Het vastleggen van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen op ruimtelijke schalen

Samenvatting

Dit protocol biedt een experimenteel kader om de fysieke impact van het cytoskelet op de nucleaire vorm en de interne membraanloze organellen in het eicelsysteem van muizen te documenteren. Het raamwerk kan worden aangepast voor gebruik in andere celtypen en contexten.

Samenvatting

Een grote uitdaging bij het begrijpen van de oorzaken van vrouwelijke onvruchtbaarheid is het ophelderen van mechanismen die de ontwikkeling van vrouwelijke geslachtscellen, oöcyten genaamd, regelen. Hun ontwikkeling wordt gekenmerkt door celgroei en daaropvolgende delingen, twee kritieke fasen die de eicel voorbereiden op fusie met sperma om de embryogenese te starten. Tijdens de groei reorganiseren eicellen hun cytoplasma om de kern in het celcentrum te positioneren, een gebeurtenis die voorspellend is voor een succesvolle ontwikkeling van eicellen bij muizen en mensen en dus voor hun embryogene potentieel. In eicellen van muizen bleek deze cytoplasmatische reorganisatie te worden aangedreven door het cytoskelet, waarvan de activiteit mechanische krachten genereert die de kern in beroering brengen, herpositioneren en binnendringen. Bijgevolg stemt deze cytoplasmatische naar nucleoplasmatische krachtoverdracht de dynamiek af van nucleaire RNA-verwerkende organellen die bekend staan als biomoleculaire condensaten. Dit protocol biedt een experimenteel raamwerk om, met een hoge temporele resolutie, de impact van het cytoskelet op de kern over ruimtelijke schalen in eicellen van muizen te documenteren. Het beschrijft de stappen en hulpmiddelen voor beeldvorming en beeldanalyse die nodig zijn om i) cytoskeletactiviteit in het cytoplasma van de eicel te evalueren, ii) op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern, en iii) de effecten ervan op de dynamiek van biomoleculair condensaat in het nucleoplasma van de eicel. Naast de eicelbiologie kunnen de hier uitgewerkte methoden worden aangepast voor gebruik in somatische cellen om op dezelfde manier cytoskelet-gebaseerde afstemming van nucleaire dynamiek op verschillende schalen aan te pakken.

Inleiding

Nucleaire positionering is essentieel voor meerdere cellulaire en ontwikkelingsfuncties 1,2,3,4,5. Vrouwelijke geslachtscellen van zoogdieren, eicellen genaamd, hermodelleren hun cytoplasma om de kern in het celcentrum te positioneren, ondanks het feit dat ze een asymmetrische verdeling in grootte ondergaan, die afhankelijk is van het daaropvolgende chromosoom dat niet gecentreerd is⁶ (Figuur 1). Deze centrering van de kern voorspelt een succesvolle eicelontwikkeling bij muizen en mensen ^7,8, en dus hun embryogene potentieel (Figuur 1).

Cytoplasmatische remodellering in eicellen van muizen wordt voornamelijk aangedreven door het actomyosine-cytoskelet⁹ (Figuur 2). Zijn activiteit genereert mechanische krachten die de kern¹⁰ in beroering brengen, herpositioneren en binnendringen (Figuur 2). Bijgevolg stemt deze cytoplasmatische krachtoverdracht van cytoplasmatisch naar nucleoplasmatisch af op de dynamiek van nucleaire boodschapper-RNA-verwerkende organellen genaamd nucleaire spikkels¹¹, een van de vele membraanloze organellen in de kern die bekend staan als biomoleculaire condensaten 12,13,14,15,16 (Figuur 2).

Live beeldvorming is doorslaggevend geweest bij het ontcijferen van de functionele implicaties van nucleaire agitatie. Films van nucleaire migratie gedurende uren, evenals films met een hoge temporele resolutie van het actinegaas en het bulkcytoplasma, droegen grotendeels bij aan de uitwerking van een theoretisch model voor nucleaire positionering, waarbij verschillende tijdschalen met elkaar werden^verbonden. Ook films met een hoge temporele resolutie van het cytoplasma, nucleaire omtrek en nucleaire componenten zoals chromatine en nucleaire condensaten, benadrukten de rol van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de kern op RNA-verwerking en genexpressie in eicellen van muizen, waarbij verschillende spatiotemporele schalen binnen de cel werden overbrugd^10,11. Al met al leverde een dergelijke schaaloverschrijdende benadering op basis van live beeldvorming de eerste reden op die cytoskeletale agitatie van de kern koppelde aan het ontwikkelingssucces van eicellen.

