Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor het opstellen van een EVLP-model bij ratten en tonen we het ontstekingsprofiel dat verband houdt met de geperfuseerde longen. Het doel is om kennis en ervaringen over het EVLP-model van ratten te verspreiden, waardoor een integraal begrip mogelijk wordt van de biologische reacties die met die revolutionaire techniek gepaard gaan.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Opstelling van een ex vivo longperfusiemodel bij ratten voor translationele inzichten in longtransplantatie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Sinds de oprichting van longtransplantatie als therapeutische strategie voor gevorderde longziekten, wordt de wetenschappelijke gemeenschap geconfronteerd met het probleem van een laag aantal longen dat levensvatbaar wordt geacht voor het donatieproces. In de afgelopen decennia is dit scenario echter positief veranderd, gezien de ontwikkeling van ex vivo longperfusie (EVLP) als een strategie voor het evalueren en reconditioneren van marginale longen. De oprichting van EVLP in grote transplantatiecentra heeft geleid tot een toename van het aantal longtransplantaties, zowel door de diagnostische nauwkeurigheid van de longfunctie te vergroten als door een effectief platform te vormen voor de reconditionering van longtransplantaten. In deze context, geconfronteerd met ethische en logistieke kwesties, evenals in de studie van immunologische factoren die verband houden met longtransplantatie, is de ontwikkeling van EVLP-modellen bij knaagdieren belangrijk geworden, gezien hun betrouwbaarheid, de mogelijkheid van genetische manipulatie en lagere kosten. Dit artikel beschrijft een protocol voor het opstellen van een EVLP-model bij ratten en toont het ontstekingsprofiel dat verband houdt met de geperfuseerde longen. Dit zal helpen bij het verspreiden van kennis over het EVLP-model van ratten, waardoor ons begrip van de biologische reacties die verband houden met die revolutionaire techniek wordt bevorderd.
Inleiding
Longtransplantatie is erkend als een therapeutische strategie voor ziekten in het eindstadium met verbeteringen in chirurgische methoden en immunosuppressie in de afgelopen decennia. Ondanks de grote vraag is het aantal aanvaardbare overleden longdonoren lager dan voor andere solide organen, wat overeenkomt met het lagere aantal uitgevoerde longtransplantaties 1,2,3. Om het tekort aan donoren aan te pakken, heeft de medische gemeenschap de criteria voor longdonatie uitgebreid, waardoor organen die voorheen als niet-levensvatbaar werden beschouwd, potentiële organen voor transplantatie werden. De uitgebreide criteria vereisen echter verschillende inspanningen voor een beter begrip en interventie met het oog op de mogelijke systemische gevolgen van het gedoneerde orgaan. Ex vivo longperfusie (EVLP) kwam naar voren als een techniek die zorgt voor normotherm longbehoud, beoordeling van longfuncties en reconditionering van longen die voorheen onhaalbaar werden geacht voor het donatieproces 4,5,6.
Gezien het groeiende aantal longtransplantaties sinds de oprichting van EVLP in grote transplantatiecentra, zijn strategieën voor longbehoud en -herstel steeds meer onderzocht. In die zin is de ontwikkeling van EVLP-modellen bij knaagdieren, geconfronteerd met ethische en logistieke kwesties, evenals bij de studie van immunologische factoren die verband houden met longtransplantatie, belangrijk geworden, gezien hun betrouwbaarheid, de mogelijkheid van genetische manipulatie en lagere kosten 7,8,9. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen om een EVLP-model bij ratten op te stellen en het ontstekingsprofiel van de geperfuseerde longen aan te tonen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met het Animal Use Protocol dat is goedgekeurd door de Animal Care Committee van het University Health Network. Mannelijke Lewis-ratten (255-330 g) kregen ad libitum toegang tot voedsel en water. Vervolgens werden ze gehouden in een gecontroleerde omgeving (18-22 °C) met een dag-nachtcyclus van 12 uur. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, oplossingen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Initialisatie van het ex vivo longperfusiesysteem
- Zorg ervoor dat alle transducers zijn aangesloten op de apparatuur van het geïsoleerde perfusieorgaan en het data-acquisitiesysteem (Figuur 1). Open vervolgens de software voor gegevensverzameling.
- Vul vóór perfusie het EVLP-circuit met 150 ml Steen-oplossing aangevuld met 1.000 USP-eenheden natriumheparine, 50 mg cefazoline en 50 mg methylprednisolon.
- Stel het warmwaterbad in op 20 °C. Begin met het circuleren van warm water om het hele EVLP-systeem op te warmen.
2. Procedure voor het verkrijgen van donorlongen
- Verdoof de rat met een intraperitoneale injectie van ketamine (50 mg/kg) en xylazine (5 mg/kg) of volgens de lokale praktijk. Bevestig de juiste diepte van de anesthesie door de teenknijpreflex te controleren.
- Voer orotracheale intubatie uit (14 G intraveneuze katheter). Sluit na intubatie de tracheale tube aan op het ventilatiesysteem voor kleine dieren. Ventileer de rat met een ademvolume van 10 ml/kg, een snelheid van 60 ademhalingen/min, een ingeademde zuurstoffractie (FiO2) van 0,5 en een positieve eindexpiratoire druk (PEEP) van 2 cmH2O.
- Zet de rat in rugligging.
- Ga met behulp van een geschikte schaar en tang de peritoneale holte binnen en draag de incisie craniaal, voer een mediane laparotomie uit en injecteer natriumheparine (400 USP-eenheden) in de poortader.
- Ga vervolgens de borstholte binnen via het xyphoid-proces. Voer de sternotomie uit met de craniale resectie van het borstbeen en een voorzichtige radiale opening van het middenrif, om de long niet te beschadigen.
- Om het hart- en longblok op te halen, maakt u een incisie in de inferieure vena cava (IVC) en langs de top van het linkerhart.
- Voer met een microschaar een anterieure incisie uit in het uitstroomkanaal van het rechterventrikel. Breng vervolgens een intraveneuze katheter van 18 g in de longstam in en spoel de longen met 20 ml oplossing met een laag kaliumgehalte (LPD) die 10 μg/ml prostaglandine E1 bevat.
- Klem onmiddellijk na het spoelen het onderste derde deel van de luchtpijp aan het einde van de inspiratie vast om de longen in een opgeblazen toestand te houden.
- Oogst het hart- en longblok en plaats het in LPD-oplossing voor opslag.
OPMERKING: Het longtransplantaat kan worden bewaard bij temperaturen en verschillende tijdsintervallen, afhankelijk van het onderzoeksdoel. Hier tonen we representatieve resultaten van longen die verschillende lengtes van koude ischemische tijd (CIT) op ijs hebben ondergaan.
3. Ex vivo longperfusieprocedure
- Plaats een 0 zijden ligatuur onder de hoofdlongslagader (PA) en rond de ventrikels, en knoop deze vast om canulatie te vergemakkelijken.
- Sluit de PA-canule aan op de instroomleiding van het EVLP-systeem en start de peristaltische pomp met 10% van de onderhoudsstroom, waardoor eventuele lucht in de PA-canule kan worden verwijderd.
- Plaats en bevestig de instroomcanule in de hoofd-PA (OD: 2,0 mm/kopdiameter: 2,5 mm), gevolgd door de drainagecanule vanaf de top van het hart in het linker atrium (LA-Head Diameter: 4,0 mm) via de mitralisklep voor daaropvolgende perfusie. Gebruik een tang om de mitralisklep te verwijden, waardoor de canulatie wordt vergemakkelijkt.
- Maak een klein gaatje in de luchtpijp en breng de tracheacanule in (OD: 2,0 mm/L: 14 mm). Sluit hem vervolgens aan op de ventilatieleiding van het systeem.
- Sluit de LA-canule aan op de uitstroomleiding van het systeem.
- OPMERKING: We stellen 10% van de onderhoudsstroom in als het initiëren van de perfusie. Om te voorkomen dat er luchtbellen in de longen worden ingebracht, moet u ervoor zorgen dat de bellenvanger gevuld is.
- Verhoog geleidelijk het debiet, de perfusie om 20% van het hartminuutvolume (CO) te bereiken.
OPMERKING: Om beide longen te perfuseren, gebruikten we een geschatte CO van 75 ml/min voor ratten van 250 g10,11. Het debiet van perfusie werd geleidelijk verhoogd tot 1 uur om het beoogde debiet te bereiken volgens ons klinisch EVLP-protocol12. De perfusieparameters zijn samengevat in tabel 113. - Verwijder de tracheale klem 20 minuten na het begin van de perfusie en start de longbeademing, gevolgd door het starten van de stroom EVLP-gas (8% CO2, 6% O2, 86% N2) om de instroom perfusate PCO2 tussen 35 en 45 mmHg te behouden.
OPMERKING: De ventilatieparameters zijn samengevat in tabel 113.
4. Parameters en monsterbeheer
- Registreer elk uur tijdens EVLP in realtime de dynamische longcompliantie en pulmonale vasculaire weerstand (PVR).
OPMERKING: 5 minuten voor de fysiologische beoordelingen moeten de longen worden uitgezet tot een opblaasdruk. - Neem elk uur perfusaatmonsters uit de monsterpoort en vries deze snel in vloeibare stikstof in voor verdere analyses.
OPMERKING: Daarnaast voeren we 5 minuten voor de beoordeling een rekruteringsmanoeuvre uit (tot 20 cmH2O), waarna we perfusaten nemen voor bloedgasanalyses om pH, PCO2, PO2, elektrolyten, glucose en lactaat te meten. - Stop de perfusie en klem de luchtpijp vast om de longen in een opgeblazen toestand te houden. Isoleer vervolgens longmonsters en vries ze snel in vloeibare stikstof in of plaats ze in fixeeroplossingen voor verder onderzoek.
OPMERKING: Hier werden de longen gedurende 4 uur geperfundeerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Alle longen met CIT variërend van 20 minuten tot 18 uur konden gedurende 4 uur worden geperfundeerd (Figuur 2)13. De therapietrouw was in de meeste groepen stabiel, met uitzondering van de 18-uurs CIT, die geleidelijk afnam gedurende de perfusieperiode van 4 uur (Figuur 2A). Desondanks werden er geen significante verschillen in vasculaire weerstand, oxygenatie van het longtransplantaat en glucosespiegels ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie beschreef de noodzakelijke stappen voor het opstellen van een EVLP-protocol voor ratten. Hier laten we zien dat donorlongen gedurende 4 uur kunnen worden geperfundeerd na koude statische bewaring tot 18 uur bij 4 °C. Dit werd aangetoond door longcompliantie, pulmonale vasculaire weerstand, perfusaat glucose/lactaatconcentratie en P/F-ratio te beoordelen.
De opkomst van het EVLP-platform als een belangrijk hulpmiddel bij de evaluatie van de longfun...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
MC is aandeelhouder van Traferox Technologies Inc en consultant voor Lung Bioengineering Inc. MC ontvangt onderzoeksondersteuning van Beyond Air Inc. en Synklino. De auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen zijn geweest die de uitkomst in dit artikel zouden kunnen hebben beïnvloed.
Dankbetuigingen
Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com (bevestiging van publicatie- en licentierechten [Overeenkomst: BT25KGSKWF]).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 14 G intraveneuze katheter | BD | 381167 | Orotracheale intubatie |
| 16 G intraveneuze katheter | BD | 381157 | Katheter voor het spoelen van de long |
| 2-0 Naalddraad Sofsilk | Covidien | S-305 | Fixatie van trachea-buis |
| 3-0 Naalddraad Sofsilk | Covidien | S303 | Fixatie van arteriële en atriale canules |
| IPL-2 Core Isolated Perfused Lung System voor ratten | Harvard Apparatus | 734276 | Ex Vivo Long Perfusie (EVLP) systeem |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 440894 | Sedatie/anesthesie |
| Grote longslagader canule | Harvard Apparatus | 73-0711 | |
| Linker atriale canule | Harvard Apparatus | 73-0712 | |
| Laag kaliummandeeldextraan glucose oplossing (Perfadex) | XVIVO | 19811 | Conservatieoplossing |
| Methylprednisolon natriumsuccinaat (SOLU-MEDROL) | Pfizer | 14705 | Ontstekingsremmer |
| Prostaglandine E1 (Prostin VR) | Pfizer | RX297945 | |
| Kleine dierendemper (Model 683) | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
| Natriumheparine | Leo Pharma | 453811 | |
| Steen oplossing | XVIVO | 19004 | Gebufferde extracellulaire oplossing voor het perfunderen van longen tijdens EVLP |
| Sugita Aneur clip curv | Mizuho | 07-940-86 | Trachealklem |
| Tracheal canule | Harvard Apparatus | 73-3384 | |
| Xylazin (Rompun) | Bayer Healthcare | 2169592 | Sedatie/anesthesie |
Referenties
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report — 2021; Focus on recipient characteristics. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 40 (10), 1060-1072 (2021).
- Meyer, K. C. Recent advances in lung transplantation. F1000Research. 7, 1684(2018).
- Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2018 Annual Data Report: Lung. American Journal of Transplantation. 20, 427-508 (2020).
- Chaney, J., Suzuki, Y., Cantu, E., van Berkel, V. Lung donor selection criteria. Journal of thoracic disease. 6 (8), 1032-1038 (2014).
- Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 13 (11), 6602-6617 (2021).
- Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool. Clinics in Chest Medicine. 44 (1), 77-83 (2023).
- Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: a review of translational interspecies models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (6), L932-L940 (2020).
- Noda, K., Philips, B. J., Atale, N., Sanchez, P. G. Endothelial protection in lung grafts through heparanase inhibition during ex vivo lung perfusion in rats. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 42 (6), 697-706 (2023).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Malik, A. B., Kaplan, J. E., Saba, T. M. Reference sample method for cardiac output and regional blood flow determinations in the rat. Journal of Applied Physiology. 40 (3), 472-475 (1976).
- Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).
- Soares, P. R. O., et al. Comparison between perfadex and locally manufactured low-potassium dextran solution for pulmonary preservation in an ex vivo isolated lung perfusion model. Transplantation Proceedings. 43 (1), 84-88 (2011).
- Pêgo-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).
- Yamanashi, K., et al. Reduction of donor mononuclear phagocytes with clodronate-liposome during ex lung perfusion attenuates ischemia-reperfusion injury. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 165 (4), e181-e203 (2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
