Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65978

⸱

9 februari 2024

 ,  , 
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

In dit artikel

Samenvatting

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI) maken een robuuste analyse op populatieniveau van sensorische neuronsignalering mogelijk. Hier hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld die in vivo GECI-visualisatie van de activiteit van trigeminusganglia-neuronen bij ratten mogelijk maakt.

Samenvatting

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) maken beeldvormingstechnieken mogelijk om veranderingen in intracellulair calcium in gerichte celpopulaties te volgen. Hun grote signaal-ruisverhouding maakt GECI's een krachtig hulpmiddel voor het detecteren van stimulus-opgewekte activiteit in sensorische neuronen. GECI's vergemakkelijken analyse op populatieniveau van stimuluscodering met het aantal neuronen dat tegelijkertijd kan worden bestudeerd. Deze populatiecodering wordt het meest geschikt in vivo gedaan. Dorsale wortelganglia (DRG), die de soma van sensorische neuronen huisvesten die somatische en viscerale structuren onder de nek innerveren, worden het meest gebruikt voor in vivo beeldvorming omdat deze structuren relatief gemakkelijk toegankelijk zijn. Meer recentelijk werd deze techniek bij muizen gebruikt om sensorische neuronen in het trigeminusganglion (TG) te bestuderen die orale en craniofaciale structuren innerveren. Er zijn veel redenen om TG naast DRG te bestuderen, waaronder de lange lijst van pijnsyndromen die specifiek zijn voor orale en craniofaciale structuren en die veranderingen in sensorische neuronactiviteit lijken te weerspiegelen, zoals trigeminusneuralgie. Muizen worden het meest gebruikt in de studie van DRG- en TG-neuronen vanwege de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Echter, met verschillen in grootte, gebruiksgemak en potentieel belangrijke soortverschillen, zijn er redenen om TG-neuronen bij ratten te bestuderen in plaats van bij muizen. Zo ontwikkelden we een aanpak voor het in vivo in beeld brengen van TG-neuronen van ratten. We injecteerden neonatale pups (p2) intraperitoneaal met een AAV die codeert voor GCaMP6s, wat resulteerde in >90% infectie van zowel TG- als DRG-neuronen. TG werd gevisualiseerd bij de volwassene na craniotomie en decorticatie, en veranderingen in GCaMP6s-fluorescentie werden gecontroleerd in TG-neuronen na stimulatie van mandibulaire en maxillaire gebieden van het gezicht. We bevestigden dat verhogingen van fluorescentie door stimulus werden opgeroepen met perifere zenuwblokkade. Hoewel deze benadering veel potentiële toepassingen heeft, gebruiken we het om de subpopulatie(s) van TG-neuronen te karakteriseren die zijn veranderd na perifere zenuwbeschadiging.

Inleiding

Somatosensatie, de neurale codering van mechanische, thermische en chemische stimuli die inwerken op de huid of andere lichaamsstructuren, waaronder spieren, botten en ingewanden, begint met activiteit in primaire afferente neuronen die deze structuren innerveren1. Elektrofysiologische benaderingen op basis van één eenheid hebben een schat aan informatie opgeleverd over de afferente subtypes die bij dit proces betrokken zijn, evenals hoe hun stimulus-responseigenschappen in de loop van de tijd kunnen veranderen 1,2,3. Hoewel er sterk bewijs blijft ter ondersteuning van de gelabelde lijntheorie, die suggereert dat specifieke sensorische modaliteiten worden overgebracht door specifieke subpopulatie(s) van neuronen, suggereert het vermogen van veel subpopulaties van neuronen om te reageren op dezelfde soorten mechanische, thermische en chemische stimuli dat de meerderheid van de somatosensorische stimuli wordt gecodeerd door meerdere subpopulaties van neuronen4, 5. okt. Een beter begrip van somatosensatie zal dus alleen komen met de mogelijkheid om de activiteit van 10's, zo niet honderden neuronen tegelijkertijd te bestuderen.

Vooruitgang in optische benaderingen met de relatief recente komst van confocale en vervolgens multifoton- en digitale beeldvormingstechnieken hebben de mogelijkheid vergemakkelijkt om relatief niet-invasieve analyses op populatieniveau van neuronale activiteit uit te voeren 6,7. Een van de laatste hindernissen bij de toepassing van deze technologie is de ontwikkeling van hulpmiddelen om de optische beoordeling van neurale activiteit mogelijk te maken. Gezien de snelheid van een actiepotentiaal die in minder dan een milliseconde kan beginnen en eindigen, zou een spanningsgevoelige kleurstof met het vermogen om veranderingen in membraanpotentiaal te volgen met de snelheid van een actiepotentiaal het ideale hulpmiddel voor dit doel zijn. Maar hoewel er enorme vooruitgang is geboekt op dit gebied 7,8,9,10, is de signaal-ruisverhouding voor veel van deze kleurstoffen nog steeds niet hoog genoeg om een populatieanalyse van honderden neuronen op celniveau mogelijk te maken. Als alternatieve benadering hebben onderzoekers zich gericht op het monitoren van veranderingen in de intracellulaire Ca2+-concentratie ([Ca2+]i). De beperkingen van deze strategie zijn vanaf het begin duidelijk geweest en omvatten het feit dat een toename van [Ca2+]i een indirecte maat is voor neurale activiteit11; dat een toename van [Ca2+]i kan optreden onafhankelijk van de instroom van Ca2+ die gepaard gaat met de activering van spanningsafhankelijke Ca2+-kanalen (VGCC's)12,13; dat de omvang en de duur van een Ca2+ transiënt kunnen worden gecontroleerd door processen die onafhankelijk zijn van VGCC-activiteit 11,12,14; en dat het tijdsverloop van Ca2+ transiënten veel groter is dan dat van een actiepotentiaal15. Desalniettemin zijn er een aantal belangrijke voordelen verbonden aan het gebruik van Ca2+ als indirecte maat voor neurale activiteit. Niet de minste hiervan is de signaal-ruisverhouding die wordt geassocieerd met de meeste Ca2+-indicatoren, die zowel de omvang van de verandering in intracellulaire Ca2+ weerspiegelt als het feit dat het signaal voortkomt uit de driedimensionale ruimte van het cytosol in plaats van de tweedimensionale ruimte van het celmembraan. Bovendien is het met de ontwikkeling van genetisch gecodeerde Ca2+-indicatoren (GECI's) mogelijk om te profiteren van genetische strategieën om de expressie van de Ca2+-indicatoren in specifieke subpopulaties van cellen te stimuleren, waardoor analyses op populatieniveau in intacte preparaten worden vergemakkelijkt (bijv.zie 16).

Gezien het aantal genetische hulpmiddelen dat nu beschikbaar is in muizen, zou het geen verrassing moeten zijn dat GECI's het meest op grote schaal zijn gebruikt bij deze soort. Muislijnen met constitutieve GECI-expressie in subpopulaties van sensorische neuronen zijn ontwikkeld 7,16,17. Met de ontwikkeling van muislijnen die recombinasen tot expressie brengen in specifieke celtypen, is het mogelijk om nog geavanceerdere strategieën te gebruiken om GECI-expressie te beheersen15. Hoewel deze instrumenten steeds krachtiger worden, zijn er een aantal redenen waarom andere soorten, zoals ratten, geschikter zouden kunnen zijn voor sommige experimentele vragen. Deze omvatten het grotere formaat, waardoor een aantal experimentele manipulaties mogelijk zijn die moeilijk, zo niet onmogelijk zijn bij de kleinere muis; het gemak waarmee ratten kunnen worden getraind in relatief complexe gedragstaken; en op zijn minst enig bewijs dat biofysische eigenschappen en expressiepatronen van verschillende ionkanalen in sensorische neuronen van ratten meer lijken op die waargenomen in menselijke sensorische neuronen dan dezelfde kanalen in muizen ten opzichte van de mens.

Hoewel de transductie van somatosensorische stimuli over het algemeen plaatsvindt in de perifere uiteinden van primaire afferenten, moet het actiepotentiaal dat in de periferie wordt geïnitieerd, door de structuur gaan die primaire afferente somata herbergt, ook wel dorsale wortel (DRG) of trigeminus (TG) ganglia genoemd voordat het het centrale zenuwstelsel bereikt19. Hoewel er aanwijzingen zijn dat niet elke actiepotentiaal die zich voortplant langs een primair afferent axon het cellichaamzal binnendringen 20, een gevolg van het feit dat de primaire afferente somata verbonden zijn met het belangrijkste afferente axon via een T-splitsing19, lijken de meeste actiepotentialen die in de periferie worden geïnitieerd de soma21 binnen te dringen. Dit levert drie experimentele voordelen op bij het gebruik van GECI's om populatiecodering in primaire afferenten te beoordelen: de grote omvang van het cellichaam ten opzichte van de axonen verhoogt het signaal tot ruis verder bij gebruik van [Ca2+]i als een indirecte maat voor afferente activiteit; de DRG zijn over het algemeen gemakkelijk toegankelijk; En het beoordelen van activiteit op een plaats die ruimtelijk ver verwijderd is van de afferente terminals, minimaliseert de potentiële impact van de operatie die nodig is om de ganglia bloot te leggen op de stimulus-responseigenschappen van de afferente terminals. Omdat TG zich echter onder de hersenen (of boven het palet) bevindt, zijn ze veel moeilijker toegankelijk dan DRG. Bovendien, hoewel er veel overeenkomsten zijn tussen DRG- en TG-neuronen, is er ook een groeiende lijst met verschillen. Dit omvat de ruwweg somatotopische organisatie van neuronen in de TG22, unieke geïnnerveerde structuren, verschillende centrale terminale beëindigingspatronen 23,24,25,26, en nu een groeiende lijst van verschillen in zowel genexpressie27,28 als functionele receptorexpressie29. Bovendien, omdat we geïnteresseerd zijn in de identificatie van perifere mechanismen van pijn, suggereert het relatief grote aantal pijnsyndromen die uniek lijken te zijn voor het trigeminussysteem (bijv. migraine, trigeminusneuralgie, brandende mondsyndroom) die afwijkende activiteit in primaire afferenten lijken te omvatten 30,31,32, dat de TG rechtstreeks moet worden bestudeerd.

Dus, terwijl stimulus-respons eigenschappen van TG-neuronen zijn bestudeerd met GECI's in de muis16, omdat de hierboven genoemde redenen suggereren dat de rat een geschiktere soort kan zijn om een verscheidenheid aan experimentele vragen te beantwoorden, was het doel van de huidige studie om een benadering te ontwikkelen om GECI's te gebruiken om TG-neuronen in de rat te bestuderen. Om dit te bereiken, gebruikten we een virale benadering om de expressie van de GECI GCaMP6's in het perifere zenuwstelsel te stimuleren. Vervolgens hebben we de voorhersenen verwijderd om toegang te krijgen tot de TG. Ten slotte werden mechanische en thermische stimuli op het gezicht aangebracht, terwijl neuronale reacties werden beoordeeld onder fluorescerende microscopie. Samen ondersteunen deze gegevens een rol voor het gebruik van de rat om veranderingen in de TG onder veel staten te onderzoeken, waardoor de toolkit wordt uitgebreid voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in sensorische codering in het trigeminussysteem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met het gebruik van dieren in onderzoek werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen die zijn opgesteld door de National Institutes of Health en de International Association for the Study of Pain en zijn goedgekeurd door de University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protocol #22051100). Aan het einde van elk experiment werden ratten geëuthanaseerd via exanguinatie met hartperfusie van ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), een benadering die is goedgekeurd door de American Veterinary Medical Association en de Universiteit van Pittsburgh IACUC.

1. GCaMP-inductie

  1. Bestel tijdzwangere Sprague Dawley-ratten zodat pups op het juiste moment na de geboorte kunnen worden geïnjecteerd.
  2. Spuit de handschoenen in met 70% EtOH voordat u elke rattenpup aanraakt. Dit zal de moeder ervan weerhouden de jongen te kannibaliseren.
  3. Wattenstaafje rattenpups (P1-2) met 70% EtOH en verdoven op ijs gedurende 3 min.
  4. Injecteer 15 μL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) intraperitoneaal met behulp van een 25 μL steriele, gasdichte Hamilton-spuit.

2. Blootstellingschirurgie aan trigeminusganglion

  1. Intraperitonese cocktail (55 mg/kg ketamine, 5,5 mg/kg xylazine, 1 mg/kg acepromazine) op basis van lichaamsgewicht toedienen aan ratten van 6-8 weken oud (ongeveer 150-200 g).
    OPMERKING: Dit is over het algemeen voldoende om een chirurgisch anesthesievlak te behouden, zoals beoordeeld door de afwezigheid van een terugtrekkingsreflex op schadelijke kneep van een achterpoot. Vul echter aan met isofluraan via een neuskegel als de dieren licht worden.
  2. Eenmaal volledig verdoofd, scheert u het haar en de snorharen van het hoofd en gezicht.
  3. Monteer de rat op een stereotaxisch frame met oorbalken en plaats er een verwarmingskussen (~37 oC) onder om de lichaamstemperatuur op peil te houden.
  4. Bewaak vitale functies (hartslag, ademhalingsfrequentie, zuurstofverzadiging in het bloed) met een muisoximeter of vergelijkbaar.
    OPMERKING: De lichaamstemperatuur wordt gecontroleerd door een rectale sonde en op peil gehouden door ratten op een feedbackgestuurde circulerende waterdeken te plaatsen.
  5. Plaats gaas gedrenkt in ijskoude zoutoplossing op het hoofd om de bloedvaten te vernauwen om bloedingen te minimaliseren. Maak met een scalpel maat 15 een incisie in de middellijn van de huid en spier over de schedel.
  6. Gebruik stompe dissectie van de huid en spieren om de schedel bloot te leggen.
  7. Gebruik een 1/4 ronde boor om de schedelkap voorzichtig te perforeren om de voorhersenen bloot te leggen. Gebruik vervolgens rongeurs (2,5 mm cup) om voorzichtig door de schedel te snijden.
  8. Maak met een scalpel maat 15 een incisie in de hersenen (Bregma: -3,80) en de bulbus olfactorius.
    OPMERKING: Als u meer caudaal voorbij dit punt snijdt, zal dit leiden tot de dood van ratten
  9. Gebruik een spatel om de dura voorzichtig los te koppelen van de schedel en til voorzichtig de afgehakte hersenen op om de TG en de basis van de schedel te onthullen.
    OPMERKING: Aanvullend gebruik van ijskoude zoutoplossing perfusie tijdens de extractie zal het bloeden minimaliseren en het volgende dissectieveld optimaliseren.
  10. Gebruik een cauterisatiepen om eventuele bloedingen als gevolg van de extractie te stelpen.
    OPMERKING: Het doorsnijden van de dura zal resulteren in onvermijdelijke bloedingen. Het is het beste om ijskoude aCSF (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glucose, 2,5 mM CaCl2) te bereiden om de schedelholte te baden om de bloedvaten te helpen vernauwen met behoud van de neuronale gezondheid.

3. GCaMP6s-beeldvorming

OPMERKING: Gezien de grootte en dichtheid van deze neuronen, zal het gebruikte beeldvormings- en data-acquisitiesysteem (objectief, microscoop, lichtbron, camera) het aantal gevisualiseerde GECI+ -cellen bepalen. De lichtbron, het objectief en de camera bepalen ook de parameters die worden gebruikt voor beeldacquisitie, waaronder de belichtingstijd en de beeldopnamesnelheid. Hoewel multifoton- en confocale technieken kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de parameters van het experiment, kan epifluorescentiemicroscopie voldoende zijn om veel cellen op te lossen. Elk beeldacquisitiepakket kan worden gebruikt. Idealiter is de stimulustoepassing tijdslot met het softwarepakket voor beeldacquisitie.

  1. Plaats de schedelholte onder het objectief en breng de TG scherp in beeld met behulp van zichtbaar licht.
  2. De excitatiegolflengte van GCaMP6s is 496 nm en de emissiegolflengte is 513 nm; gebruik dus de juiste dichroïsche en filterkubussen om GCaMP+- cellen te lokaliseren. Pas de focus aan om het gebied van de ganglia te lokaliseren en op te lossen waarin neuronen reageren op stimuli die worden toegepast op het receptieve interessegebied.
  3. Gebruik een 10x objectief om visualisaties mogelijk te maken van de meeste neuronen in de TG die reageren op mechanische stimuli die worden toegepast op een gebied van 1cm2 van het gezicht16. Gebruik een 20x droog objectief met een lange werkafstand (10,8 mm) om de resolutie te verhogen.
  4. Gebruik acquisitiesoftware (bijv. Metamorph) om fluorescentiegegevens te verzamelen in de loop van de tijd en als reactie op stimulustoepassing.
    1. Om fotobleking van de neuronen tot een minimum te beperken, moet u een zo kort mogelijke belichtingstijd gebruiken om de basislijn en de opgewekte toename van de fluorescentie te detecteren. Met het 20x, 0,40 NA-luchtobjectief, een 120 W kwikhalogenidelichtbron en een complementaire metaaloxide-halfgeleidercamera (CMOS) die in de huidige studie wordt gebruikt, wordt een belichtingstijd van 300 ms en een beeldacquisitiesnelheid van 3 Hz stabiele basislijnopnamen verkregen gedurende >90 minuten.
      OPMERKING: 1) Deze parameters voor beeldacquisitie moeten empirisch worden bepaald. 2) Mechanisch (borstel, punctaat, trilling, knijpen), thermisch (warmte en koude) en chemisch (capsaïcine, menthol, ontstekingsmediatoren) kunnen op het receptieve veld worden aangebracht. Een relatief goedkope subjectieve benadering is om de stimuli met de hand toe te passen. Er worden echter objectievere en reproduceerbare benaderingen aanbevolen, waarbij feedbackgestuurde actuatoren kunnen worden gebruikt voor herhaalde toepassing bij een bekende kracht. Hoewel Peltier-apparaten met feedbackregeling nuttig zijn voor gecontroleerde verwarming en koeling, zijn ze niet ideaal voor de thermische stimulatie van een gebogen gezicht. Feedbackgestuurde infraroodlichtbronnen zijn een alternatief voor verwarming, en koude spray is een minder dan ideaal alternatief voor koeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Omdat we eerder succes hebben gehad met het AAV9-serotype voor de infectie van sensorische neuronen van ratten15, gebruikten we dit serotype voor de expressie van GCaMP6's in TG-neuronen van ratten. Daarom hebben we eerst geprobeerd de sensorische neuroninfectie-efficiëntie van AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) te beoordelen toen dit virus werd toegediend aan neonatale rattenpups20. Dit virus maakt gebruik van de CAG-promotor, die een hoge mate van genexpressie stimul...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier demonstreren we een snelle, niet-invasieve manier om een GECI-rat te genereren voor beeldvorming van de TG. We kozen voor een CAG-promotor om hoge niveaus van genexpressie te stimuleren en te behouden. Hoewel eerdere studies suggereren dat andere AAV-serotypen de genexpressie in DRG-neuronen efficiënt kunnen stimuleren39, zijn onze resultaten consistent met een recente studie met intraperitoneale injectie van AAV bij pasgeborenen32, wat aangeeft dat het AAV9-serotype z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Dr. Gold ontving subsidie van Grunenthal tijdens de ontwikkeling van dit preparaat. Er was geen overlap in de focus van de Grunenthal-studie en de voorbereiding die in dit manuscript wordt beschreven. Geen van de andere auteurs heeft andere potentiële belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

We willen Drs. Kathy Albers en Brian Davis bedanken voor het gebruik van hun Leica Microscope and Metamorph programma, Charles Warwick voor zijn hulp bij het bouwen van ons thermische Peltier-apparaat, en Dr. Raymond Sekula voor zijn hulp bij het oplossen van problemen met de chirurgische voorbereiding. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) en R01NS122784 (MSG en RS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 Addgene100844-AAV9AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleateCovetrus11695-0095-510 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injectionAKORN Animal Health23076-35-920 mg/mL
CTR5500 Electronics boxLeica11 888 820Voeding
Cutwell burr drill bitRansom & Randolph¼ rond
DM 6000 FSLeica11 888 928Basisstandaard
EL6000LeicaEL6000Lichtbron met 120 W kwiklamp
ForcepsFST11252-00Dumont Nr. 05
Friedman rongeursFST16000-142,5 mm cupsgrootte
Friedman-Pearson rongeursFST16021-141 mm cupsgrootte
Verwarmingskussen (Temperatuurtherapiekussen)STRYKER8002-062-022
KetaminehydrochlorideCovetrus1695-0703-1100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40LeicaMRH0010520x objectief, 0,4 NA10,8 mm WD
Power handle high-temp cautery penBovieHIT1handbediende Change-A-Tip cautery pen
Prime 95BPhotometricsPrime 95BCMOS-camera
SalineFisher ScientificNC02917990,9% steriele zoutoplossing
ScalpelbladFisher Scientific22-079-701maat 15 wegwerpblad
SpatelkaBRI48-1460herpspatel
SpringschaarFST91500-09Student Vannas, 5 mm snijkant
SpringschaarFST15012-12Noyes, 14 mm snijkant
STP6000 Smart touch panelLeica11 501 255Bedieningspaneel
SpuitHamilton8020125 μL Model 1702 Luer Tip spuit
WaterverwarmingAdroitHTP-1500

Referenties

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826(2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199(2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535(2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007(2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959(2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25(2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526(2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84(2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

In vivo beeldvorminggenetisch gecodeerde calciumindicatorenneuropathische pijnratmodelGCaMP6s fluorescentiemechanische stimulatieperifere zenuwbeschadiging
In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.