Het protocol biedt de beeldvormings- en beeldanalysepijplijn die wordt gebruikt om de overdracht van cytoplasmatische krachten (voornamelijk gegenereerd door F-actine en gedeeltelijk door microtubuli) naar de kern en zijn interne componenten in eicellen van muizen te bestuderen. Het resultaat van deze experimenten is om het continuüm van krachten op ruimtelijke schalen vast te leggen, van het cytoskelet in het cytoplasma tot het nucleaire binnenste via films met een hoge temporele resolutie, zoals te zien is in twee recente studies^10,11, die het verband legden tussen cytoplasmatische actieve bewegingen, fluctuaties van de nucleaire omtrek, evenals beweging en oppervlaktefluctuaties van een enkel type nucleaire biomoleculaire condensaten: nucleaire spikkels. Dezelfde benadering kan worden toegepast op andere modelsystemen waar cytoplasmatische krachten naar verwachting zullen veranderen, zoals in de context van kwaadaardige kankercellen¹⁷.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Gemeenschap en werden goedgekeurd door het Franse Ministerie van Landbouw (vergunning nr. 75-1170) en door de Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; GGO-overeenkomst nummer DUO-5291). Muizen werden in de dierenfaciliteit gehuisvest op een licht/donker-cyclus van 12 uur, met een omgevingstemperatuur van 22-24 °C en een luchtvochtigheid van 40%-50%. Muizen die hier worden gebruikt, zijn onder meer vrouwtje OF1 (Oncins France 1, 8 tot 12 weken oud) en vrouwtje C57BL/6 (10 tot 14 weken oud).

1. Verzameling en bereiding van eicellen

1. Verzamel eicellen van muizen van 8 tot 14 weken oud, zoals beschreven in¹⁸ en¹⁹.
   1. In het kort, eerst eierstokken van muizen zoals in¹⁸ in voorverwarmd (37 °C) M2+Bovine Serum Albumin (BSA) medium aangevuld met 1 μM Milrinone¹⁹, dat hervatting van de meiose in eicellen voorkomt.
   2. Prik de ovariële follikels met chirurgische naalden om groeiende eicellen uit de antrale follikels vrij te maken (einde van de eicelgroei²⁰).
   3. Verzamel eicellen van de grootte die nodig is voor experimenten (groeiende en/of volgroeide eicellen) met een micropipet die gespecialiseerd is voor het verzamelen van eicellen, voordat u ze wast en in schalen met vers medium onder minerale olie plaatst.
2. Scheid de eicellen mechanisch van de antrale folliculaire cellen door ze op en neer te pipetteren en laat ze gedurende 1 uur in de incubator bij 37 °C stabiliseren alvorens verder te gaan met de volgende experimentele stappen.
   OPMERKING: De eicellen worden tijdens alle experimentele stappen op 37 °C gehouden. Voor dit protocol werden de grootste eicellen, de volgroeide, verzameld.

2. Micro-injectie van eicellen

OPMERKING: Om op cytoskeletten gebaseerde activiteit in het cytoplasma vast te leggen, wordt helderveld live-beeldvorming gebruikt. Micro-injectie van fluorescerende markers is daarom niet nodig en het protocol kan bij stap 3 worden hervat. Om de nucleaire omtrek in beeld te brengen, werd Rango gebruikt, een sonde met YFP-tag op het N-eindpunt en een CFP-tag op het C-eindpunt^21,22. Wanneer het wordt afgebeeld in eicellen op 488 nm, labelt het de hele kern, behalve de nucleolus²³, en vertoont het een zeer scherpe nucleaire omtrek. Om nucleaire spikkels te visualiseren, werd SRSF2-GFP (NM_011358), een marker van nucleaire spikkels¹¹, gebruikt. Hetzelfde medium wordt gebruikt voor het verzamelen van eicellen, micro-injectie, complementaire RNA-translatie en beeldvorming van levende cellen.

1. Lineariseer Rango plasmide met SfiI of SRSF2-GFP plasmide met AgeI restrictie-enzymen.
2. Syntheticeer afgetopte complementaire RNA's (cRNA) met de juiste in-vitrotranscriptiekit volgens de promotor (T3 voor Rango en T7 voor SRSF2-GFP) en zuiver ze met behulp van een kolomzuiveringskit, zoals eerder beschreven²⁴.
   OPMERKING: Polyadenylaat SRSF2-GFP-RNA met behulp van een polyadenylatiekit om de cRNA-stabiliteit te verhogen. Er worden twee verschillende promotors gebruikt vanwege verschillen in de plasmide-ruggengraat.
3. Meet cRNA-concentraties met behulp van een microvolumespectrofotometer.
4. Verdun Rango cRNA tot 1000 ng/μL en SRSF2-GFP cRNA tot 600 ng/μL in dH₂O.
5. Centrifugeer cRNA-aliquot bij 4 °C gedurende ten minste 60 minuten bij 25.000 x g vóór micro-injectie.
6. Injecteer cRNA's die coderen voor YFP-Rango of SRSF2-GFP zoals beschreven in^11,25 in het cytoplasma van eicellen in 37 °C M2+ BSA+Milrinon-medium met behulp van een microinjector.
7. Incubeer eicellen gedurende ten minste 2 uur in kweekmedium bij 37 °C voor cRNA-translatie.
8. Breng de eicellen in kleine (5 μL) kweekmiddeldruppeltjes af op een weefselkweekschaal van 35 mm met een glazen bodem bedekt met minerale olie. Plaats één eicel per druppel om fotobleken van naburige eicellen te voorkomen.

3. Beeldvorming van levende cellen

OPMERKING: Levende eicellen van muizen werden onderzocht met een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een Plan-APO 40x/1,25 NA-olie-immersieobjectief, een gemotoriseerd scandek, een incubatiekamer (37 °C), een CCD-camera gekoppeld aan een filterwiel en een draaiende schijf. Beelden met een hoge temporele resolutie worden verkregen met behulp van Metamorph (hierna de beeldvormingssoftware genoemd) in de streamacquisitiemodus.

1. Open het venster Verkrijgen van de beeldbewerkingssoftware.
2. Stel de belichtingstijd in op 500 ms, het cameragebied op Full Chip en binning op 1.
3. Stel op het tabblad Verkrijgen de verlichting in voor het gewenste kanaal. Om cytoplasmatische activiteit in beeld te brengen, verlicht u eicellen met doorvallend licht. Om de kern met YFP-Rango of SRSF2-GFP in beeld te brengen, belicht u eicellen met een excitatiegolflengte van 491 nm.
4. Voor cytoplasmatisch roeren of YFP-Rango experimenten, concentreer u zich op de eicelnucleolus die gemakkelijk kan worden waargenomen met doorvallend licht (Figuur 3A). Er zal één enkel vliegtuig worden aangeschaft. Voor experimenten met nucleaire spikkels moet u zich concentreren op SRSF2-GFP-druppeltjes (Figuur 3C).
5. Stel op het tabblad Speciaal parameters in om de acquisitiesnelheid te optimaliseren, zoals hieronder.
   Camerasluiter: Open voor belichting
   Wis-modus: DUIDELIJKE PRESEQUENCE
6. Open het venster Stream Acquisition van de beeldvormingssoftware. Stel de streamingparameters in op basis van het experiment. Gebruik voor beide onderzoeken^10,11 de hieronder beschreven parameters.
   1. Stel op het tabblad Verkrijgen de volgende parameters in.
      Acquisitiemodus: Streamen naar RAM
      Aantal frames: 480 (kan worden verlaagd tot 240 frames om de beeldvormingstijd te verkorten)
      Cameraparameters: Verkrijg beelden met framesnelheid
      Aantal (Nb) frames om over te slaan: 0
   2. Stel op het tabblad Parameters van de digitale cameracontroller de volgende parameters in.
      Camerastatus: HALT
      Sluitermodus: NOOIT OPENEN
      Wis-modus: DUIDELIJKE PRESEQUENCE
      Aantal frames tot gemiddelde: 1
      OPMERKING 1: Zodra in de Stream-modus de belichtingstijd is ingesteld, wordt de filmduur bepaald door het aantal frames. Een belichtingstijd van 500 ms en 480 frames genereren bijvoorbeeld een film van 4 minuten. Tijdens het maken van een afbeelding kan een voorbeeld worden weergegeven.
7. Pas een interessegebied (ROI) rond het object aan. Het minimaliseren van het gebied van de ROI verkort de acquisitietijd.
8. Klik op Acquire in het venster Stream Acquisition om de film te starten.
9. Sla de film op als een .tif bestand aan het einde van de acquisitie.
   OPMERKING: Om nucleaire structuren te volgen tijdens films met een hoge temporele resolutie, moeten nucleaire sondes (YFP-Rango en SRSF2-GFP) een hoge signaal-ruisverhouding hebben om segmentatie van de objecten tijdens verdere stappen van beeldanalyse te vergemakkelijken. Exogene SRSF2-GFP-expressieprofielen moeten vergelijkbaar zijn met endogene immunokleuringen van nucleaire spikkels (figuur 3C-D). Veranderingen in SRSF2-GFP-expressieprofielen ten opzichte van endogene kleuring kunnen wijzen op hoge doses cRNA-injectie en -translatie²⁶ (Figuur 3C-D).

4. Beeldanalyse: Cytoplasmatisch roeren

OPMERKING: De cytoplasmatische roersel, die de intensiteit van de op actine gebaseerde cytoskeletactiviteit in eicellen weerspiegelt, wordt bepaald door beeldcorrelatieanalyses met behulp van software uit een eerdere publicatie van het lab⁹ en beschikbaar op²⁷. De software meet hoeveel pixelintensiteiten behouden blijven tussen opeenvolgende beelden. De output is het verlies van correlatie tussen afbeeldingen in de tijd, beginnend bij 1 en exponentieel afnemend met de tijd, zoals in⁹.

1. Lijn onbewerkte time-lapse-afbeeldingen (Δt=0,5 s) uit met behulp van de Fiji StackReg-plug-in (Plugins>StackReg). Om de plug-in StackReg²⁸ te installeren, schakelt u de BIG-EPFL-updatesite²⁹ in om toegang te krijgen tot de plug-in.
2. Bereken helderveldbeeldcorrelaties in 3 tot 4 cytoplasmatische regio's van ~300^μm2 door de onderstaande stappen te volgen.
   1. Snijd de regio's bij en sla ze op als afzonderlijke filmbestanden. Open het Terminal-venster.
   2. Typ eicel, druk op de spatiebalk en druk vervolgens op Enter. Er verschijnt een venster met de naam Signal and Slot. Kies de bijgesneden filmbestanden die worden geanalyseerd.
      OPMERKING: Er kunnen meerdere films tegelijk worden geselecteerd.
3. Het programma retourneert bestanden in dezelfde map als de films. Er worden drie verschillende bestanden met .csv, .eps en .xls extensies gegenereerd. Het .xls-bestand bevat de gegevens om de correlatieplots voor één regio te tekenen. Gemiddelde correlatiewaarden van verschillende regio's binnen een cel.
4. Transformeer voor visuele duidelijkheid de uiteindelijke correlatiewaarden door de waarde van elk tijdstip af te trekken van 1 om een omgekeerde exponentiële curve te verkrijgen, zoals in ¹¹.

5. Beeldanalyse: Cytoplasmatische vectorkaarten

OPMERKING: Cytoplasmatische vectorkaarten van eicellen van muizen werden gegenereerd door de plug-in Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS)³⁰ die eerder werd geïmplementeerd voor het detecteren van cytoplasmatische stromen in oöcyten van muizen³¹ op Fiji ³² en beschikbaar op ³³. De kaarten tonen de grootte en richting van de cytoplasmatische stroomsnelheid, zoals in⁹ en¹¹.

1. Converteer time-lapse-beelden met een helder veld (Δt=0,5 s) naar een 32-bits indeling.
2. Afbeeldingen opnieuw uitlijnen met de Fiji StackReg-plug-in in Plug-ins > StackReg en kies Rigid Body-transformatie .
3. Met de plug-in-stack trekt u het voortschrijdend gemiddelde jru v2 af (in Detrend-tools van de STICS-plug-inssuite), verwijdert u stationaire structuren in de film door het tijdgemiddelde beeld van de film af te trekken. Schakel de vakjes Statisch gemiddelde en Uitvoersubstapel in, selecteer Ruimtelijk gemiddelde handhaven en stel de periode in op 5.
4. Trek een ROI rond de eicel, met uitzondering van de cortex om grenseffecten van de plug-in te voorkomen.
5. Start de STICS map jru V2 plugin (in ICS tools), met subregio grootte van 32 pixels, stap grootte van 16 pixels, STICS temporele verschuiving van 3, X en Y offsets van 0, snelheid multiplier van 8, magnitude drempel van 0 en selectievakjes van Normalize Vector Length, Center Vectors, Output Velocities en Use Movie Mask.
   OPMERKING: De plug-in genereert een kaart van de eicel in .tif formaat, waarbij cytoplasmatische stromen worden weergegeven als vectoren met kleuren die stroomamplitudes aangeven, zoals in⁹ en¹¹, en een Excel-bestand met gemeten stroomsnelheden.

6. Beeldanalyse: fluctuaties in de nucleaire omtrek

OPMERKING: Fluctuaties in de nucleaire omtrek die de agitatie van het kernmembraan weerspiegelen, kunnen worden bepaald aan de hand van filmpjes van kernen die zijn gelabeld met YFP-Rango (Figuur 4A,C). Beeldanalyse voor fluctuaties in nucleaire contouren vereist Fiji en de installatie van plug-ins StackReg (schakel de BIG-EPFL-updatesite²⁹ in om toegang te krijgen tot de StackReg-plug-in), PureDenoise³⁴ en Ovocyte_nucleus. De StackReg-plug-in voert de registratie van afbeeldingen uit om te corrigeren voor mogelijke globale bewegingen. De PureDenoise-plug-in verwijdert ruis van multidimensionale afbeeldingen die zijn beschadigd door gemengde Poisson-Gaussiaanse ruis en maakt de nucleaire omtrek glad. De Ovocyte_nucleus-plug-in drempelt het signaal en vult het gat dat overeenkomt met de nucleolus om een binair kernmasker te maken, het opnieuw uit te lijnen met StackRreg en de afstand r te berekenen van het zwaartepunt van het kernmasker tot de omtrek van het masker voor alle θ-hoeken (θ° van 0° tot 360° met stappen van 1°), zoals in figuur 4. Alle codes voor deze plug-ins zijn te vinden op ³⁵.

1. Selecteer in Fiji in het menu Plug-ins > CIBB > Verlhac de optie Ovocyte Nucleus Shape.
2. Voer in het dialoogvenster de volgende selectie uit.
   1. Selecteer de map met de films die u wilt analyseren.
   2. Selecteer de θ-hoek (er kan een waarde van 1° tot 360° worden gekozen en een waarde van 1° werd gebruikt voor een optimale omtrekresolutie), de marges voor bijsnijden (5 μm wordt aanbevolen om de hele kern te behouden).
   3. Selecteer de XY-kalibratie en het tijdsinterval. Klik op OK.
      OPMERKING: De resultaten worden geleverd als .xls bestanden in een map uit in de map met de originele films. Dit bestand toont alle gemeten stralen voor elke tijd t en elke hoek θ. Een voorbeeld van een uitvoerbestand wordt gegeven in aanvullende tabel 1. De map out bevat ook een filmpje van het kernmasker.
3. Bereken met behulp van een spreadsheet de gemiddelde straal R over alle tijdpunten t voor elke gedefinieerde θ-hoek. Dit maakt het mogelijk om de gemiddelde vorm in de tijd uit te zetten (Figuur 4B). Zie het voorbeeld in aanvullende tabel 2.
4. Trek voor elke t en θ de gemiddelde straal R in de tijd af van de straal r. De variantie (r-R)² is een maat voor fluctuaties in de nucleaire enveloppe.
5. Bereken het gemiddelde van de fluctuaties voor alle tijdstippen t en alle hoeken θ voor elke kern en uiteindelijk voor alle kernen uit één voorwaarde.
   OPMERKING: Wanneer de vorm van kernen aanzienlijk wordt gewijzigd, zoals in het geval van een verstoord cytoskelet, worden kernen die zijn gelabeld met YFP-Rango op Fiji gedraaid om het gladde deel naar boven en de invaginatie naar beneden te oriënteren, voordat wordt doorgegaan met de analyse van fluctuaties in de nucleaire omtrek, zoals in¹⁰.

7. Beeldanalyse: Nucleaire spikkelbewegingen (diffuse dynamiek)

OPMERKING: Analyse van de beweging van nucleaire spikkels maakt het mogelijk om het type dynamiek (aangedreven, diffuus of beperkt) van die organellen af te leiden uit hun sporen.

1. Selecteer stream-mode beelden van eicellen die SRSF2-GFP-druppeltjes tot expressie brengen die voornamelijk in de X-Y-as bewegen.
2. Corrigeer voor het bleken van time-lapse-beelden van eicellen die SRSF2-GFP tot expressie brengen met behulp van de histogrammatchingmethode in Fiji (afbeelding > Adjust > Bleach Correction).
3. Afbeeldingen opnieuw uitlijnen met de Fiji StackReg-plug-in.
4. Volg SRSF2-GFP-druppelcentra met behulp van de Fiji Manual Tracking-plug-in (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Druk op Track toevoegen om te beginnen met volgen en druk op Track beëindigen als u klaar bent. Activeer de centreringscorrectie niet.
5. Kopieer tracks naar een spreadsheetbestand om door te gaan met temporele berekeningen van Mean Square Displacements (MSD) zoals in ¹¹, en bereken temporele MSD's van elke druppelbaan van 20 s.
6. Pas curven (msd(t) = bèta x t^α) aan met de Nelder-Mead-methode met behulp van R-software om de diffusie-exponent alfa (α) te schatten.
7. Meet de effectieve diffusiecoëfficiënt om de verschillende omstandigheden te kunnen vergelijken, aangezien de diffusie naar verwachting abnormaal zal zijn (α< 1).
8. Bereken de effectieve diffusiecoëfficiënt D_eff op basis van een lineaire fit (alpha=1) op de eerste 40 punten (20 s) van de temporele MSD-curve en normaliseer met druppelgrootte (D_eff in μm²/s x 3/2 πr in μm).

8. Beeldanalyse: fluctuaties in het oppervlak van nucleaire spikkels

OPMERKING: De evolutie van de nucleaire spikkelcontour in de tijd, een uitlezing van de actieve krachtoverdracht op deze organellen, werd gemeten met een op maat gemaakte plug-in Radioak³⁶ voor gebruik in Fiji en beschikbaar op³⁷. De plug-in extraheert de waarden van stralen van een bepaalde selectie voor alle hoeken rond het selectiecentrum. Vormvariatie in de loop van de tijd werd gemeten door de waarde van de straal te vergelijken met de gemiddelde waarde voor elke hoek. De plugin maakt het mogelijk om de vormfluctuaties te kwantificeren en biedt een optie om deze dynamiek te visualiseren. Om het te installeren, downloadt u het Radioak_.jar-bestand en plaatst u het in de map met plug-ins van Fiji. Start Fiji opnieuw op. Deze plug-in is een bijgewerkte versie van de plug-in die wordt gebruikt om bovenstaande fluctuaties in de nucleaire omtrek te analyseren en een vergelijkbare pijplijn te implementeren.

1. Selecteer in streamfilms van SRSF2-GFP-druppels grotere druppels van vergelijkbare grootte (straal ~2,5 μm).
   OPMERKING: Als de druppels te klein zijn, zal onvoldoende resolutie leiden tot afwijkende metingen van oppervlaktefluctuaties.
2. Snijd time-lapse-beelden van druppels over een periode van 15 s (Δt= 0.5 s) bij door een rechthoek rond de druppel te tekenen en Afbeelding > Bijsnijden te selecteren (Figuur 5).
3. Afbeeldingen opnieuw uitlijnen met de Fiji StackReg-plug-in in Plugins > StackReg en kies Rigid Body transformation.
4. Afbeelding vloeiender maken om ruis rond druppel te verwijderen met behulp van de optie Fiji Smoothen onder Proces.
5. Maak een binair masker van een druppel met behulp van de optie Converteren naar masker in Fiji onder Binair > verwerken. Gebruik de standaardmethode en donker als achtergrond (Figuur 5).
6. Analyseer het gegenereerde binaire druppelmasker met behulp van de optie Deeltjes analyseren in Fiji onder Analyseren, selecteer Resultaten wissen en Toevoegen aan Manager opties en sla de interesseregio (ROI's) op in de RoiManager (Meer > Opslaan) in zip-indeling om te worden gelezen door Radioak. De ROI's moeten worden opgeslagen in een map met de naam contouren in dezelfde map van de films, in bestanden met de naam imagename_UnetCortex.zip voor elke film die door Radioak kan worden gevonden.
7. Selecteer in het menu Fiji-plug-ins > CIBG > Radioak de optie Stralen ophalen om slechts één film te verwerken of Eén map uitvoeren om alle films in dezelfde map te analyseren.
   OPMERKING: Er verschijnt een venster om het hoeknummer en de schaal te selecteren. Radioak werd gelanceerd met stappen van 1° van 0° tot 360° (invoer van 360) en de radiuswaarden werden geëxtraheerd.
8. Selecteer de film of de map met de films die u wilt analyseren. De resultaten worden geleverd als .xls bestanden (één voor elke film) in een radioakres-map in de map met de originele films. Elk bestand toont alle gemeten stralen r (in μm als de schaalparameter is gevuld) voor elke keer t (in schijf) en elke hoek (in radialen; Figuur 5; zie het voorbeeld van .xls output in aanvullende tabel 3).
9. Bereken in de spreadsheet de gemiddelde straal R over alle tijdpunten t voor elke gedefinieerde hoek (zie voorbeeld in aanvullende tabel 4). Dit maakt het mogelijk om de gemiddelde vorm in de loop van de tijd uit te zetten.
10. Plot de variantie (r-R)² in μm² die overeenkomt met de maat voor fluctuaties in het druppeloppervlak.

Resultaten

Afbeeldingspanelen in figuur 3 tonen voorbeelden van een typische volgroeide eicel (figuur 3A), het nucleoplasma in een volgroeide eicel die YFP-Rango tot expressie brengt (figuur 3B), het nucleoplasma in een volgroeide eicel die een correct tot expressie brengt (linkerpaneel; Figuur 3C) of een buitensporig (rechterpaneel; Figuur 3C) dosis SRSF2-GFP-cRNA en een immunokleuring van nucleaire spikkels in een volgroeide eicel met behulp van het SC35-antilichaam (Figuur 3D). De juiste dosis SRSF2-GFP cRNA om te micro-injecteren werd gedefinieerd op basis van visuele vergelijkingen tussen expressieprofielen van SRSF2-GFP met endogene profielen van nucleaire spikkels.

Cytoplasmatische roerkrachten in eicellen, zoals aangetoond door eerder werk uit het laboratorium met behulp van STICS-vectorkaarten en beeldcorrelatieanalyse (zie⁹ en¹¹), kunnen worden verminderd door cytoskeletale verstoringen, zowel genetisch (bijv. FMN2-mutante muis) als chemisch (bijv. Cytochalasine D). STICS-kaarten van controle-eicellen geven talrijke vectoren weer, waarbij kleuren hoge stroomsnelheden aangeven, terwijl kaarten van eicellen met verstoorde cytoskeletkrachten minder vectoren weergeven, met kleuren die lage stroomsnelheden aangeven. Evenzo gaat de beeldcorrelatie zeer snel verloren in controle-eicellen in vergelijking met eicellen met verstoorde cytoskeletkrachten. Dit is waarneembaar op correlatiecurves, met een snellere afname van de curve voor controle-eicellen in vergelijking met oöcyten met verstoorde cytoskeletkrachten⁹ of een snellere toename wanneer de curve wordt omgekeerd¹¹.

Cytoskeletale krachten brengen de kern en zijn inwendige organellen in beroering, in het bijzonder nucleaire condensaten zoals nucleaire spikkels^10,11. In figuur 4A is de kern van controle-eicellen onderhevig aan belangrijke perifere fluctuaties, die zichtbaar zijn met behulp van de kernsonde YFP-Rango. De vorm van de kern in eicellen met verstoorde krachten in het cytoskelet is stabiel in de loop van de tijd (figuur 4C). Analyse van fluctuaties in de nucleaire omtrek is essentieel om de agitatie nauwkeurig te kwantificeren. Door de variantie van de afstand van het kernzwaartepunt tot de periferie te bepalen, (r-R)² (Figuur 4B), konden fluctuaties worden gekwantificeerd, waaruit bleek dat nucleaire agitatie 6 keer hoger is in controle-eicellen dan in eicellen met verstoorde cytoskeletkrachten¹⁰. In figuur 5A-B worden nucleaire spikkels (SRSF2-GFP⁺ druppeltjes) getoond in controle- en verstoorde contexten van cytoplasmatische krachten met hoge temporele resolutie. In controles fluctueert het druppeloppervlak significant meer dan druppeloppervlakken in eicellen met verstoorde cytoplasmatische krachten, die kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van de Radioak^32-plug-in. Visueel geven groene en rode kleuren (Radioak-uitvoer te zien op de onderste afbeeldingen van figuur 5A-B) hoeken aan waar de plug-in oppervlakteveranderingen tussen opeenvolgende afbeeldingen heeft gedetecteerd en wit duidt op een gebrek aan oppervlakteveranderingen.

Figuur 1: Illustratie van late oögenese en vroege embryogenese van muizen. Illustratie van kerncentrering die optreedt bij late eicelgroei, chromosoom-off-centrering die optreedt tijdens eiceldeling en vroege stappen (1-cel- en 2-celstadia) van embryogenese. Het vrouwelijk genoom (eicelkern en vrouwelijke pronucleus) is roze, de mannelijke pronucleus is blauw. De embryokernen (na fusie van oudergenomen) zijn paars. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Illustratie van cytoplasmatische en nucleaire remodellering op verschillende schalen in groeiende eicellen van muizen. Deze figuur vat de belangrijkste bevindingen van ^9,10,11 samen. Illustratie van actomyosine-gebaseerde remodellering van het cytoplasma, nucleaire agitatie en functionele nucleaire biomoleculaire condensaatremodellering over spatiotemporele schalen. De schaaloverschrijdende hermodellering van nucleaire spikkels verbetert biomoleculaire reacties die verband houden met hun functie (d.w.z. splitsing van pre-mRNA). Merk op dat dit protocol de beoordeling van nucleaire agitatie alleen toestaat op ruimtelijke schalen, maar niet op temporele schalen, aangezien alle beeldvorming wordt gedaan met dezelfde temporele resolutie van 0,5 s tussen beeldframes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbeeldbeelden van de volgroeide eicel en het nucleoplasma. (A) Helderveldbeeld van een volgroeide eicel met chromatine (cyaan) dat de nucleolus omringt. Een witte gestippelde cirkel omlijnt de kern. (B) Levende eicelkern die YFP-Rango tot expressie brengt; Let op de afwezigheid van fluorescentie in de nucleolus. (C) Voorbeeld van een levende eicelkern die SRSF2-GFP tot expressie brengt na micro-injectie van de juiste doses cRNA (linkerpaneel) of hoge doses cRNA (rechterpaneel); Let op de gecondenseerde (druppel) en opgeloste fasen aan de linkerkant en hun afwezigheid in de toestand aan de rechterkant. (D) immunokleuring van nucleaire spikkels in een gefixeerde eicel; let op het endogene expressieprofiel dat vergelijkbaar is met dat in C (linkerpaneel). Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Plug-in-uitgangen van controle- en verstoorde nucleaire omtrekfluctuaties. (A) Time-lapse van een eicelkern die YFP-Rango tot expressie brengt (boven) en het bijbehorende binaire masker gegenereerd door de Ovocyte_nucleus-plug-in (onder). (B) Principe van metingen van fluctuaties in de kernomtrek in de tijd en in een bepaalde richting. Richtingen worden gedefinieerd door een draaihoek θ van 1° in stappen van 0° tot 360°. Twee representatieve vormen op t=0 s (geel) en t=135 s (paars) zijn weergegeven. De blauwe vorm komt overeen met de gemiddelde vorm in de loop van de tijd. (C) Nucleaire omtrekfluctuaties van een kern in een eicel met verminderde krachten in het cytoskelet als gevolg van verstoring van zowel F-actine (FMN2-mutante muis) als microtubuli (behandeling met nocodazol; zoals in¹⁰). Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Plug-in-uitgangen van controle en verstoorde fluctuaties in het druppeloppervlak. (A) Uitsnede van een controle SRSF2-GFP nucleaire druppel afgebeeld met 500 ms per frame en weergegeven in Ice Look Up Table (LUT) (boven); binair masker van dezelfde druppel gegenereerd door Fiji (midden); en Radioak-plug-in-uitgangen na analyse van oppervlaktefluctuaties van de druppel (onderkant), waarbij groen en rood hoeken aangeven waar de plug-in oppervlakteveranderingen tussen opeenvolgende afbeeldingen heeft gedetecteerd en wit een gebrek aan oppervlakteveranderingen aangeeft. (B) Oppervlaktefluctuaties van een kerndruppel in eicellen met verminderde cytoskeletkrachten als gevolg van verstoring van zowel F-actine als microtubuli (zoals in¹¹). Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Voorbeeld van Ovocyte_nucleus output van plug-inanalyses. Dezelfde kern geanalyseerd als die in figuur 4A. Theta (θ) is de hoek in graden en t1 tot t600 komt overeen met het framenummer, dat in tijd kan worden omgerekend. De stralen zijn in μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Voorbeeldspreadsheet die wordt gebruikt voor de berekening van fluctuaties in de nucleaire omtrek. Dezelfde kern geanalyseerd als die in figuur 4A. Theta (θ) is de hoek in graden en t1 tot t600 komt overeen met het framenummer, dat in tijd kan worden omgerekend. Tab Raw en gemiddelde: De stralen zijn in μm. Tab r-R: De r-R afstanden zijn in μm. Tabel (r-R)²: De fluctuatiewaarden zijn in μm². Tabs x en y komen overeen met de Cartesiaanse coördinaten van de stralen van de Raw en gemiddelde tab. Ze maken het mogelijk om de gemiddelde vorm van de kern in de loop van de tijd te tekenen op het tabblad Gemiddelde vorm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Voorbeeld van de analyse-output van de Radioak-plug-in. Dezelfde druppel geanalyseerd als die in figuur 5A. De gemeten stralen op verschillende tijdstippen en hoeken worden weergegeven. De stralen zijn in μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 4: Voorbeeldspreadsheet die wordt gebruikt voor de berekening van fluctuaties in het oppervlak van kerndruppels. Dezelfde druppel geanalyseerd als die in figuur 5A. Theta (θ) is de hoek in graden en t1 tot t600 komt overeen met het framenummer, dat in tijd kan worden omgerekend. Tab Raw en gemiddelde: De stralen zijn in μm. Tab r-R: De r-R afstanden zijn in μm. Tabel (r-R)²: De fluctuatiewaarden zijn in μm². Tabs x en y komen overeen met de Cartesiaanse coördinaten van de stralen van de Raw en gemiddelde tab. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De belangrijkste stappen in dit protocol zijn onder meer de juiste micro-injectie van eicellen zonder hun overleving of normale functie te beïnvloeden ^9,10,11, evenals het micro-injecteren van vooraf gedefinieerde hoeveelheden cRNA die een correcte visualisatie van relevante structuren, zoals nucleaire spikkels, mogelijk zouden maken.

Het leggen van het verband tussen cytoplasmatische en (intra)-nucleaire dynamiek is essentieel bij het bestuderen van hoe het cytoskelet de kern of het inwendige ervan in beroering brengt. Dit protocol, met kleine aanpassingen, maakt dat mogelijk door cytoplasmatische roerintensiteiten te correleren met nucleaire YFP-Rango of SRSF2-GFP druppeldynamiek (zoals in¹¹). Om verder te gaan, moeten eicellen eerst gedurende 120 s worden gefilmd in helderveldmodus om cytoplasmatisch roeren vast te leggen, voordat ze onmiddellijk gedurende 120 s worden gefilmd met een laser van 491 nm om nucleaire omtrek of druppeldynamiek vast te leggen. In het geval van nucleaire SRSF2-GFP-druppeltjes kan de correlatie eenvoudig worden beoordeeld door hun effectieve diffusiecoëfficiënten (zie stap 7 in dit protocol) te vergelijken met de omgekeerde maximale intensiteitswaarden van cytoplasmatisch roeren verkregen met behulp van beeldcorrelatieanalyses (zie stap 4 in dit protocol). Een ander belangrijk punt is de grootte van de condensaten die worden gekozen voor analyses van fluctuaties in het druppeloppervlak. Druppels met een vergelijkbare diameter moeten worden geselecteerd voor vergelijkende analyses om vertekening te voorkomen, aangezien de grootte de intensiteit van oppervlaktefluctuaties moduleert.

Er zijn enkele beperkingen voor dit protocol. Analyses van fluctuaties in de nucleaire omtrek zijn gebaseerd op volledige intranucleaire kleuring, zoals YFP-Rango of NLS-GFP. Voor analyses op nucleaire spikkels kan micro-injectie van buitensporige hoeveelheden SRSF2-GFP-cRNA leiden tot schijnbare veranderingen in de fasescheidingseigenschappen van deze condensaatmarker (Figuur 3C), zoals eerder door anderen is beoordeeld²⁶. Het is daarom van cruciaal belang om na te gaan of exogene eiwitexpressieprofielen vergelijkbaar zijn met de endogene. Bovendien moeten relatief kleine druppeltjes (straal van <2 μm) worden uitgesloten van pijpleidingen voor de analyse van oppervlaktefluctuaties vanwege beperkingen van de ruimtelijke resolutie met de hier gedefinieerde instrumenten. Dit resolutieprobleem kan meestal worden opgelost door het gebruik van meer oplossende microscopen, die bijvoorbeeld nodig kunnen zijn om oppervlaktefluctuaties van kleinere condensaten in de eicelkern of in de aanzienlijk kleinere kern van somatische cellen te onderzoeken.

Over het algemeen maakt dit protocol het mogelijk om actine en microtubuli cytoskelet-gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen over schalen te vangen. In het bijzonder maakt het de documentatie mogelijk van op cytoskelet gebaseerde mobilisatie van het cytoplasma, fluctuaties in de nucleaire omtrek, samen met vloeistofachtige nucleaire spikkelverplaatsingen en oppervlaktefluctuaties. Hoewel sommige studies in andere celtypen sommige van deze zaken aanpakken 38,39,40 via verschillende protocollen van verschillende complexiteit op individuele ruimtelijke schalen, biedt dit eenvoudige protocol de hulpmiddelen die nodig zijn om de genoemde cellulaire dynamiek over meerdere schalen in een enkele werkpijplijn voor het eerst aan te pakken. Bovendien maken de gegevens die uit deze benadering worden gegenereerd, aangevuld met biofysische modellering zoals in^10,11, een minimaal invasieve evaluatie mogelijk van: i) veranderingen in de nucleaire mechanica¹⁰; ii) de overdracht van op het cytoskelet gebaseerde actieve krachten in het cytoplasma naar condensaten in de kern¹¹; en iii) de dissipatie van deze actieve energie over verschillende cellulaire compartimenten^10,11. Belangrijk is dat dit protocol veelzijdig is, omdat het niet alleen kan worden aangepast aan andere nucleaire condensaten zoals de nucleolus²³, maar ook aan andere celtypen zoals kankercellen, waar veranderingen in zowel cytoskeletaal als nucleair condensaatgedrag werden gedocumenteerd^17,41.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		versie 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 en C57BL/6 muizen	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antilichaam	Abcam	ab11826	Nucleair vlek antilichaam; muis IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		gespecialiseerd voor oöcytverzameling
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostaatkamer	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows