit kan nuttig zijn bij het verzamelen van veel zeer kleine wiggen van gegevens en kan ook nuttig zijn om de signaal-ruisverhouding te verhogen voor ligandbindingsexperimenten.
   1. Selecteer Voorbeeldgroepsbeheer in het vervolgkeuzemenu onder het voorstelnummer. Zoek naar een lijst met groepen als deze al door andere gebruikers zijn gemaakt. Als u een nieuwe groep wilt genereren, klikt u op de knop +Voorbeeldgroep maken . Klik op een zending in het vervolgkeuzemenu op de pagina Voorbeeldgroep maken om de voorbeeldviewer te zien (Afbeelding 5A). Klik op de container met de relevante monsters uit de lijst die is ingevuld.
   2. Wanneer op een container is geklikt, zoekt u naar een afbeelding met het plaatoverzicht.
   3. Klik op druppels afzonderlijk door op de afzonderlijke druppel te klikken (Figuur 5B) of klik op druppels in rijen of kolommen door op het betreffende rij-, letter- of kolomnummer te klikken. Wanneer alle wells die aan een afzonderlijke groep zijn gekoppeld, zijn geselecteerd, voert u een naam voor de groep in het vak Naam van voorbeeldgroep in en klikt u op de knop Voorbeeldgroep opslaan . Klik op de knop Voorbeeldgroepen weergeven op deze pagina om terug te keren naar de lijst met reeds gegenereerde voorbeeldgroepen die aan het voorstel zijn gekoppeld (Afbeelding 5C).
6. Voorbeeldgroepen bewerken
   1. Klik op een voorbeeldgroep in de lijst met groepen op de pagina Voorbeeldgroepbeheer .
   2. Klik op de knop +Voorbeeldgroep bewerken naast de containers die onder de groepsgegevens worden weergegeven (Afbeelding 5C).
   3. Let op de druppels, die al zijn gekoppeld aan een steekproefgroep, gemarkeerd op het plaatoverzicht.
   4. Voeg meer druppels toe aan de voorbeeldgroep door op druppels, putjes of kolommen te klikken zoals voorheen.
      OPMERKING: Druppels kunnen niet uit een steekproefgroep worden verwijderd.
   5. Zodra er extra druppels zijn toegevoegd, bewerkt u de naam van de voorbeeldgroep en slaat u deze op, of slaat u deze op door op de knop Voorbeeldgroep opslaan te klikken.
7. Visualiseren en analyseren van de output van steekproefgroepen
   1. Klik op een afzonderlijke groep in de lijst met voorbeeldgroepen om het plaatoverzicht weer te geven van de container of containers die aan de groep zijn gekoppeld. De druppels die in de groep zijn opgenomen, worden op dit display gemarkeerd (Figuur 5D).
   2. Zoek naar een lijst met de chronologische laatste drie multiplextaken als er gegevens in deze groep zijn verzameld.
   3. Klik op de regel voor een multiplexrun om de onderstaande verwerkingsresultaten bij te werken.
   4. Let op de snelkoppelingsknop , die het aantal gegevenssets weergeeft dat aan de groep is gekoppeld. Klik op deze knop om een nieuwe pagina Gegevensverzamelingen te openen met de afzonderlijke gegevensverzamelingen.

3. Toegang tot de automatische gegevensverwerking

OPMERKING: Zodra de gegevens zijn verzameld, worden ze door verschillende automatische gegevensverwerkingspijplijnen geleid. De vier standaardpijplijnen die bij Diamond over de MX-bundellijnen worden gebruikt, worden ook uitgevoerd op gegevens die bij de bundellijn worden verzameld. Het zijn 'fast_dp', 'xia2 dials', 'xia2 3dii' en 'autoPROC'15. 'fast_dp' zorgt voor een snelle datareductie om de kwaliteit snel te beoordelen. De andere drie pijplijnen zullen meer rekentijd vergen en een verscheidenheid aan verschillende softwarepakketten voor gegevensreductie uitvoeren ter vergelijking. Dienovereenkomstig is de uitvoer meestal van hogere kwaliteit dan de "fast_dp"-uitvoer. Datasets die op de bundellijn worden verzameld, zullen ook door de automatische multi-crystal merging-software 'xia2.multiplex'14 lopen, die alle datasets binnen een gedefinieerde groep zal samenvoegen. Houd er rekening mee dat hoewel rasterscans momenteel niet automatisch worden verwerkt, de gegevens handmatig kunnen worden verwerkt met behulp van de 'xia2.ssx'-pijplijn. De resultaten van de automatische verwerkingspijplijnen zijn te vinden in ISPyB¹¹ met behulp van het volgende protocol.

1. Lokaliseren van de datasets
   1. Log in op ISPyB zoals hierboven beschreven en selecteer Voorstellen.
   2. Zoek naar het voorstel van interesse door te scrollen of het voorstelnummer in de zoekbalk te typen.
   3. Klik op het gewenste bezoek in de lijst die op het scherm verschijnt om het venster Gegevensverzamelingen voor dat bezoek te openen.
   4. Pas de gewenste filters toe.
      OPMERKING: Een populair filter is het filter 'Auto Integrated', dat alleen gegevenssets weergeeft die met succes door een of meer verwerkingspijplijnen zijn uitgevoerd. Dit sluit rasterscans uit, omdat deze momenteel niet automatisch via ISPyB worden verwerkt.
   5. Scroll naar beneden op de pagina om de gewenste dataset te vinden.
      OPMERKING: Elke dataset toont de monster-ID, de gebruikte experimentele parameters, een diffractiebeeldviewer, een kristalbeeldviewer en een analyseplot per beeld voor snelle observatie van de gegevenskwaliteit.
2. Om toegang te krijgen tot de resultaten van de automatische verwerking
   1. Klik op het tabblad Automatische verwerking onder het gegevensoverzicht van een specifiek experiment om de resultaten van de automatische gegevensreductie te bekijken (Afbeelding 6A).
   2. Klik op de verschillende tabbladen die overeenkomen met de verschillende pijplijnen om een gedetailleerd overzicht van elke uitvoer te zien.
      OPMERKING: Als er voorbeeldgroepen zijn gedefinieerd, zijn er twee tabbladen die overeenkomen met multiplextaken. De ene komt overeen met het samenvoegen van alle datasets in de groep tot op dat punt, terwijl de andere overeenkomt met het samenvoegen van datasets binnen alleen die drop.
   3. Klik op de knop Logs & Files om de resulterende MTZ-bestanden te downloaden als de verwerking is gelukt en eventuele bijbehorende logbestanden. Klik op het tabblad Downstream Processing onder het gedeelte Auto Processing om de uitvoer van DIMPLE te bekijken.
      OPMERKING: DIMPLE wordt alleen uitgevoerd als er een PDB-bestand is verstrekt tijdens het indienen van het voorbeeld.
   4. Klik op de knop Logs & Files om de resulterende uitvoer van DIMPLE te downloaden.
3. Om toegang te krijgen tot de multiplexresultaten van de groep, opent u het vervolgkeuzemenu bovenaan het scherm met het voorstelnummer erop en klikt u op Voorbeeldgroepsbeheer. Klik op de rij die overeenkomt met de gewenste groep binnen de juiste container. Scroll naar beneden om de lijst met multiplexuitgangen te vinden die overeenkomen met de groep, zoals visueel weergegeven door een diagram van de plaat.
   1. Klik op de gewenste multiplex-uitvoer uit de gegeven lijst. Klik op de knop xxx Gegevenssets , waarbij xxx het aantal samengevoegde gegevenssets is (Figuur 6B).
      OPMERKING: Hiermee wordt het scherm Gegevensverzamelingen geopend, maar alleen de gegevenssets van de geselecteerde multiplextaak worden weergegeven.
   2. Klik op het tabblad Automatische verwerking van het bovenste experiment.
   3. Klik op het tabblad Multiplex Processing dat overeenkomt met het juiste aantal samengevoegde datasets.
   4. Klik op de knop Logs & Files om de .mtz en bijbehorende logbestanden te downloaden (zoals in stap 3.2.3).
4. Toegang krijgen tot de resultaten van rasterscans
   1. Navigeer naar het scherm Gegevensverzamelingen voor het gewenste bezoek. De resultaten van de rasterscangegevens worden weergegeven naast alle verzamelde rotatiegegevens.
      OPMERKING: Er zijn geen automatische verwerkingsresultaten.
   2. Het beeld van de kristaldruppel heeft het raster bedekt met een heatmap die de aanwezigheid van diffractie weergeeft. Klik op een vierkantje om het diffractiebeeld voor die positie in het raster te bekijken. Klik op het vervolgkeuzemenu boven aan de afbeelding van de kristalbron om te wijzigen wat de heatmap voorstelt. De standaardinstelling is de totale intensiteit van de diffractie, maar kan worden gewijzigd in het totale aantal spots, de geschatte resolutie of frames zonder ijs.

4. Herverwerking van gegevens

OPMERKING: Geselecteerde gegevenssets kunnen opnieuw worden verwerkt via de ISPyB^11-interface met behulp van dezelfde verwerkingspijplijnen die automatisch worden uitgevoerd met gewijzigde instellingen zoals gedefinieerd door de gebruiker. Er kan een resolutie-cut-off worden toegepast; Als de symmetrie/cel van het kristal bekend is, kan dit ook worden gedefinieerd om ervoor te zorgen dat de verwerkingspijplijnen in de juiste instelling worden uitgevoerd. Bepaalde afbeeldingsbereiken in specifieke gegevenssets kunnen ook worden samengevoegd met behulp van beschikbare pijplijnen met meerdere kristallen. Dit kan voordelig zijn als systematische stralingsschade ervoor zorgt dat het laatste deel van de diffractiebeelden van slechte kwaliteit is. Het is ook een optie voor de gebruiker om zijn datasets te downloaden met behulp van het hierboven beschreven protocol en de gewenste opwerkingssoftware lokaal uit te voeren, waarvan tutorials elders gratis beschikbaar zijn (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

1. Meerdere afzonderlijke gegevenssets opnieuw verwerken
   1. Log in op ISPyB en navigeer naar de datasets die u interesseren (stap 3.1).
   2. Klik op een dataset en klik op het tandwielpictogram in de titelbalk van de dataset (Figuur 6) om het verwerkingsvenster te openen.
   3. Configureer de gewenste instellingen en selecteer welke frames in de herverwerking worden opgenomen.
      OPMERKING: Het afbeeldingsbereik kan worden gedefinieerd door een bereik in de gelabelde vakken te typen of door op het gewenste gebied te klikken en te slepen in de analyseplot per afbeelding (Figuur 7A).
   4. OPTIONEEL: Als u nog een gegevensset wilt toevoegen voor individuele verwerking, klikt u op het tandwielpictogram en deze verschijnt in het verwerkingsvenster onder de eerste gegevensset. Vink het vakje Individueel verwerken aan.
   5. Klik op de knop Integreren .
2. Multikristalgegevens opnieuw verwerken
   1. Open het verwerkingsvenster van een willekeurige gegevensset.
   2. Klik op de Multi-Crystal knop om een nieuw scherm te openen.
   3. Scroll naar beneden om een reeks analyseplots per afbeelding te vinden van experimenten tijdens het bezoek.
   4. Kies een verwerkingspijplijn in het vervolgkeuzemenu.
   5. OPTIONEEL: Definieer eventuele resolutielimieten of bekende eenheidscelparameters.
   6. Klik en sleep om beeldbereiken te definiëren die moeten worden opgenomen in de verwerking van meerdere kristallen (Afbeelding 7).
      OPMERKING: Dit moet over meerdere verschillende plots worden gedaan, zodat datasets van meerdere verschillende kristallen worden samengevoegd.
   7. Klik op de knop Integreren (Figuur 7B).
3. Om toegang te krijgen tot opnieuw verwerkte gegevens
   1. Navigeer naar de pagina Gegevensverzamelingen voor het specifieke bezoek (stappen 3.1.1-3.1.3).
   2. Klik op de knop Opnieuw verwerken bovenaan het scherm.
   3. Scroll naar beneden om de gewenste taak te vinden.
   4. Klik op het bestandspad in de rechterkolom om het scherm Gegevensverzamelingen voor de opnieuw verwerkte gegevens te openen.
   5. Open het tabblad Automatische verwerking en download de gegevens zoals eerder beschreven (stap 3.2).
      OPMERKING: Alle opnieuw verwerkte taken zijn te herkennen aan het symbool met de cirkelvormige pijlen naast de naam van de pijplijn.

Results

De kristallisatiefaciliteit en VMXi-bundellijn zijn gebruikt voor een breed scala aan projecttypen en gebruiksscenario's. Hier zijn een klein aantal voorbeelden om te illustreren wat gebruikers mogelijk willen nastreven.

Casestudy 1: Standaard gegevensverzameling

De bundellijn maakt een snelle bepaling van kristalstructuren bij kamertemperatuur mogelijk uit een klein aantal kristallen in een kristallisatieplaat. Het minimale aantal kristallen is afhankelijk van de ruimtegroep en de kristaloriëntaties, maar is vaak 1-4, hoewel een betere gegevenskwaliteit kan worden bereikt door gegevens van enkele tientallen kristallen samen te voegen. Een recent voorbeeld is een van de bundellijnstandaarden, thaumatine. Meerdere kristallen, weergegeven in figuur 8A, werden handmatig gemarkeerd voor gegevensverzameling, zoals beschreven in protocolsectie 2.3. Deze kristallen werden toegevoegd aan de wachtrij zoals beschreven in protocolsectie 2.4 en experimentele parameters werden geselecteerd uit de vervolgkeuzelijst. Nadat experimentele parameters waren toegepast, werd de plaat in de wachtrij geplaatst voor gegevensverzameling. Gegevenssets werden verzameld, automatisch geschaald en samengevoegd met behulp van de xia2.multiplex-pijplijn, zoals beschreven in protocolsectie 3. Een voorbeeld van een uitvoer van SynchWeb is weergegeven in figuur 8A in het midden. Vijf samengevoegde datasets gaven aanleiding tot een dataset met een resolutie van 1,66 Å. Voor standaard dataverzameling van ongeveer vijf kristallen in een put werden datasets binnen 2,5 minuut verzameld.

Casestudy 2: Ligandbinding – Fragmentexperiment met Mac1-eiwit

Het produceren van structuren van eiwit-ligandcomplexen bij kamertemperatuur kan eenvoudig worden bereikt met behulp van de bundellijn. Liganden kunnen worden toegevoegd aan druppels op kristallisatieplaten (handmatig of door akoestische druppelinjectie) en gegevens kunnen worden gemeten na een geschikte incubatietijd. In het hier beschreven voorbeeld werd een reeks fragmenten gedoseerd in putjes met kristallen van het SARS-CoV-2 eerste macrodomein van het eiwit nsp3 (Mac-1) in een kristallisatieplaat. Twee van de putjes met hetzelfde fragment werden ingedeeld als een groep zoals beschreven in protocolstap 2.5. Meerdere kristallen (42) werden gemarkeerd voor gegevensverzameling zoals beschreven in protocolstappen 2.3 en 2.4, en datasets werden verzameld met behulp van standaardparameters (60° rotatie, 0,1° stap, 0,00178 s blootstelling, 5% transmissie, 16 KeV - per kristal) (Figuur 8B). Datasets van de twee putten werden automatisch verwerkt met behulp van de xia2.dials-pijplijn en vervolgens werd de xia2.multiplex-pijplijn gestart om 22 van deze datasets automatisch samen te voegen. DIMPLE werd vervolgens uitgevoerd op de output van deze pijpleidingen en leverde kaarten op die duidelijk bewijs van het gebonden fragment lieten zien. Het fragmentenmodel werd ingebouwd in de leegstandsdichtheid en verder verfijnd (Figuur 8B rechts). Ligandgebonden structuren op kamertemperatuur kunnen eenvoudig worden bepaald met behulp van deze reeks stappen om onschatbare informatie en feedback te geven aan het op structuur gebaseerde ontwerpproces van geneesmiddelen. Voor deze dataverzameling van 42 kristallen in een aantal putten werden datasets binnen 10 minuten verzameld.

Casestudy 3: Structuuroplossing met een ruimtegroep met lage symmetrie en voorkeursoriëntaties Een stapel van meerdere kristallen met plaatachtige morfologie werd geproduceerd uit kristallisatie-experimenten met een c-type gasbindend cytochroom (Figuur 8C). Door verschillende posities aan de rand van de stapel te selecteren waar slechts één kristal zich in de röntgenstraal bevond, was het mogelijk om een dataset van goede kwaliteit te verkrijgen met een resolutie van 1,75 Å door wiggen van vier kristallen samen te voegen, ondanks een monokliene (C2) ruimtegroep. Dit maakte een snelle voortgang van het project mogelijk zonder de noodzaak om de kristallisatieomstandigheden verder te optimaliseren. Dit resultaat is eerder beschreven⁹. Voor deze dataverzameling van vier kristallen in een put werden datasets binnen 2 minuten verzameld.

Casestudy 4: Het verkrijgen van informatie en de structuur bij kamertemperatuur van microkristallen in een plaat met behulp van seriële kristallografie

Vaak wanneer microkristallen in een druppel verschijnen of wanneer gebruikers microkristallisatieprotocollen in batch willen optimaliseren als voorloper van seriële kristallografie-experimenten bij synchrotron- of XFEL-bronnen, is het zeer nuttig om snel feedback te krijgen over de diffractie-eigenschappen en eenheidscelafmetingen van verschillende proeven met minimaal materiaal. In deze use case werden microkristallen van lysozym die in batch groeiden, gepipetteerd in een kristallisatieplaat (200 nL volume per druppel) en werden gegevens verzameld van acht druppels met behulp van een rasterscan met een stapgrootte van 10 μm (Figuur 9). De resulterende 25.906 stilstaande beelden werden verwerkt met behulp van seriële kristallografiesoftware, wat resulteerde in een dataset, waarbij 9.891 diffractiepatronen werden geïndexeerd en samengevoegd, wat een dataset opleverde met een resolutie van 2,0 Å die goed werd verfijnd ten opzichte van de gepubliceerde structuur van de kamertemperatuur (_R-werk = 19,6%,_R-vrij = 23,6% met behulp van PDB 8A9D) (Tabel 1). Dit maakte een gedetailleerde analyse van de verdeling van de eenheidscellen en een bepaling van de structuur van de kamertemperatuur van microkristallen mogelijk die kon worden gebruikt voor complexe seriële kristallografie-experimenten, waaronder tijdopgeloste studies. Het totale benodigde volume microkristalsuspensie bedroeg 1,6 μL. Voor deze gegevensverzameling van microkristallen in acht putten met behulp van rasterscans werden datasets binnen 40 minuten verzameld.

Figuur 1: Schema van de eiwit-naar-structuur-pijplijn met kristallisatiescreening, optimalisatie in de kristallisatiefaciliteit, geautomatiseerde gegevensverzameling en -verwerking op kamertemperatuur zonder monsteroogst bij VMXi, XChem-fragmentscreening en gegevensverzameling bij andere MX-bundellijnen. Gebruikers kunnen de pijplijn starten door een monster aan te leveren of door platen naar de VMXi-bundellijn te brengen. Afkorting: Veelzijdige Macromoleculaire Kristallografie in situ. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De Mosquito SPT Labtech interface voor het opzetten van kristallisatieplaten. (A) (1) De MiTeGen In Situ-1 Setup weergave. Kies de MiTeGen 2 drop standaard plaat door naar (2) het 96-well plaattype te gaan en (3) de MiTeGen plate 2 drop plate te selecteren. Om de definitieparameters voor drop 1 en drop 2 te wijzigen, die vereist zijn voor VMXi, klikt u op het pictogram (4) bewerken . Dit opent een nieuw venster (B) waarin (5) de X- en Y-offsets moeten worden gewijzigd zoals weergegeven. Selecteer (B) de subput 2 en (C) subput 3 en wijzig de waarden dienovereenkomstig. (D) De CrystalQuickX Setup-weergave. Kies de CrystalQuickX 2 drop standaard plaat door naar het 96-well plaattype te gaan en de MiTeGen plate 2 drop plate te selecteren. Om de definitieparameters voor drop 1 en drop 2 te wijzigen, die vereist zijn voor VMXi, klikt u op het bewerkingspictogram hetzelfde als hierboven. Dit opent een nieuw venster waarin (E,F) de X- en Y-offsets moeten worden gewijzigd zoals weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De SynchWeb-interface die laat zien hoe u een VMXi-zending aanmaakt, een kenteken registreert en contactgegevens controleert. Screenshots van de verschillende stadia van het uploaden van informatie in de SynchWeb-interface worden getoond vanuit (A) het vervolgkeuzemenu, (B,C) het registreren van een nieuwe zending, (D) het registreren van een nieuwe container, (E) het invoeren van de plaatinformatie, (F) het controleren van contactgegevens en (G) een lijst met geregistreerde containers binnen een voorstel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Selecteren en voorbereiden van monsters voor gegevensverzameling met behulp van SynchWeb. Er wordt een reeks schermafbeeldingen weergegeven die de verschillende stadia van het voorbereiden van monsters voor gegevensverzameling met behulp van de SynchWeb-interface laten zien. (A) Punten en regio's van belang worden geselecteerd uit het drop-overzicht. In het onderste deel van dit paneel bevindt zich een chronologische reeks foto's van één druppel. (B) Een voorbeeld van de CHiMP-uitvoer voor één plaat met de resultaten voor de categorie 'kristal'. (C) Voorbeelden toevoegen aan de wachtrij uit de lijst met geselecteerde punten en regio's en (D) parameters toepassen voor gegevensverzameling op de in de wachtrij geplaatste monsters uit de vervolgkeuzelijst met door de bundellijn gemaakte experimentinstellingen. Let op het verschil tussen monsters zonder experimentele parameters (in rood) en monsters met correct toegepaste parameters (boven en onder). Aan de onderkant van dit paneel bevindt zich de knop Queue Container , die de plaat in de wachtrij plaatst die op de beamline moet worden verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Voorbeeld van het maken van groepen in SynchWeb. Een reeks schermafbeeldingen die de verschillende fasen van het maken van voorbeeldgroepen laten zien. (A) De plaat(en) met monsters worden geselecteerd uit de betreffende zending en (B) de druppels in de plaat worden geselecteerd. Dit kunnen individuele druppels zijn of kunnen per rij en/of kolom worden geselecteerd. (C) Een lijst van steekproefgroepen die reeds zijn aangemaakt. (D) De outputs van de laatste drie multiplexverwerkingstaken worden vermeld en kunnen worden geselecteerd om statistieken van de verwerkingspijplijn weer te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Gegevensverwerking en gegevensreductie. (A) Screenshot van een verwerkte dataset in ISPyB¹¹. De knop om toegang te krijgen tot de verwerkingsfuncties is gemarkeerd. Voorbeeld-ID en experimentele parameters worden linksboven weergegeven en de diffractiebeeldviewer in het midden. Als u op deze afbeelding klikt, wordt een interactief venster geopend om verschillende afbeeldingen te bekijken. De kristalbeeldviewer wordt aan de rechterkant weergegeven en als u op deze afbeelding klikt, wordt ook een interactief venster geopend om beamline- en Formulatrix-opslagafbeeldingen te vergelijken. Uiterst rechts wordt een analyseplot per afbeelding weergegeven en als u op deze afbeelding klikt, wordt een vergrote versie van deze uitvoer geopend. Door op het tabblad Automatische verwerking te klikken, wordt de automatische verwerking zichtbaar en wordt de vergelijking tussen de resultaten van de verschillende pijplijnen eenvoudig. Klik op de tabbladen om te schakelen tussen de verschillende verwerkingspijplijnen en bekijk de gedetailleerde uitvoer van de geselecteerde pijplijn. De knop Logs & Files voor het downloaden van gegevens is gemarkeerd. Als u op het tabblad Downstream Processing klikt, wordt uitgevouwen en worden resultaten weergegeven voor alle gegevenssets die via pijplijnen voor gegevensreductie worden uitgevoerd, indien van toepassing. (B) Schermafbeelding van het scherm Voorbeeldgroepbeheer . De door de gebruiker gedefinieerde groepsnaam staat bovenaan en de visuele beschrijving van de opgenomen putten is hieronder te zien. Een groen vakje geeft aan dat alle kristallen die van die druppel worden gemeten, in de groep worden opgenomen. Een overzicht van verschillende multiplextaken die op die groep zijn uitgevoerd, is te zien en daaronder staat de gedetailleerde uitvoer van multiplex. De knop Gegevenssets om de opgenomen experimenten te bekijken, is gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Vensters voor gegevensverwerking. (A) Individuele en (B) multi-crystal datasets. Er worden twee afzonderlijke gegevenssets weergegeven waarin gegevensregio's zijn geselecteerd. Als het selectievakje Afzonderlijk verwerken is aangevinkt, worden de geselecteerde diffractiebeelden afzonderlijk verwerkt door op de knop Integreren te drukken. Als u op de knop Multi-crystal klikt, wordt een weergave van de afzonderlijke datasets geopend. Als u diffractiebeelden uit meerdere gegevenssets opnieuw wilt verwerken, worden gebieden van afbeeldingen geselecteerd zoals weergegeven en wordt de herverwerking gestart door op de knop Integreren te klikken zoals gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Representatieve resultaten van de VMXi-pijplijn. (A) Gemarkeerde kristallen voor proteïne thaumatine binnen een kristallisatiedruppel (linkerpaneel), gegevensverwerkingsresultaten (middenpaneel) en elektronendichtheid (rechterpaneel). (B) Verzameling op meerdere kristallen om de binding van het fragment aan het SARS-CoV-2 Macro-domein te bepalen. Datasets werden verzameld op meerdere kristallen in aanwezigheid van een fragment van het EU-OPENSCREEN-fragmentscherm met behulp van standaard experimentele instellingen. Voorbeelden van deze gegevensverzamelingen worden getoond in dit fragment van SynchWeb. Het fragment werd in de overeenkomstige dichtheid ingebouwd en verder verfijnd, zoals het meest rechts te zien is. (C) Gemarkeerde monokliene kristallen in een stapel van een uitdagende kristallisatietreffer die wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens. Groene kruisen en rode cijfers geven aan waar de gegevens zijn gemeten met behulp van een straal van 10 μm en een rotatie van 60°. Vier van de resulterende wiggen werden samengevoegd tot een dataset met een resolutie van 1,75 Å. De elektronendichtheid rond de heemgroep wordt aan de rechterkant weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Seriële kristallografie in de kristallisatieplaat. (A) Optisch beeld van de kristallisatiedruppel, met een wit kader dat het interessegebied voorstelt. (B) Definitie van rasterscanpunten. (C) Warmtekaart die diffractie aangeeft. (D) Elektronendichtheidskaart die voortkomt uit een seriële kristallografiedataset van meer dan 9.000 stilstaande diffractiepatronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resolutie (Å)	Volledigheid (%)	Veelheid	I/σ(I)	R-splitsing	CC1/2	Unieke waarnemingen
Algeheel	100	95.5	20.8	0.063	0.998	8422
Laag (55.55 - 5.43)	100	147.1	81.7	0.028	0.999	488
Hoog (2.03 -2.00)	100	75.3	1.2	1.092	0.410	411

Tabel 1: Gegevensstatistieken voor de seriële dataset van de VMXi RT. Afkortingen: I = gemiddelde intensiteit van de geschaalde waarnemingen; _R-splitsing = een maat voor de discrepantie van de gemeten intensiteiten; CC 1/2 = correlatiecoëfficiënt tussen twee willekeurige helften van de dataset.

Discussion

We hebben de volledige procedure beschreven vanaf de aankomst van een eiwitmonster in de CF tot het downloaden van de uiteindelijke gegevens door de gebruiker voor verdere toepassingen. Kritische stappen zijn de productie van een eiwitmonster van hoge kwaliteit en geschikte kristalschermen, hetzij met behulp van commerciële schaarse matrixschermen of optimalisatieschermen op basis van vastgestelde omstandigheden. Dit proces kan plaatsvinden in de CF, of gebruikers kunnen de kristallisatieprocedures in de thuislaboratoria uitvoeren en geschikte kristallisatieplaten naar de bundellijn brengen. De vaststelling van geschikte parameters voor het verzamelen van gegevens kan voor bepaalde monsters van belang zijn, met name wanneer stralingsschade een probleem is. In de meeste gevallen is geautomatiseerde gegevensverwerking volledig voldoende om de wetenschappelijke vraag te beantwoorden, hoewel gebruikers de mogelijkheid behouden om opnieuw te verwerken met behulp van de bundellijngereedschappen, bijvoorbeeld wanneer de ruimtegroep dubbelzinnig is of alleen het eerste deel van de verzamelde gegevens wordt gebruikt om de effecten van stralingsschade te minimaliseren.

Als er geen geschikte kristallen worden geproduceerd uit de eerste kristallisatieproeven, kunnen veranderingen in eiwitconcentratie, zuiverheid of kristallisatieschermen worden onderzocht, evenals het gebruik van kristalzaaien. Als kristallen niet diffracteren tot een bruikbare resolutie op de bundellijn, kunnen rasterscans worden gebruikt met een niet-verzwakte bundel om de inherente diffractielimiet en eenheidscel van de kristallen te beoordelen om optimalisatie-inspanningen te begeleiden. Kristallen die te klein zijn voor het verzamelen van gegevens in platen (bijv. <10 μm) kunnen in plaats daarvan geschikt zijn voor seriële kristallografie of nanofocusexperimenten (bijv. bij Diamond beamline VMXm). Het oplossen van structuren met behulp van VMXi-gegevens is over het algemeen eenvoudig door moleculaire vervanging, vooral sinds de komst van Alphafold¹⁶ om effectieve zoekmodellen te geven. Als dit niet lukt, kunnen kristallen worden geoogst en gecryokoeld uit platen om conventionele afwijkende diffractie met één golflengte, afwijkende diffractie met meerdere golflengten of faseringsexperimenten met lange golflengte mogelijk te maken.

De voordelen van deze methode zijn onder meer de mogelijkheid om snelle, hoogwaardige datasets en feedback rechtstreeks van kristallisatieplaten te verkrijgen zonder de noodzaak om kristallen te verstoren uit de omgevingen waarin ze zijn gegroeid. De zogenaamde 'kamertemperatuur Renaissance' in de structurele biologie legt een premie op structuren die zijn verkregen onder niet-cryogene omstandigheden om meer fysiologische relevantie en eiwitdynamiek te kunnen onderzoeken². Gewoonlijk wordt een iets lagere resolutie bereikt dan voor een geoptimaliseerd cryogekoeld kristal, maar alleen als er geschikte cryo-omstandigheden zijn vastgesteld en als de kristallen robuust zijn tegen mechanische hantering en opening van de kristallisatiedruppel³. Een toekomstige toepassing waarvoor deze pijplijn zeer geschikt is, is een grootschalige screening van eiwit-ligandcomplexen of fragmentcampagnes bij kamertemperatuur bij het ontdekken van geneesmiddelen. Liganden of fragmenten kunnen worden gecokristalliseerd of worden toegevoegd door middel van pipet of akoestische druppelejectie voordat gegevens bij kamertemperatuur worden verzameld. Een andere toepassing is om snel gegevens van vele honderden of duizenden kristallen op een zeer efficiënte manier te meten en vervolgens de DIALS¹⁷ multiplex^14-software te gebruiken om isomorfe clusters te extraheren die verschillende biologische entiteiten kunnen vertegenwoordigen of om statistisch significante verschillen vast te stellen tussen populaties van kristallen die op een andere manier zijn behandeld of zijn blootgesteld aan verschillende liganden of signalen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formulator	Formulatrix	on request	Liquid handling robot
Formulatrix imager	Formulatrix	on request	Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	Crystallisation plate
Gryphon	Art Robbins Instruments	620-1000-10	Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	Crystallisation plate
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	on request	Crystallisation robot
Rock Imager & Maker	Formualtrix	on request	Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion