Laboratoriumkonijnen trainen om routinematige houderijprocedures te verfijnen

Samenvatting

Trainingsprotocollen met positieve bekrachtiging voor routinematige houderijprocedures bij konijnen werden ontwikkeld en bleken succesvol te zijn, aangezien de konijnen op betrouwbare wijze het getrainde gedrag vertoonden tijdens het wekelijkse algemene onderzoek. Het oppakken van de konijnen met de transportbox was minder aversief dan de conventionele hanteringstechniek.

Samenvatting

Niet-aversieve hanterings- en trainingstechnieken voor proefdieren zijn nodig om experimentele en routinematige houderijprocedures te vergemakkelijken en zowel het dierenwelzijn als de wetenschappelijke kwaliteit te verbeteren. Clickertraining werd gebruikt om trainingsprotocollen voor konijnen te ontwikkelen om stressvolle routinematige houderijprocedures te verfijnen die gewoonlijk worden geassocieerd met tillen (d.w.z. van de vloer worden opgepakt) / in bedwang houden (d.w.z. in de armen van een mens worden gehouden). Dertien vrouwelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden gedurende drie weken getraind. Alle konijnen leerden het vooraf gedefinieerde doelgedrag: ze volgden de richtstok, sprongen op de weegschaal, gingen een transportbox binnen en steigerden terwijl ze hun voorpoten op de hand van de trainer legden. Bovendien sprongen tien dieren van de vloer op de schoot van de zittende trainer en lieten de trainer hun poten van het oppervlak tillen terwijl ze op de schoot van de trainer zaten. Voor sommige personen moesten de protocollen worden aangepast door extra tussenstappen. Aan het einde van de training vertoonden de konijnen betrouwbaar het verwachte doelgedrag, zelfs na korte en lange trainingspauzes. Op enkele uitzonderingen na kon een andere bekende persoon dan de trainer het doelgedrag van de konijnen ontlokken (generalisatie), hoewel verdere sessies nodig waren voor generalisatie. In de vrijwillige benaderingstest gaven de konijnen de voorkeur aan interactie met de trainer in de^1e proef, maar brachten ze evenveel tijd door met een onbekende persoon als met de trainer in de^2e proef. De gedragsobservaties suggereerden dat het oppakken van de konijnen met de transportbox, zoals beschreven in het protocol, in plaats van ze met het nekvel in bedwang te houden en ze aan de arm op te tillen, minder aversief was. Al met al waren de trainingsprotocollen haalbaar en kunnen ze dienen als verfijningsstrategie in proefdierfaciliteiten. In het belang van het dierenwelzijn moeten de trainingsprotocollen waar mogelijk worden toegepast.

Inleiding

Tussen 2015 en 2019 werden in de Europese Unie (en Noorwegen) meer dan 49 miljoen dieren gebruikt voor wetenschappelijke doeleinden; 1.745.037 (3,5%) van hen waren konijnen¹. Konijnen worden meestal gebruikt voor regelgevend onderzoek (bijv. kwaliteitscontrole, toxiciteit en andere veiligheidstests, waaronder farmacologie) en routinematige productie van biologische stoffen (bijv. producten op basis van bloed)². Hoewel er inspanningen worden geleverd om dierproeven te vervangen door proefdiervrije methoden, is het gebruik van dieren voor sommige van deze doeleinden nog steeds noodzakelijk. Wanneer een dierproef niet kan worden vervangen, is het van cruciaal belang om het aantal dieren te verminderen en de experimentele, huisvestings- en houderijomstandigheden te verfijnen om het lijden tot een minimum te beperken. Russel en Burch beschreven deze strategie in 1959 als het 3V-beginsel (vervangen, verminderen, verfijnen^{) 3 en} werd in 2010 geïmplementeerd in Richtlijn 2010/63/EU betreffende de bescherming van proefdieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt⁴. De rol van verfijning, ook wel 'Assepoester' van de 3 V's⁵ genoemd, wint aan belang. Hoewel vervanging en vermindering langetermijnstrategieën zijn voor het uiteindelijke doel van de richtlijn om dierproeven volledig te vervangen, maakt verfijning de onmiddellijke verbetering van het dierenwelzijn mogelijk⁵, wat op zijn beurt het potentieel heeft om de wetenschappelijke kwaliteit te verbeteren⁶. Essentiële onderdelen van verfijning zijn de omgang met en training van dieren, zoals vermeld in bijlage III bij Richtlijn 2010/63/EU. De richtlijn bepaalt dat dierenfaciliteiten gewennings- en trainingsprogramma's voor de proefdieren moeten ontwerpen die zijn aangepast aan de soort, de procedure en het project⁴. Bijlage A van ETS nr. 123 suggereert dat het personeel van de proefdieren tijd besteedt aan "het praten met, hanteren, trainen en verzorgen van dieren"⁷.

Sommige hanteringsprocedures veroorzaken stress, vooral voor terrestrische prooidieren zoals konijnen. Voorbeelden zijn in het nauw worden gedreven, in bedwang worden gehouden (d.w.z. vastgegrepen door een mens, in de armen van een mens worden gehouden of geïmmobiliseerd door een apparaat) en worden opgetild (d.w.z. van de vloer worden opgepakt) voor een gezondheidsinspectie of experimentele procedures⁸. Uit een onderzoek naar konijnen bleek dat 57-61% van hen moeite had om ^{9,10 euro op} te tillen en dat sommigen zelfs angstgerelateerde agressie vertoonden (d.w.z. bijten)¹¹. Dit benadrukt de noodzaak van zachte hantering en trainingstechnieken. Het is al aangetoond voor andere kleine zoogdieren zoals muizen dat zachte hanteringstechnieken angst verminderen¹². Bovendien vermindert zachte behandeling in combinatie met training stress, angst en depressie-achtig gedrag bij muizen¹³. Bij resusapen en chimpansees werden fysiologische maatregelen met betrekking tot stress minder beïnvloed wanneer ze eerder waren getraind in een procedure ^14,15. Aangenomen mag worden dat als een dier ervoor kan kiezen om vrijwillig deel te nemen aan de training, het actief kan deelnemen aan de situatie en deze kan beheersen, wat het welzijn van het dier verbetert en ook kan bijdragen aan robuustere en betrouwbaardere wetenschappelijke gegevens¹⁶.

Veel trainingsprocedures voor dieren zijn gebaseerd op operante conditioneringsprincipes, met name het gebruik van positieve bekrachtiging en vormgeving 17,18,19. Operante conditionering vereist dat een dier gedrag uitlokt dat vervolgens kan worden verhoogd of verlaagd²⁰. Er zijn vier veelvoorkomende onvoorziene omstandigheden die worden gebruikt om operante conditionering te beschrijven: positieve en negatieve bekrachtiging, evenals positieve en negatieve bestraffing^21,22. Bij konijnen wordt positieve bestraffing gebruikt wanneer een persoon een dier benadert (ongewenste stimulus) om het weg te bewegen van of naar een bepaalde locatie²³. In de context van het hanteren van een konijn op de onderzoekstafel is een voorbeeld van negatieve bekrachtiging het wegnemen van druk (ongewenste prikkel) op het lichaam van het konijn wanneer het konijn stil blijft staan; Een voorbeeld van negatieve straf is het intrekken van een voedselbeloning (gewenste stimulus) wanneer het konijn begint te worstelen. Noch positieve/negatieve bestraffing, noch negatieve bekrachtiging worden aanbevolen bij de training van dieren. Straf veroorzaakt negatieve emotionele effecten²⁴, zoals angst zoals aangetoond bij honden²⁵. In plaats daarvan zou positieve bekrachtiging de voorkeursmethode moeten zijn bij het trainen van dieren^25,26. Positieve bekrachtigingstraining (PRT) betekent dat een gewenste stimulus (bijv. een voedselbeloning) wordt gegeven nadat het dier een gewenst gedrag heeft vertoond, wat de kans vergroot dat het dier het gewenste gedrag in de toekomst opnieuw zal vertonen²⁷. Bij PRT gaat het vaak om de toepassing van een geconditioneerde bekrachtiger. Een geconditioneerde bekrachtiger (secundaire bekrachtiger) is meestal een neutrale stimulus zoals een geluid, die het dier leert associëren met een ongeconditioneerde bekrachtiger (primaire bekrachtiger, bijv. voedselbeloning)²⁸. Nadat het dier het gewenste gedrag vertoont, wordt direct de geconditioneerde bekrachtiger gepresenteerd, gevolgd door de presentatie van de voedselbeloning²⁶. Een bekend voorbeeld van PRT is clickertraining, waarbij een clicker wordt gebruikt voor het produceren van een klik als secundaire bekrachtiger²⁶.

De training moet voorspelbare patronen volgen, wat wordt bereikt door een trainingsprotocol te ontwerpen. Het trainingsprotocol beschrijft hoe een doelgedrag stap voor stap kan worden bereikt (d.w.z. gedragsvorming), terwijl elke stap wordt gedefinieerd door objectieve criteria en gemakkelijk moet kunnen worden bereikt²⁶. Als de training volgens een bepaald protocol verloopt, is het mogelijk dat de proefdiermedewerkers afwisselen met het trainen van de dieren. Belangrijk om op te merken is dat het personeel de principes van leer- en trainingstechnieken moet kennen om ze correct toe te passen²⁶. Dierentraining omvat vaak gedragsvorming. Gedragsvorming met de hand werd in het begin van de jaren 1940 voor het eerst bewust gebruikt door Skinner en collega's²⁹. In eerder werk daarentegen concentreerde Skinner zich eerder op "het aanbrengen van kleine veranderingen in de fysieke omgeving om een programma van opeenvolgende benadering te implementeren"²⁹. In een artikel gepubliceerd in Scientific American, legde hij uit dat het versterken van een gedrag de kans vergroot dat het gedrag wordt herhaald, wat "het mogelijk maakt om het gedrag van een dier vorm te geven bijna zoals een beeldhouwer een klomp klei vormt"³⁰. Sindsdien is vormgeven steeds belangrijker geworden voor dieren in gevangenschap 29,30,31,32. Voor het reproduceren en verbeteren van vormgevingsprotocollen is het cruciaal om de protocollen op een systematische en objectieve manier te beoordelen 33,34,35,36.

Een recent gepubliceerde systematische review en meta-analyse door Pfaller-Sadovsky et al. ontdekte dat geconditioneerde versterking het vaakst werd bestudeerd bij paarden en honden, hoewel katten, runderen, vissen, geiten en niet-menselijke primaten ook werden onderzocht³⁷. In de proefdierkunde wordt PRT veel gebruikt voor niet-menselijke primaten 38,39,40 en honden ^41,42. Bovendien werden varkens⁴³, geiten⁴⁴ en zelfs kleine zoogdieren, zoals muizen¹³ en ratten 45,46,47, met succes getraind met behulp van een clicker in de laboratoriumomgeving. Voor zover de auteurs weten, is de introductie van PRT voor laboratoriumkonijnen nog maar zelden gerapporteerd⁴⁸; Bestaande peer-reviewed literatuur die enkele decennia geleden is gepubliceerd, is verouderd en voldoet niet aan de criteria van modern ethisch onderzoek. Hoewel weinig niet-peer-reviewed stukjes informatie suggereren dat konijnen met succes kunnen worden getraind met behulp van PRT⁴⁹, lijkt er een gebrek aan kennis te zijn over geschikte trainingsprotocollen voor konijnen die zijn gehuisvest in proefdierfaciliteiten. De onderliggende redenen kunnen variëren. Het is bijvoorbeeld mogelijk dat de gebruikte trainingstechnieken niet in detail worden beschreven in onderzoeksartikelen of dat er gegevens worden gegenereerd voor regelgevend onderzoek en daarom niet worden gepubliceerd. Bovendien zijn konijnen misschien niet de belangrijkste focus van verfijningsonderzoek, aangezien andere soorten zoals muizen en ratten vaker in onderzoek worden gebruikt. Omdat konijnen stress en ongemak heel goed kunnen maskeren, kan hun negatieve emotionele toestand bij het hanteren vaak niet worden herkend. De grootte van een konijn stelt mensen in staat om deze dieren in bedwang te houden voor procedures, terwijl andere soorten, zoals niet-menselijke primaten, niet met de handen mogen worden vastgehouden voor soortgelijke ingrepen zonder ernstig gewond te raken⁵⁰. Deze feiten mogen echter niet leiden tot de ontwikkeling of het delen van PRT-protocollen voor laboratoriumkonijnen.

Wat de mogelijke voordelen van PRT betreft, werden de eerste pogingen ondernomen om de kennislacune op te vullen over geschikte trainingsprotocollen voor laboratoriumkonijnen. Om routineprocedures zoals hantering, gezondheidsinspecties en weging te vergemakkelijken, werden trainingsprotocollen ontwikkeld en werd de haalbaarheid ervan voor vrouwelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen geëvalueerd. Er werden vergelijkingen uitgevoerd om na te gaan of de alternatieve hanteringstechniek die in de trainingsprotocollen werd beschreven minder aversief was dan de conventionele hanteringstechniek en of de trainingsprotocollen kunnen dienen als verfijningsmaatregelen. Figuur 1 toont het tijdschema van het huidige onderzoek.

Onderhoud van dieren

Dertien vrouwelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden verkregen uit commerciële bronnen (aankomst in de dierenfaciliteit op de leeftijd van ongeveer zeven weken). De dieren waren vrij van alle virale, bacteriële en parasitaire pathogenen die worden vermeld in de FELASA-aanbevelingen⁵¹. Beschermende kleding en uitrusting (handschoenen, maskers, haarnetjes) werden gedragen bij het uitvoeren van de stappen van dit protocol. Een groep van zes en een groep van zeven dieren werden samen gehuisvest in een vloerhok van respectievelijk 2,8 m × 2,8 m (vloerhuisvesting). De vloer was bedekt met fijn en schilferig houten beddengoed (autoclaaf). Bovendien lagen nestmateriaal en papierwol verspreid over het strooisel. Drie plastic huisjes met elk twee openingen (37 cm × 60 cm; hoogte 30 cm) en een plastic tunnel (lengte: 58 cm; diameter: 16 cm) dienden als schuilplaatsen. Daarnaast werden verrijkingsartikelen verstrekt, zoals houten knaagblokken, hooi- en wilgenballen en snackballen gevuld met voedselkorrels, die eruit vallen bij het verplaatsen van de bal. De konijnen hadden vrije toegang tot kraanwater, gepelleteerd voedsel en geautoclaveerd hooi, evenals stro. Meer informatie over voedingsmiddelen en verrijkingsartikelen vindt u in de Materiaaltabel. De dierenkamer werd op donderdag schoongemaakt.

De konijnen werden gehouden onder standaardomstandigheden (kamertemperatuur en relatieve vochtigheid als gemiddelde ± standaarddeviatie: 20,3 ± 0,4 °C en 50 ± 5 %) op een licht-donkercyclus van 12:12 uur (kunstlicht met extra daglichtinval). Een radio werd 30 minuten voor het begin van de lichtfase gedurende ongeveer 8 uur aangezet om de konijnen te laten wennen aan omgevingsgeluiden.

Protocol

Het onderhoud van de dieren werd goedgekeurd door het Berlijnse staatsagentschap ("Landesamt für Gesundheit und Soziales", vergunningsnummer: ZH3 - Duits Federaal Instituut voor Risicobeoordeling, Berlijn). De trainingsprotocollen zijn ontwikkeld in het kader van de routinematige veehouderij om procedures zoals hantering, gezondheidsinspectie en weging te verfijnen. Aangezien de trainingsprotocollen geen pijn, lijden of schade veroorzaakten en alle observaties werden gedaan in het kader van de routinematige veehouderij, werd deze studie niet beschouwd als een dierproef volgens de Europese wetgeving.

1. Algemene opleidingseisen

OPMERKING: De volgende punten zijn over het algemeen vereist voor het trainen van dieren, onafhankelijk van dit protocol.

1. Markeer de dieren duidelijk ter identificatie.
2. Zorg voor een beloning van hoge kwaliteit, bijvoorbeeld zeer smakelijk eten.
3. Definieer het trainingsplan met alle stappen in de richting van het doelgedrag, d.w.z. het gewenste gedrag dat het dier moet vertonen.
   OPMERKING: Het doelgedrag wordt stap voor stap vormgegeven, terwijl elke stap wordt gedefinieerd door objectieve criteria en gemakkelijk moet kunnen worden bereikt.
4. Bepaal of de dieren erin moeten slagen om 80% of 100% van de trainingsstappen uit te voeren voordat u doorgaat met de volgende stap.
5. Bereid de documentatie voor (bijv. Aanvullende tabel 1).
6. Train de dieren niet als ze haast hebben en zorg voor maniertjes, stemgeluid en bewegingssnelheid, d.w.z. praat zacht en kalm, beweeg langzaam en voorspelbaar.
7. Test de stappen die in de vorige training zijn getraind.
8. Train een dier niet als de algemene gezondheidstoestand van het dier is aangetast en/of het dier niet geïnteresseerd is in interactie met de trainer.

2. Trainingsroutines voor dit protocol

OPMERKING: De volgende trainingsroutines zijn gedefinieerd voor het huidige protocol.

1. Stel de trainingsbak in in de dierenkamer/ren (Figuur 2) en plaats, afhankelijk van het te trainen doelgedrag, de weegschaal of de transportbox (vloer 30 cm × 50 cm; deur 27 cm × 25,5; met een opening in het deksel 16 cm × 39 cm) in de bak.
2. Plaats de weegschaal en transportbox buiten de arena om de konijnen vertrouwd te maken met deze nieuwe objecten voordat het doelgedrag "wegen" en "transportbox" wordt getraind.
3. Voor doelgedrag (zie stap 6-9) leidt u het konijn naar de trainingsarena, zoals beschreven in stap 5.7.
4. Ga op de grond zitten of gebruik een lage kruk/trede om op te zitten in de trainingsarena.
5. Train het doelgedrag achter elkaar, in de volgorde zoals beschreven in het protocol en niet tegelijkertijd. Maak een uitzondering als een dier er niet in slaagt om op twee opeenvolgende dagen een stap van een doelgedrag te leren - in dit geval train je tegelijkertijd het volgende doelgedrag. Verander de volgorde van doelgedrag als dit het trainingsproces voor een individu vergemakkelijkt.
6. Na gewenning en introductie van de clicker, begin je met het trainen van alle dieren op de 1e^{stap van} het doelgedrag "het doel volgen" (d.w.z. de bal aan het einde van de doelstok wordt gedefinieerd als doel). Houd er rekening mee dat ze, afhankelijk van hun individuele prestaties, op deze dag verschillende trainingsstappen kunnen bereiken. Vervolg de training op basis van de individuele vooruitgang van de dieren in de volgende dagen.
7. Plan een trainingssessie (bijvoorbeeld ongeveer 30 minuten voor een groep met zes tot zeven dieren) voor elke werkdag van de week.
   OPMERKING: De trainingssessie begint wanneer de trainer in de dierenkamer/het hok is en klaar is om met de training te beginnen. Een sessie eindigt wanneer ofwel geen van de konijnen (meer) deelneemt aan de training of alle konijnen de laatste trainingsstap van het te trainen doelgedrag hebben bereikt. Begin elke trainingssessie met de laatste succesvolle stap van het protocol. Een sessie bestaat uit minimaal één of meerdere proeven per dier.
8. Begin een proef door het dier te vragen een bepaalde trainingsstap uit te voeren (d.w.z. stap 3.1 nadat het konijn heeft geleerd het doel met de neus/mond aan te raken) en beëindig de proef wanneer het dier niet (meer) deelneemt aan de training of het dier de laatste trainingsstap van het te trainen doelgedrag heeft bereikt. Aan het einde van de training open je de trainingsbak en leid je het konijn de arena uit; Houd vervolgens de doelstok (met het doel naar het plafond gericht) en de beloningsschaal voor de kist.
9. Plan de training voordat u gaat voeren, schoonmaken, behandelingen of experimentele procedures.
10. Gebruik een beloningskom met een geïntegreerde clicker (Figuur 3, aanvullend coderingsbestand 1) en, voor sommige doelgedragingen, een extra doelstok.
11. Vul de beloningsschaal met smakelijk voedsel, bijv. zonnebloempitten en foerageertraktaties op basis van granen.
    LET OP: Konijnen zijn folivoren en deze beloningsvoorbeelden zijn niet optimaal; Vanwege de hygiënebeperkingen in de proefdierfaciliteit waren zij echter de best beschikbare alternatieven voor deze dieren. Indien mogelijk verdient verse kruiden de voorkeur als voedselbeloning. Merk op dat een beloning alleen een beloning is als het konijn er echt de voorkeur aan geeft.
12. Zorg ervoor dat u de beloningsschaal altijd in dezelfde positie houdt, bijvoorbeeld voor de kist, en begin de beloningsschaal pas na de klik naar de konijnen te verplaatsen. Behalve het doelgedrag "steigeren" en "op schoot springen", houd je de doelstok in de ene hand en de beloningsschaal in de andere hand.
13. Presenteer de beloning op de plek waar de neus/mond van het konijn zat toen het gewenste gedrag correct werd getoond.
14. Zorg ervoor dat het konijn slechts een kleine hoeveelheid voedsel eet bij het uitreiken van de beloning.
15. Als een konijn in een blok van vijf pogingen minstens vier keer het gewenste gedrag vertoont (80% slagingspercentage), ga dan verder met de volgende stap. Als een dier niet in staat is om de volgende stap uit te voeren (d.w.z. de stap niet meer dan één keer uit te voeren), keer dan terug naar de vorige stap van het protocol. Als het nodig was om terug te keren naar een vorige stap of als een konijn niet deelneemt aan de training, herzie dan de trainingsprotocollen (bijv. definieer kleinere trainingsstappen), kies een andere (smakelijkere) voedselbeloning of controleer de trainingsvaardigheden van de trainer.
16. Als een konijn de laatste trainingsstap van een doelgedrag correct uitvoert, maak dan de trainingssessies voor dit konijn op dezelfde dag af.
17. Druk het documentatieblad (aanvullend bestand 1), de gedetailleerde trainingsprotocollen en de vereenvoudigde trainingsprotocollen (aanvullend bestand 2) af en bevestig ze aan een klembord of open ze op een tablet. Noteer aan de hand van het documentatieblad de trainingsstappen die de individuele dieren in elke sessie hebben doorlopen.

3. Contextuele conditionering/gewenning

OPMERKING: De contextuele conditionerings-/gewenningssessies worden dagelijks uitgevoerd door de trainer en dierverzorgers gedurende ongeveer 15 minuten per konijnengroep gedurende een periode van vijf opeenvolgende dagen (maandag tot en met vrijdag).

1. Praat zachtjes tegen de konijnen.
2. Bied smakelijke voedselbeloningen aan.
   OPMERKING: Houd er rekening mee dat plotselinge veranderingen in het dieet spijsverteringsproblemen bij konijnen kunnen veroorzaken. Introduceer daarom langzaam de novel food-beloning.
3. Verplaats de beloningsschaal gevuld met smakelijk voedsel naar de konijnen en laat ze ervan eten.
4. Raak de konijnen voorzichtig aan rond de nek, schouders, rug en romp zonder ze in bedwang te houden.

4. Introductie van de clicker

LET OP: Doelgedrag: Benader de trainer en eet de beloning uit de kom na de click. Het doel is dat het konijn de voedselbeloning associeert met de klik, d.w.z. dat het konijn de voedselbeloning na de klik eet.

1. Laat het konijn naderen.
2. Klik één keer en verplaats de beloningsschaal naar het konijn (aangeduid als click and treat of C en T).
3. Herhaal stap 4.2 tien keer. Als je voor de tiende keer klikt, wacht dan een seconde voordat de beloning wordt gepresenteerd en observeer het gedrag van het konijn.
   OPMERKING: Als het dier de beloning direct na de klik zoekt, kan worden aangenomen dat de conditionering van de secundaire bekrachtiger is geslaagd.
4. Herhaal de stappen 4.1.-4.3. Als een konijn de volgende dag het voer niet heeft gegeten, beloon dan na de klik voor minstens acht keer.

5. Het doel volgen

OPMERKING: Doelgedrag: Volg en raak het doel aan met neus/mond. Het doelgedrag in de secties 6-9 zijn aanpassingen van het doelgedrag dat in sectie 5 wordt gepresenteerd.

1. Plaats het doel dicht bij de neus/mond van het konijn.
   OPMERKING: De bal aan het uiteinde van de doelstok wordt gedefinieerd als doel.
   1. C en T wanneer het konijn het doel raakt met de neus/mond.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de neus/mond van het konijn de stok niet op een ongedefinieerde plaats raakt, behalve de bal.
   2. Verwijder het doelwit uit het gezichtsveld van het konijn terwijl je beloont.
   3. Herhaal alle bovenstaande stappen vijf keer totdat het konijn deze stap minstens vier van de vijf keer met succes heeft uitgevoerd (slagingspercentage van 80%).
2. Plaats het doel op een andere plek waar het met de neus/mond kan worden aangeraakt door hoofdbewegingen zonder het hele lichaam te bewegen.
   1. C en T wanneer het konijn het doel raakt met de neus/bek en volg de stappen 5.1.2 en 5.1.3.
3. Plaats het doel op een grotere afstand van het konijn en laat het konijn zich ernaartoe uitstrekken.
   1. C en T wanneer het konijn het doel raakt met de neus/bek en volg de stappen 5.1.2 en 5.1.3.
4. Vergroot de afstand tussen het doelwit en het konijn verder, waarbij het dier één sprong moet maken om het doel te bereiken.
   1. C en T wanneer het konijn het doel raakt met de neus/bek en volg de stappen 5.1.2 en 5.1.3.
5. Plaats het doel net voor de neus/mond van het konijn zodat het konijn het doel kan aanraken en beweeg het doel dan langzaam weg van het konijn. Zorg ervoor dat het konijn een variabel aantal sprongen moet maken om het doel te volgen.
   LET OP: In een blok van vijf pogingen wordt de 1e^{, 2e},^3e, 4e en 5e ^{keer dat} het konijn wordt beloond na respectievelijk 2, 1, 2, 3 en 2 sprongen (gemiddeld: na 2 sprongen).
   1. C en T wanneer de konijnen het vereiste aantal hoppen hebben gemaakt en volgt de stappen 5.1.2 en 5.1.3.
6. Herhaal stap 5.5 en verplaats het doel door de gang tussen de twee objecten.
   OPMERKING: Voor deze stap worden twee objecten, zoals tunnels, parallel aan elkaar geplaatst en vormen ze een gang.
   1. C en T wanneer de konijnen het vereiste aantal hoppen hebben gemaakt en volg de stappen 5.1.2 en 5.1.3.
7. Herhaal stap 5.5 en verplaats het doel naar de trainingsarena zodat het konijn erin gaat.
   1. C en T wanneer de konijnen het vereiste aantal hoppen hebben gemaakt en volg de stappen 5.1.2 en 5.1.3.

6. Weging

OPMERKING: Doelgedrag: Blijf minstens één seconde op de weegschaal. Als het oppervlak van de weegschaal te glad is, kan er een antislipkussen op worden gelegd. Sommige konijnen hebben echter de neiging om aan het kussentje te knagen.

1. Leid het konijn met de richtstok naar de weegschaal zoals beschreven in stap 5.5.
   1. C en T wanneer het konijn het doel raakt met de neus/mond.
   2. Verwijder het doelwit uit het gezichtsveld van het konijn terwijl je beloont.
   3. Herhaal alle hierboven beschreven stappen vijf keer totdat het konijn deze stap minstens vier van de vijf keer met succes heeft uitgevoerd (slagingspercentage van 80%).
2. Verplaats het doel iets boven de schaal zodat het konijn er met de voorpoten op stapt om het doel met de neus/mond aan te raken.
   1. C en T en volg de stappen 6.1.2 en 6.1.3.
3. Verplaats het doel iets voorbij het midden van de schaal zodat het konijn er met de voorpoten op stapt en zich over de schaal uitstrekt om het doel met de neus/mond aan te raken.
   1. C en T en volg de stappen 6.1.2 en 6.1.3.
4. Verplaats het doel verder voorbij het midden van de schaal, zodat het konijn met de voor- en achterpoten op de weegschaal stapt om het doel met de neus/mond aan te raken.
   1. C en T en volg de stappen 6.1.2 en 6.1.3.
5. Leid het konijn op de weegschaal zoals beschreven in 4.4. en wacht een paar seconden voor C en T.
   OPMERKING: Beloon in deze stap het konijn nadat het een variabele tijd op de weegschaal heeft gezeten. In een blok van vijf pogingen, de 1e^{, 2e},^3e, 4e en 5e ^keer, wordt het konijn beloond na respectievelijk 0,5, 1,0, 2,0, 0,5 en 1,0 seconde (gemiddeld: 1,2 s). Terwijl het konijn gedurende deze tijd stil blijft staan, kan het gewicht van de weegschaal worden afgelezen. Als de weegschaal meer tijd nodig heeft om te stabiliseren en het gewicht te meten, verhoog dan de zittijd van het dier op de weegschaal.
   1. C en T en volg de stappen 6.1.2 en 6.1.3.

7. Transportbox invoeren

OPMERKING: Doelgedrag: Het betreden en verlaten van de transportbox. Gebruik voor de training een transportbox (vloer 30 cm × 50 cm; deur 27 cm × 25,5 cm) met een opening in het deksel (16 cm × 39 cm) waarvan de bodem bedekt is met vuil strooisel.

1. Leid het konijn met de doelstok naar de doos zoals beschreven in stap 5.5.
   1. C en T als het konijn voor de ingang van de box staat.
   2. Verwijder het doelwit uit het gezichtsveld van het konijn terwijl je beloont.
   3. Herhaal alle hierboven beschreven stappen vijf keer totdat het konijn de taak minstens vier van de vijf keer met succes uitvoert (slagingspercentage van 80%).
2. Houd de doelstok door de opening van het deksel en verplaats deze in de doos, waardoor het konijn wordt gemotiveerd om met de voorpoten de doos in te gaan.
   1. C en T en volg de stappen 7.1.2 en 7.1.3.
3. Volg stap 7.2 en leid het konijn de doos in (d.w.z. alle voor- en achterpoten gingen de doos in).
   1. C en T en volg de stappen 7.1.2 en 7.1.3.
4. Volg stap 7.3 en sluit de deur van de doos een paar seconden. Open vervolgens de deur weer.
   1. C en T en volg de stappen 7.1.2 en 7.1.3.
5. Volg stap 7.3 en sluit de deur van de doos. Til de doos voorzichtig een beetje op (d.w.z. een paar centimeter boven de vloer). Zet de doos terug op de grond en open de deur.
   1. C en T en volg de stappen 7.1.2 en 7.1.3.
6. Volg stap 7.5. Leid het konijn vervolgens met de doelstok uit de doos.
   1. C en T en volg de stappen 7.1.2 en 7.1.3.

8. Opfok

OPMERKING: Doelgedrag: Plaats de voorpoten op de palm van de hand tijdens het steigeren. Houd voor de trainingssessie zowel de doelstok als de beloningskom in dezelfde hand.

1. Plaats het doel boven de kop van het konijn zodat het konijn de neus omhoog strekt om het doel met de neus/mond aan te raken terwijl alle poten op de grond blijven.
   1. C en T.
   2. Verwijder het doelwit uit het gezichtsveld van het konijn terwijl je beloont.
   3. Herhaal alle hierboven beschreven stappen vijf keer totdat het konijn deze stap minstens vier van de vijf keer met succes heeft uitgevoerd (slagingspercentage van 80%).
2. Plaats het doel boven de kop van het konijn, zoals beschreven in stap 8.1. Nadat het konijn de neus naar boven heeft gestrekt, beweeg je het doelwit verder naar boven zodat het konijn de voorpoten van de grond tilt en het doelwit met de neus/mond raakt.
   1. C en T en volg de stappen 8.1.2 en 8.1.3.
      LET OP: Als het konijn niet voldoet aan 8.2, kan er na 8.2 een tussenstap worden toegevoegd. Volg hiervoor 8.2 en benader en raak dan de voorpoten van het konijn (handpalmoppervlak) aan met de palm van de vrije hand. C en T en volg de stappen 8.1.2 en 8.1.3.
3. Plaats de palm van de vrije hand voor het konijn en beweeg het doel boven de kop van het konijn zodat het konijn de voorpoten op de hand zet om het doel met de neus/mond aan te raken.
   1. C en T na één seconde en volg de stappen 8.1.2 en 8.1.3.
      OPMERKING: Terwijl de voorpoten op de hand van de trainer rusten, kan de buik van het konijn visueel worden geïnspecteerd.

9. Springen op schoot

OPMERKING: Doelgedrag: Spring op de schoot van de trainer en blijf zitten terwijl je wordt aangeraakt. Houd voor stap 9.5-9.9 zowel de doelstok als de beloningskom in dezelfde hand, aangezien één hand het konijn moet aanraken.

1. Leid het konijn met de doelstok in de buurt van de trainer zoals beschreven in protocolstap 5.5.
   1. C en T wanneer het konijn het doel raakt met de neus/mond.
   2. Verwijder het doelwit uit het gezichtsveld van het konijn terwijl je beloont.
   3. Herhaal alle hierboven beschreven stappen vijf keer totdat het konijn deze stap minstens vier van de vijf keer met succes heeft uitgevoerd (slagingspercentage van 80%).
2. Verplaats het doel boven de benen van de trainer zodat het konijn de voorpoten op de poten zet om het doel met de neus/mond aan te raken.
   1. C en T en volg de stappen 9.1.2 en 9.1.3.
3. Verplaats het doel boven de poten en iets verder weg van het konijn, zodat het konijn de voorpoten op de poten zet en zich naar voren strekt om het doel met de neus/mond aan te raken.
   1. C en T en volg de stappen 9.1.2 en 9.1.3.
      LET OP: Als het konijn niet voldoet aan 9.4, kan er na 9.3 een tussenstap worden toegevoegd. Volg hiervoor stap 9.3 en lok vervolgens het konijn met de beloningsschaal op de schoot. Wanneer het konijn alle vier de poten op de schoot heeft gelegd, volgen C en T en volg stap 9.1.2 en 9.1.3.
4. Verplaats het doel boven de poten en nog verder weg van het konijn zodat het konijn op de schoot springt om het doel met de neus/mond aan te raken.
   1. C en T en volg de stappen 9.1.2 en 9.1.3.
5. Volg stap 9.4. En aai het konijn voorzichtig met de vrije hand van craniaal naar caudaal (beginnend bij de schouder) terwijl het konijn op de schoot zit.
   1. C en T en volg de stappen 9.1.2 en 9.1.3.
6. Volg stap 9.4 en streel voorzichtig met de vrije hand de oren van het konijn van craniaal naar staart terwijl het konijn op schoot zit.
   1. C en T en volg de stappen 9.1.2 en 9.1.3.
7. Volg stap 9.4. En pak voorzichtig een van de oren van het konijn vast om de oren visueel te inspecteren.
   1. C en T en volg de stappen 9.1.2 en 9.1.3.
8. Volg stap 9.4. En aai met de vrije hand over een voor- of achterpoot terwijl het konijn op schoot zit.
   OPMERKING: Als de rechterkant van het konijn naar de trainer toe wijst en de linkerkant van de trainer af staat, kunnen de linkerpoten voorzichtig worden aangeraakt (en vice versa). Zorg ervoor dat je beide kanten afwisselend traint.
   1. C en T en volg de stappen 9.1.2 en 9.1.3.
9. Volg stap 9.4. En til voorzichtig een voorpoot of achterpoot op met de vrije hand terwijl het konijn op de schoot zit.
   OPMERKING: De klauwen kunnen worden geïnspecteerd wanneer de poten worden opgetild. Zorg ervoor dat je beide kanten afwisselend traint.
   1. C en T en volg de stappen 9.1.2 en 9.1.3.

Resultaten

In de volgende paragrafen wordt informatie verstrekt over materiaal en methoden die verder gaan dan het protocol, samen met de representatieve resultaten.

Statistiek

Gegevens verkregen uit het bovengenoemde protocol werden opgeslagen in spreadsheets en geanalyseerd met behulp van software voor geavanceerde statistische analyse (Tabel met materialen). Tests voor normaliteit (visuele inspectie van histogrammen en qq-plots, vergelijking van gemiddelde, standaarddeviatie en mediaan) werden uitgevoerd voor de continue parameters. Verschillen tussen parameters die werden onderzocht in de vrijwillige benaderingstest (tijdsduur interactie met trainer en onbekende persoon, aanrakingen van voorpoten-benen) werden geanalyseerd met behulp van de Wilcoxon-test met ondertekende rang. Verschillen tussen de hanteringstechnieken werden geanalyseerd met behulp van de Wilcoxon-test met ondertekende rang of de McNemar-test (indien binair). De verschillen werden als significant beschouwd bij p < 0,05. Bij gebruik van de Wilcoxon signed-rank test moest de verdeling van de verschillen symmetrisch zijn volgens de visuele inspectie van het histogram.

De studie was verkennend. Vermogensanalyse op basis van de tijdsduur dat de konijnen interactie hadden met de "hanteringsapparaten" werd uitgevoerd na het onderzoek (Wilcoxon signed-rank test; vermogen ≥ 0,999) met behulp van G*Power (versie 3.1.9.7)⁵².

Gewenning

Alle konijnen, behalve #4 en #10, namen voer op uit de beloningsbak en lieten de trainer ze aanraken tijdens alle gewenningssessies. Konijn #4 accepteerde de voedselbeloning niet in de^1e sessie, maar at vier keer uit de beloningskom in de^2e sessie. De hoeveelheid beloningsinname nam echter toe in latere sessies en het konijn kon ook worden aangeraakt. Konijn #10 had ook meer tijd nodig om te wennen aan de trainer en de voedselbeloning. In de eerste sessie accepteerde het konijn na 5 minuten de voedselbeloning van de trainer, maar kon niet worden aangeraakt. In de 2e sessie werd geen interesse in het eten waargenomen. In de daaropvolgende sessies accepteerde konijn #10 echter zowel voedselbeloningen als aanrakingen.

Maak kennis met de clicker

Twaalf van de dertien konijnen hebben met succes protocolsectie 4 op een dag afgerond en de voedselbeloning (primaire bekrachtiger) gekoppeld aan de klik (secundaire bekrachtiger) binnen deze trainingssessie. De associatie werd getest door het gedrag van de konijnen te observeren nadat de klik voor de tiende keer was gepresenteerd. Wanneer een dier direct na de klik op zoek was naar de beloning, werd aangenomen dat het konijn de primaire met de secundaire bekrachtiger associeerde. Konijn #4 heeft de voedselbeloning niet opgegeten na de klik op dag 1. Het kostte konijn #4 een dag langer (d.w.z. twee dagen) om de klik en de voedselbeloning met succes te associëren.

Het doel volgen

Tabel 1 geeft het aantal trainingssessies (gegeven als mediaan, 25e^percentiel en 75e percentiel) dat nodig is om de konijnen het doelgedrag van de protocollen te leren. Het kostte de konijnen 2 trainingssessies (mediaan) om de doelstok te volgen naar de trainingsarena (Tabel 1). Alle konijnen bereikten de laatste stap (5,7) van dit doelgedrag.

Konijn #4 en konijn #7 hadden respectievelijk 7 en 8 trainingssessies nodig, voordat ze de doelstok volgden naar de trainingsarena. Omdat konijn #7 stap 5.4 niet kon voltooien en geen sprong maakte om de doelstok te volgen, werd na stap 5.3 een extra trainingsstap (5.3+) in het protocol geïmplementeerd. In stap 5.3+ werd de doelstok op een grotere afstand van het konijn geplaatst dan in 5.3 en moest het konijn zich in verschillende richtingen naar het konijn uitstrekken, maar de doelstok was nog steeds bereikbaar zonder een sprong te maken. Konijn #4 had problemen met stap 5.5 en was niet in staat om de doelstok te volgen, die net voor de neus/mond was geplaatst, voor een variabel aantal hops. Daarom is er een extra stap 5.4+ aan het protocol toegevoegd. In dit geval werd de doelstok net voor de neus/mond van het konijn geplaatst en vervolgens in verschillende richtingen bewogen, waardoor het konijn één sprong moest maken. Dezelfde extra stap werd ook met succes gebruikt voor konijn #7. Na het doorlopen van de aanvullende trainingsstappen met een slagingspercentage van minimaal 80% konden ze verder met de volgende stappen.

Weging

De konijnen hadden 1 trainingssessie (mediaan) nodig tot het uitvoeren van stap 6,5 (d.w.z. een variabele hoeveelheid tijd op de weegschaal blijven) (Tabel 1). Alle konijnen bereikten de laatste stap (6,5) van dit doelgedrag.

Transportbox invoeren

De konijnen voerden alle stappen van 7,1 tot 7,6 (d.w.z. het betreden en verlaten van de transportbox na het tillen) met succes uit binnen 2 trainingssessies (mediaan) (tabel 1). Alle konijnen bereikten de laatste stap (7,6) van dit doelgedrag.

Toen konijnen #2 en #3 stap 7.6 voor de eerste keer(en) met succes uitvoerden, wilden ze niet opnieuw de transportbox in om deze stap te herhalen. Daarom is stap 7.5+ in het leven geroepen: nadat het dier de doelstok naar de doos had gevolgd, werd de beloningsschaal door de dekselopening gehouden en werd het dier in de doos gelokt. Zodra het konijn de doos binnenkwam, werd de deur gesloten en de doos voorzichtig opgetild. Nadat de doos weer op de grond was geplaatst, werd de deur geopend en werd het konijn met de schietstok uit de doos geleid. Beide dieren slaagden erin om stap 7,5+ minimaal 4 keer uit te voeren, gevolgd door stap 7,6 op de volgende dag.

Fokken

Er was 1 trainingssessie (mediaan) nodig totdat de konijnen stap 8.3 (d.w.z. het plaatsen van de voorpoten op de hand van de trainer) met succes hadden voltooid (Tabel 1). Aangezien 11 van de 13 konijnen (d.w.z. alle konijnen behalve #3 en #7) stap 8.3 niet uitvoerden, werd voor deze dieren een extra trainingsstap 8.2+ na 8.2 gedefinieerd. In stap 8.2+ werd de richtstok boven de kop van het konijn bewogen zodat het konijn de voorpoten van de grond tilde en het doel met de neus/mond raakte. Terwijl het konijn het doel aanraakte, naderde de trainer en raakte de voorpoten (palmair oppervlak) aan met de palm van haar vrije hand. Nadat stap 8.2+ in minimaal vier van de vijf pogingen succesvol was uitgevoerd, werd stap 8.3 opnieuw getraind en afgerond.

Springen op schoot

2,5 trainingssessies (mediaan) waren nodig om de konijnen te trainen in stap 9.1. tot 9.9. (Tabel 1). Tien konijnen waren in staat om de laatste trede 9.9 te bereiken (d.w.z. het accepteren dat hun poten worden aangeraakt terwijl ze op de schoot van de trainer zitten). Konijn #4 bereikte alleen stap 9.2 (d.w.z. haar voorpoten op de poten van de trainer plaatsen) en konijn #10 bereikte stap 9.3 (d.w.z. springen op de schoot van de trainer). Konijn #7 bereikte trede 9.3+, wat een extra tussenstap was na stap 9.3. In dit geval plaatste het konijn de voorpoten op de poten van de trainer, zoals beschreven in stap 9.2, en werd het vervolgens gelokt met de beloningsschaal op de schoot van de trainer. Nadat alle vier de poten op de schoot van de trainer waren geplaatst, werden de klik en beloning gepresenteerd. Deze stap is met succes toegevoegd aan het protocol voor acht konijnen om het uitvoeren van de volgende stappen te vergemakkelijken.

Generalisatie

Om te evalueren of de konijnen de getrainde aanwijzingen generaliseerden om het doelgedrag uit te voeren met andere personen dan de trainer, vroeg een vrouwelijke dierenverzorger, die bekend was bij de konijnen maar slechts weinig eerdere ervaring had met clickertraining, de konijnen om het getrainde doelgedrag uit te voeren "wegen", "transportbox binnengaan", "opfokken" en "op schoot springen". Als een konijn de laatste stap van "op schoot springen" niet eerder heeft geleerd, moet de laatste succesvolle trainingsstap worden aangetoond.

De sessies vonden plaats op vijf opeenvolgende dagen na afloop van de 3-weekse training (Figuur 1). De dierverzorger leest voor de 1e^{sessie de} trainingsprotocollen. Aan het begin van de^1e sessie gaf de trainer een korte demonstratie van alle doelgedragingen. Daarna bleef ze in het hok, gaf ze instructies tijdens sessies en documenteerde ze welke stap van het doelgedrag de konijnen vertoonden. Als een konijn een bepaalde stap niet liet zien, kreeg de dierverzorger de opdracht om terug te keren naar de vorige stap in het protocol.

Alle konijnen, behalve konijn #4, voerden het doelgedrag "wegen", "de transportbox binnengaan" en "opfokken" (gegevens gegeven als mediaan) uit na respectievelijk 1 sessie, 2 sessies en 2 sessies (tabel 2). Konijn #4 was niet bereid om ook maar enige stap van dit doelgedrag te laten zien.

Acht van de tien dieren die in staat waren om de laatste stap van "springen op schoot" te laten zien (9,9) vertoonden dit gedrag na 3 sessies (mediaan). Hoewel konijn #3 en #11 al eerder de laatste stap van het "springen op schoot" hadden geleerd (9,9), lieten ze stap 9,3 alleen zien bij de dierverzorger. Konijn #4, #7 en #10 lieten dezelfde stap zien als bij de trainer (9.2, 9.3+ en 9.3).

Uitvoering van doelgedrag na trainingspauzes van 1 week

Om te testen of de dieren de laatste stappen van "wegen", "in de transportbox gaan", "opfokken" en "op schoot springen" konden volhouden, haalde de trainer een week en twee weken na de generalisatiesessies het doelgedrag op (Figuur 1). Tijdens deze pauzes werden de dieren niet getraind en ontvingen ze geen beloningen.

Op beide tijdstippen waren alle konijnen in staat om de laatste stappen van "wegen" (6,5), "in de transportbox gaan" (7,6) en "opfokken" (8,3) uit te voeren die ze in de vorige 3-weekse training hadden geleerd. Dieren (n = 10) die de laatste stap van het "springen op schoot" (9,9) leerden, vertoonden dit gedrag op beide tijdstippen; Degenen die de laatste stap van dit doelgedrag (n = 3) niet hadden geleerd, konden de laatste stap die ze eerder hadden bereikt (konijn #4: stap 9.2; konijn #7: stap 9.3+, konijn #10: stap 9.3) na de eerste pauze van 1 week demonstreren. Na de tweede pauze van 1 week lieten deze drie konijnen dezelfde stappen zien als de week ervoor, maar werden ze ook gevraagd om de volgende stappen uit te voeren en bereikten ze stap 9.9.

Uitvoeren van doelgedrag na een trainingspauze van ongeveer 8,5 week

Nadat de dieren een trainingspauze hadden gehad van ongeveer 7,5 week (#1-5, #13) of 9,5 week (#6-12), werden de doelgedragingen weer teruggeroepen. Alle dieren konden de laatste stap van "wegen" (6,5), "in de transportbox gaan" (7,6) en "opfokken" (8,3) laten zien. Twaalf konijnen vertoonden de laatste stap van "op schoot springen" (9,9), terwijl konijn #7 alleen haar voorpoten op de benen van de trainer plaatste en zich naar voren uitstrekte om het doel met haar neus/mond aan te raken (9,3).

Vrijwillige benadering van de vertrouwde trainer en een onbekende persoon

Drie weken na de training werd het vrijwillige benaderingsgedrag van de konijnen getest om hun interactie met de vertrouwde trainer en een onbekend persoon (beide vrouwtjes) te onderzoeken. Vóór de test douchten beide personen met dezelfde douchegel en shampoo, trekken ze dezelfde soort kleding en beschermingsmiddelen aan (handschoenen, maskers, haarnetjes). Er werden twee proeven van 5 minuten uitgevoerd met een pauze van 2 minuten tussen de proeven in het dierenhok. Zoals te zien is in figuur 4A, zaten de bekende trainer en een onbekende persoon (in dezelfde houding) tegenover elkaar op de vloer van het hok, met de rug naar de muur van het hok gericht. Twee huizen werden uit het hok verwijderd; Het overige huis en de tunnel werden in de buurt van de andere twee muren geplaatst, op dezelfde afstand van beide personen. In de^2e proef verwisselden ze hun zitplaatsen om rekening te houden met mogelijke plaatsvoorkeuren van de konijnen. Ze bewogen of praatten niet tijdens de proeven van 5 minuten. Als een konijn op zijn broek kauwde en in zijn been kneep, werd een hand voorzichtig naar het konijn bewogen om haar te laten stoppen. Opgemerkt moet worden dat de observaties van de individuele dieren binnen de groep werden gedaan, d.w.z. dat de konijnen tijdens beide proeven met elkaar konden interageren.

De video's werden retrospectief geanalyseerd met behulp van BORIS⁵³. Volgens het ethogram dat voor dit onderzoek is gedefinieerd, had een konijn interactie met een persoon wanneer alle vier de poten zich in het vierkant van 70 cm × 70 cm rond een persoon of op de grenslijn van dit vierkant bevonden. Bovendien werd gemonitord of een konijn beide voorpoten op de poten plaatste of op de schoot sprong (waarbij alle vier de poten op de schoot werden geplaatst).

Figuur 4B toont de tijdsduur van de interactie tussen de konijnen en de twee personen. Uit de Wilcoxon-test bleek dat de interactietijd met de trainer en de onbekende persoon significant verschilde in de 1e^{proef (} z = -2,040, p = 0,041, Pearson-correlatiecoëfficiënt r = 0,57) maar niet in de 2e^{proef (} z = 0,245, p = 0,807, r = 0,07). In de^1e proef besteedden de konijnen meer tijd aan interactie met de trainer.

Drie (#1, #5, #6) en vijf (#1, #6, #7, #8, #12) konijnen plaatsten hun voorpoten op de poten van de trainer in respectievelijk proef 1 en 2. Vijf dieren sprongen met alle vier de poten op de schoot van de trainer (proef 1: #1, #3, #5, #6; proef 2: #9). Terwijl vier dieren (#1, #2, #8, #9) in de 1e^{proef en} drie (#1, #4, #8) dieren in de 2e^{proef met} hun voorpoten op de benen van de onbekende persoon klommen, sprong geen van hen met alle vier de poten op haar schoot. Het gemiddelde van de verschillen tussen het aantal "aanrakingen van de voorpoten-benen" verschilde niet significant tussen de trainer en de onbekende persoon in proef 1 (z = -0,264, p = 0,792, r = 0,07) noch in proef 2 (z = -0,707, p = 480, r = 0,20).

Effect van hanteringstechnieken op het gedrag van de konijnen ten opzichte van het "hanteringsapparaat"

Om te onderzoeken of de technieken die werden gebruikt om de konijnen van de vloer te tillen hun gedrag beïnvloedden, werd na deze procedure een gedragsobservatie van 2 minuten uitgevoerd in het kader van het algemene onderzoek op twee opeenvolgende dagen (Figuur 1). Deze observatie werd uitgevoerd voor zeven dieren.

Op dag 1 werden de konijnen opgehaald met de transportbox. Hiervoor volgden ze de doelstok in de doos, de doos werd gesloten en naar de onderzoekstafel gebracht, zoals beschreven in trainingsstap 7.5. Hier werden ze voorzichtig uit de doos naar de tafel getild, met beide handen/armen onder/rond het lichaam van het dier. Een gezondheidsinspectie (inclusief palpatie van het lichaam, visuele inspectie van oren, ogen, neusgaten, snijtanden, anogenitale regio) werd uitgevoerd en vervolgens werd hen een voedselbeloning aangeboden. Na de gezondheidsinspectie werden ze voorzichtig met de handen de transportbox in geleid. De richtstok werd niet gebruikt op de onderzoekstafel om ervoor te zorgen dat de handen van de trainer vrij waren om de dieren vast te zetten. Toen de konijnen weer in de transportbox kwamen en de deur werd gesloten, werd de box overgebracht naar het hok en werd de deur geopend. Het konijn werd gedwongen de doelstok te volgen en de doos te verlaten, gevolgd door de presentatie van de voedselbeloning, zoals beschreven in trainingsstap 7.6.

Op dag 2 werden de konijnen opgepakt met de conventionele techniek, die routinematig wordt gebruikt door de dierenverzorgers (d.w.z. ze werden met één hand bij het nekvel in bedwang gehouden en kort op de andere arm getild met het hoofd naar de kromming van de arm). Vervolgens werden ze overgebracht naar de onderzoekstafel en werd er een gezondheidsinspectie uitgevoerd, zoals hierboven beschreven. Na de gezondheidsinspectie werd hen een voedselbeloning uit de beloningsschaal aangeboden. Ten slotte werden ze weer bij hun nekvel in bedwang gehouden en kort op de arm getild om ze terug naar het hok te brengen. Nadat ze waren vrijgelaten, werden ze opnieuw een voedselbeloning aangeboden.

Nadat de voedselbeloning aan de konijnen in het hok was aangeboden, ging de trainer op de vloer van het hok zitten zonder interactie met de konijnen en werd er een video van 2 minuten opgenomen, die retrospectief werd geanalyseerd met behulp van BORIS⁵³. Opgemerkt moet worden dat de observaties van individuele dieren binnen de groep zijn gedaan omdat ze in hun vertrouwde omgeving moeten worden gevolgd. Dit betekent dat de konijnen met elkaar kunnen communiceren. De volgende parameters werden onderzocht en gedefinieerd: Tijdsduur doorgebracht met interactie met trainer of transportbox (d.w.z. een konijn bevond zich in de interactiezone van de trainer of de transportbox wanneer de neus minder dan een lichaamslengte verwijderd was van de trainer of de box); de tijdsduur die in de transportbox werd doorgebracht (d.w.z. deze gebeurtenis vond plaats toen het dier zich in de interactiezone van de box bevond; het begon toen de konijnen met alle vier de poten de box binnenkwamen en stopte toen een of meer poten buiten de box werden geplaatst); de tijdsduur van het eten (d.w.z. het konijn heeft stro, hooi, korrels of uitwerpselen ingenomen; het kauwen op de kleding of schoenen van de trainer werd niet als eten beschouwd); tijdsduur doorgebracht met verstoppen (deze gebeurtenis begon toen het konijn een huis of tunnel binnenging met alle vier de poten; het stopte toen het konijn het asiel verliet met een of meer poten); springen op schoot (d.w.z. het konijn sprong op de schoot van de trainer en plaatste alle vier de poten erop; deze gebeurtenis vond plaats toen het dier zich in de interactiezone van de trainer bevond); het plaatsen van de voorpoten op de poten (d.w.z. het konijn plaatste beide voorpoten op de poten van de trainer; deze gebeurtenis vond plaats toen het dier zich in de interactiezone van de trainer bevond).

De gedragsanalyse werd uitgevoerd door de trainer en een persoon die volledig blind was voor de uitgevoerde procedure. Volgens Landis en Koch⁵⁴ was de interbeoordelaarsbetrouwbaarheid tussen de trainer en de geblindeerde persoon, berekend met behulp van BORIS⁵³ (Cohens Kappa), substantieel tot bijna perfect. Voor verdere analyse werden gegevens gebruikt die door de geblindeerde waarnemer waren geëxtraheerd.

Uit de Wilcoxon-test bleek dat de conventionele hanteringstechniek de duur van de interactie met het "hanteringsapparaat" aanzienlijk verminderde, d.w.z. de som van de tijd die werd besteed aan interactie met de trainer en de box nadat deze was opgepakt (z = 2,366, p = 0,018, r = 0,89; Figuur 5A). De hanteringstechniek had geen significante invloed op de tijdsduur van de interactie met de trainer (z = 1,014, p = 0,310, r = 0,28; Figuur 5B). Daarentegen verlengde het oppakken van de konijnen bij de doos de tijdsduur dat ze interactie hadden met de doos (z = 2,366, p = 0,018, r = 0,66; Figuur 5C) en uitgegeven in de doos (z = 2,201, p = 0,028, r = 0,61; Figuur 5D) in vergelijking met de conventionele hanteringstechniek. Bovendien brachten de dieren meer tijd door in de schuilplaatsen nadat ze waren opgepakt met de conventionele hanteringstechniek (z = -1,992, p = 0,046, r = 0,046; Figuur 5F).

De hanteringstechniek had geen significant effect op de tijd die de dieren doorbrachten met eten (z = 0,944, p = 0,345, r = 0,26; Figuur 5E), het aantal konijnen dat hun voorpoten op de poten van de trainer plaatst (McNemar: p = 1.000) of op de schoot van de trainer springt (McNemar: p = 0.500). Onafhankelijk van de hanteringstechniek sprong konijn #9 op de schoot van de trainer en konijn #12 plaatste haar voorpoten op de benen van de trainer. Bovendien zetten konijnen #8 en #11 hun voorpoten op hun poten nadat ze zijn opgepakt door de transportbox.

Terwijl de voedselbeloning die op de onderzoekstafel werd aangeboden, door alle konijnen werd ingenomen na het korte transport in de doos, accepteerde slechts één konijn (#8) het na de conventionele hanteringstechniek. Dit verschil was significant (McNemar: p = 0,031). In het hok werd de voedselbeloning geaccepteerd door zes konijnen (d.w.z. allemaal behalve #7) na het verlaten van de transportbox en vier konijnen (#7, #9, #10 en #12) nadat ze uit de arm waren losgelaten (conventionele hanteringstechniek; McNemar: p = 0,625).

Figuur 1: Tijdschema. Alle gewennings-, trainings- en generalisatiesessies, evenals gedragsobservaties, werden 's ochtends voor het voeren en schoonmaken uitgevoerd. In week 1 (d.w.z. vier dagen na aankomst) werden vijf contextuele conditionerings-/gewenningssessies (maandag t/m vrijdag; protocolsectie 3) uitgevoerd door de dierverzorgers en de corresponderende auteur (allemaal vrouwtjes), gevolgd door een trainingsperiode van 3 weken in week 2-4 (maandag t/m vrijdag; protocolsectie 4-9). Trainingssessies werden geleid door de corresponderende auteur, een dierenarts gespecialiseerd in proefdierwetenschappen en ervaren in het trainen van konijnen, muizen, kippen en paarden. Daarna werden op twee opeenvolgende dagen gedragsobservaties gedaan om te onderzoeken of de techniek die werd gebruikt om de konijnen van de vloer te tillen hun gedrag beïnvloedde. In week 5 werden vijf generalisatiesessies (maandag tot en met vrijdag) gehouden om te evalueren of de konijnen het doelgedrag dat ze hadden geleerd zouden uitvoeren met een andere persoon dan de trainer. Zowel in week 6 en week 7 (op donderdag) als in week 14 (maandag/dinsdag) testte de trainer in het kader van de wekelijkse algemene gezondheidsinspectie of de konijnen de doelgedrag konden vasthouden en vertonen. In week 7 werd een vrijwillige benaderingstest uitgevoerd met de trainer en een onbekende persoon om de gedragsreacties van de konijnen ten opzichte van bekende versus onbekende mensen te onderzoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Trainingsarena. De trainingsarena (zie Tabel met materialen) werd een paar minuten voor het begin van de training opgezet. (A) Om het transport en de installatie te vergemakkelijken, bestond de arena uit twee stukken, die in het hok met elkaar waren verbonden. (B) Twee rijen transparante plastic panelen vormden een arena van ongeveer 136 cm × 90 cm × 70 cm. De deur werd met kabelbinders aan de andere panelen bevestigd waardoor deze kon worden geopend en gesloten. De deur kan worden vergrendeld met een clip. Omdat de muren van de trainingsarena transparant waren, had een konijn visueel, olfactorisch en akoestisch contact met de groepsleden toen het de trainingsarena betrad. Een lage kruk/opstapje als zitplaats voor de trainer en afhankelijk van het te trainen doelgedrag kan er een weegschaal of een transportbox in de geplaatst worden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Beloningskom met geïntegreerde clicker. De beloningsschaal is 3D-geprint met behulp van wit polymelkzuur (PLA). Afmeting vierkante schaal: 8 cm × 8 cm × 3 cm; Afmeting cilindrisch handvat: 9,5 cm × 2,3 cm. Aan het handvat was een vingerklikker (zie Materiaaltabel) bevestigd. Een 3D-printbestand voor de beloningsschaal is te vinden in Aanvullend coderingsbestand 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vrijwillige benaderingstest. (A) In de twee proeven van 5 minuten zaten de bekende trainer en een onbekende vrouw tegenover elkaar in het hok, met de rug naar de wand van het hok gericht. Een huis en een tunnel werden geplaatst in de buurt van de andere twee muren op dezelfde afstand van beide personen. (B) De duur van de interactie met een persoon werd voor elk konijn geanalyseerd. Een konijn had interactie met een persoon wanneer alle vier de poten zich in het vierkant van 70 cm × 70 cm rond een persoon of op de grenslijn van dit vierkant bevonden. De symbolen geven de gegevens van elk individueel dier aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Effecten van hanteringstechnieken op het gedrag van de konijnen. (A-F) Illustraties van gedragsgegevens verzameld van zeven konijnen nadat ze waren gehanteerd door de transportbox of door de conventionele techniek (d.w.z. ze werden vastgehouden door het nekvel van hun nek en op de arm getild). Aangezien de trainer en de transportbox werden beschouwd als "hanteringsmiddelen", (A) Dit paneel toont de som van paneel B en C. De symbolen geven de gegevens van elk individueel dier aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Konijn	Aantal trainingen dat nodig is om het doelgedrag te trainen
	Het doel volgen	Weging	Transportbox invoeren	Fokken	Springen op schoot
#1	1	1	2	2	2
#2	1	1	4	1	5
#3	2	1	3	1	4
#4	7	2	1	3	2 (stap 9.2)
#5	2	1	3	1	3
#6	2	1	2	1	1
#7	8	1	2	2	3 (stap 9.3+)
#8	2	1	2	1	1
#9	2	1	2	1	2
#10	2	2	3	3	5 (stap 9.3)
#11	2	1	2	2	4
#12	2	1	1	1	1
#13	2	3	1	2	4
Mediaan (25e-75e percentiel)	2	1	2	1	2.5
	(2–2)	(1–1.5)	(1.5–3)	(1–2)	(1–4)*

Tabel 1: Aantal sessies dat nodig is om het doelgedrag te trainen. Als een konijn de laatste stap van een doelgedrag niet heeft geleerd, wordt de laatst bereikte trainingsstap tussen haakjes aangegeven.

Definitie van een trainingssessie: ongeveer 30 minuten per groep (6-7 dieren); Maandag t/m vrijdag gedurende drie weken; begint wanneer de trainer in de pen zit en bereid is om met de training te beginnen; eindigt wanneer geen van de konijnen meer deelneemt aan de training of wanneer alle konijnen een laatste stap van een doelgedrag hebben bereikt; Een dier kan meer dan één proef per sessie uitvoeren.

* Konijnen #4, #7, #10 werden uitgesloten van deze berekening omdat ze de laatste stap van "springen op schoot" niet bereikten.

Konijn	Aantal trainingssessies tot de laatste stap van het doelgedrag is bereikt
	Wegen (5 trainingsstappen)	Transportbox invoeren (6 trainingsstappen)	Opfok (3 trainingsstappen)	Springen op schoot (9 trainingsstappen)
#1	1	3	1	1
#2	1	3	1	1
#3	1	3	1	F (9,3)
#4	F	F	F	3 (9.2)
#5	2	3	2	2
#6	1	1	3	3
#7	1	1	3	3 (9.3+)
#8	1	1	1	3
#9	1	1	1	3
#10	1	3	3	3 (9.3)
#11	1	1	3	F (9,3)
#12	1	1	3	3
#13	1	3	2	5
Mediaan (25e-75e percentiel)	1	2	2	3
	(1–1)	(1–3)	(1–3)	(1.25–3)
	(exclusief #4)	(exclusief #4)	(exclusief #4)	(exclusief #3, #4, #7, #10, #11)

Tabel 2: Generalisatie. In vijf sessies (maandag tot en met vrijdag) vroeg een bij de konijnen bekende dierverzorger de konijnen om de laatste stappen (of de laatste bereikte stap) van het getrainde doelgedrag uit te voeren. Als de laatste stap van een doelgedrag niet is bereikt, wordt de laatst bereikte trainingsstap tussen haakjes aangegeven. F (falen) werd aangegeven wanneer een dier niet de laatste stap van een eerder in de training bereikt doelgedrag vertoonde. Definitie van een sessie: maandag tot en met vrijdag gedurende een week; begint wanneer de dierverzorger en trainer in het hok zitten; eindigt wanneer geen van de konijnen (meer) deelneemt of alle konijnen de laatste stap (of de laatste bereikte stap) van een gewenst doelgedrag vertoonden; Een dier kan meer dan één proef per sessie uitvoeren.

Aanvullend coderingsbestand 1: 3D-printbestand "beloningsschaal". Polymelkzuur (PLA) kan worden gebruikt voor de print. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Documentatieblad voor zes konijnen. Het blad moet worden afgedrukt of geopend op een tablet om de voortgang van de training van elk konijn te documenteren. In elke trainingssessie moet worden genoteerd welke trainingsstappen de individuele dieren hebben bereikt of dat er aanpassingen in het protocol nodig waren. Eventuele bijzondere voorvallen (bijv. externe factoren, verminderde gezondheidstoestand) moeten ook worden gedocumenteerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Vereenvoudigde opleidingsprotocollen. De tabellen beschrijven de stappen van de protocolsecties 3-9 op een vereenvoudigde manier. Voor meer details moeten de protocolstappen van het hoofdmanuscript worden gelezen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De trainingsprotocollen zijn ontwikkeld om routineprocedures zoals hantering, gezondheidsinspecties en weging bij laboratoriumkonijnen te verfijnen. Hun haalbaarheid werd geëvalueerd in deze verkennende studie met dertien vrouwelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen. De trainingsprotocollen kunnen op betrouwbare wijze worden toegepast om de konijnen met succes te trainen. De meeste konijnen waren in staat om het doelgedrag dat in de trainingsprotocollen was gedefinieerd binnen minder dan de trainingsperiode van 3 weken te leren, herinnerden ze zich na trainingspauzes van 1 week en generaliseerden ze naar een andere persoon dan de trainer. Er hoefden weinig aanpassingen in het protocol te worden gedaan om aan de behoefte van individuele dieren te voldoen. De belangrijkste bevinding van de huidige studie was dat de verfijnde hanteringstechniek voor het oppakken van konijnen, zoals beschreven in de trainingsprotocollen, minder aversief was dan de conventionele hanteringstechniek. Interessant is dat de getrainde konijnen hun verkennende gedrag niet alleen vertoonden tegenover de bekende trainer, maar ook tegenover een onbekende persoon in een vrijwillige benaderingstest.

Betekenis van het doel

De doelstelling diende als basis voor het huidige trainingsprotocol. Bij de introductie van het doelwit leerden de dieren dat hun gedrag de omgeving beïnvloedde en gevolgen had. Het introduceren van het doel bouwt vertrouwen op tussen de mens en het dier, zoals aangetoond door konijn #4, het duurde 7 trainingssessies voordat het de doelstok in de trainingsarena volgde, maar leerde snel het volgende doelgedrag (d.w.z. binnen 1-3 trainingssessies). Dit konijn #4 leek tijdens de doelintroductie vertrouwen te krijgen in de trainer, wat de training van de andere doelgedragingen vergemakkelijkte. Dit konijn had echter nog steeds geen vertrouwen in andere personen en was niet bereid om het meeste doelgedrag te vertonen in de generalisatiesessies.

Opgemerkt moet worden dat het doel in sommige protocolsecties niet als eindpunt werd gedefinieerd. In plaats daarvan moesten de dieren bijvoorbeeld een variabel aantal hoppen het doel volgen of een variabel aantal seconden op de weegschaal blijven. Er is gekozen voor een variabel beloningspatroon om de aandacht en motivatie van de konijnen in de training te vergroten en te behouden.

Signalen

Nadat de konijnen stap 5.1 met succes hadden uitgevoerd, plaatste de trainer in alle volgende trainingssessies het doel op korte afstand van de neus van het konijn om het konijn aan te geven dat de trainingsproef was begonnen. Als het konijn het doel met de neus/mond aanraakte, werd de bereidheid om deel te nemen aan de training overwogen en begon de training.

De huidige protocollen bevatten geen verdere signalen, bijv. de schaal, de transportbox of de hand werden niet als signalen beschouwd. In plaats daarvan werd het doel gebruikt om het dier naar de trainingsarena te leiden, op de weegschaal, in de transportbox, in de lucht (steigeren) of op de schoot van de trainer. Dit betekent dat het doelgedrag "wegen", "de transportbox binnengaan", "steigeren" en "op schoot springen" aanpassingen waren van "het doel volgen". De reden hiervoor waren de vereisten voor het trainingsprotocol: het moest haalbaar zijn om te worden uitgevoerd door het personeel van dierenfaciliteiten, dat misschien geen experts is op het gebied van dierentraining, en gemakkelijk kunnen worden geïntegreerd in de dagelijkse werkroutine. Daarom moeten de protocollen efficiënt zijn en het doelgedrag snel bereiken.

De hand die voor het konijn wordt geplaatst (stap 8.3), de weegschaal of de transportbox hebben echter ook de potentie om zowel een signaal als een doelwit voor de poten te worden. Daarom kan het mogelijk zijn om verdere stappen te definiëren die verder gaan dan de huidige protocollen en waarvoor het gebruik van de doelstick niet nodig is. Zodra het konijn bijvoorbeeld de weegschaal ziet, geeft de weegschaal de konijnen het signaal om er met alle vier de poten op te springen.

Aanpassingen van de protocollen

Hoewel kan worden verwacht dat het fenotype van bijna genetisch identieke proefdieren zeer vergelijkbaar is, zijn er gedragsverschillen tussen individuen die consistent zijn in de tijd en in verschillende situaties [en] worden aangeduid als persoonlijkheid"⁵⁵, bijvoorbeeld sommige dieren zijn nogal verlegen en andere stoutmoedig⁵⁶. Het kan verlegen, minder verkennende dieren langer kosten om het gedefinieerde doelgedrag van het protocol te leren (bijv. konijn #4). Ook al zijn de standaardtrainingsprotocollen geschikt voor de meerderheid, de training moet rekening houden met de behoeften van een individueel dier en zich daaraan aanpassen, indien nodig²⁶. Er moeten dus extra kleinere tussenstappen worden gedefinieerd voor die konijnen die er niet in slagen een trainingsstap van het protocol te leren. De extra tussentijdse opleidingsstappen moeten hen helpen om succesvol door te gaan naar de volgende stap. Vooral omdat trainingsschema's in theorie worden ontwikkeld en vervolgens in de praktijk worden getest, kan blijken dat er extra trainingsstappen nodig zijn om een bepaald doelgedrag te trainen.

Met betrekking tot de huidige trainingsprotocollen moesten enkele tussentijdse trainingsstappen worden toegevoegd voor de doelgedragingen "het doel volgen", "de transportbox betreden", "opfokken" en "op schoot springen", zoals in detail beschreven in het gedeelte over de representatieve resultaten, aangezien individuele dieren niet doorgingen met de volgende trainingsstap. Interessant is dat de tussenstappen 8.2+ en 9.3+ door de meeste konijnen werden vereist, wat het belang ervan benadrukt. Daarom zijn deze stappen als noot toegevoegd aan de trainingsprotocollen.

Als alternatief voor de gedefinieerde stap 8.2+ kan de trainer een hand op de grond leggen met de handpalm naar boven en het konijn op de hand laten stappen met één en uiteindelijk beide voorpoten. Bovendien is het denkbaar dat een konijn voor stap 9.3+ extra tussenstappen nodig heeft, bijvoorbeeld eerst plaatst het konijn één achterpoot en daarna beide achterpoten op de schoot van de trainer. Als een konijn niet accepteert om aangeraakt te worden in stap 9.5-9.9, kan de duur van het aanraken van de verschillende lichaamsdelen geleidelijk worden verlengd. Bovendien konden aanvankelijk alleen de wijs- en middelvinger worden gebruikt om de dieren met vederlichte druk te aaien. Vervolgens kan het aantal vingers dat wordt gebruikt voor het aanraken en de druk in verschillende stappen worden verhoogd.

Verfijning van de hanteringstechnieken

Aangenomen kan worden dat de omgang zeer aversief is, vooral bij konijnen met een verlegen persoonlijkheidskenmerk. Konijnen zijn terrestrische prooidieren en wanneer ze worden opgetild (d.w.z. van de vloer worden opgepakt) of in bedwang worden gehouden (d.w.z. in de armen van een mens worden gehouden) voor een gezondheidsinspectie en een experimentele procedure, zal dit waarschijnlijk angst en angst veroorzaken. In de trainingsprotocollen werd een optie geïntroduceerd om de hanteringsmethoden te verfijnen: in plaats van het konijn bij het nekvel vast te houden en het konijn op de andere arm te tillen, kan het konijn met de doelstok in de doos worden geleid en in de doos naar de onderzoekstafel worden gedragen, zoals eerder voorgesteld^{50, 57}, waarbij het konijn voorzichtig van de doos naar de tafel wordt overgebracht. Als alternatief kan de bovenkant van de doos worden verwijderd, of kan het konijn met de doelstok uit de doos worden geleid.

Uit de gedragsobservaties die werden uitgevoerd nadat de konijnen waren opgepakt met behulp van de conventionele hanteringstechniek of de transportbox, bleek dat de conventionele hanteringstechniek geassocieerd was met meer stress- en angstgerelateerd gedrag dan de alternatieve techniek. Deze conclusie werd getrokken uit het grote aantal dieren dat de voedselbeloning op de onderzoekstafel weigerde en de langere tijd die werd doorgebracht met het verbergen in de asielen wanneer de conventionele hanteringstechniek werd toegepast. Interessant is dat de hanteringstechniek geen invloed had op de tijd van interactie met de trainer, wat aangeeft dat het hanteringsproces de mens-dier-relatie mogelijk niet heeft geschaad. Naast de trainer diende de transportbox echter ook als "hanteringsapparaat" (d.w.z. het hanteringsapparaat van de conventionele techniek was de trainer, de hanteringsapparaten van de alternatieve techniek waren zowel de trainer als de transportbox). Daarom werd ook de tijd van interactie met de transportbox geanalyseerd. Hoewel de konijnen net met de transportbox waren opgehaald, brachten ze meer tijd door met de interactie met de box of in de box dan wanneer ze met de conventionele techniek werden opgepakt. Dit suggereerde dat de transportbox geassocieerd zou kunnen worden met een positief effect. Bij het vergelijken van de duur van interactie met beide "hanteringsapparaten" (d.w.z. de som van de tijd die werd besteed aan interactie met de box en de trainer), verhoogde de dozenhanteringstechniek de tijdsduur van de interactie met de "hanteringsapparaten", d.w.z. deze techniek had een duidelijk positief effect op de gedragsreactie van de konijnen ten opzichte van de "hanteringsapparaten" in afwachting van hantering. Soortgelijke bevindingen werden gedaan bij laboratoriummuizen, wat aantoonde dat zachte hanteringstechnieken en training stress en angst verminderden: dieren die werden opgepakt met behulp van een tunnel of de komvormige handen besteedden meer tijd aan vrijwillige interactie met het "hanteringsapparaat" en vertoonden minder angstgerelateerd gedrag dan muizen met staarthandvatten¹². Training bleek dit effect te versterken. Leidinger et al. toonden aan dat muizen met zachte handvatten (tunnel/beker) minder plassen, poepen en vocaliseren vertoonden wanneer ze werden tegengehouden door het nekvel en minder zwevend gedrag in de Morris Water Maze-test wanneer ze werden getraind met PRT in vergelijking met ongetrainde muizen¹³.

Haalbaarheid van de protocollen voor het dagelijks werk - trainingsduur, retentie en generalisatie

Het aantal trainingssessies dat nodig was om een doelgedrag aan te leren, was afhankelijk van het individuele dier en het doelgedrag, dat een verschillend aantal stappen omvatte, variërend van sectie 3 tot sectie 9 van het hierboven gepresenteerde protocol.

Afhankelijk van het aantal dieren dat erin slaagde een doelgedrag aan te leren en het aantal aanpassingen dat moest worden gedaan aan de protocollen voor de individuele dieren, hadden de trainingsstappen verschillende moeilijkheidsgraden. Het gedrag "het doel volgen" was de eerste trainingservaring van de konijnen en daarom duurde het voor sommige dieren langer om op dit gedrag te trainen dan op het andere doelgedrag, zoals hierboven besproken. Hoewel alle dieren volgens het huidige protocol getraind konden worden in het "wegen", waren er extra tussenstappen nodig voor het "betreden van de transportbox" door twee dieren en voor het "opfokken" en "op schoot springen" bij bijna alle konijnen. Dit kan worden verklaard door de mate van fysiek contact tussen dier en trainer die nodig was voor het uitvoeren van de verschillende doelgedragingen. Bij het "wegen" en "betreden van de transportbox" was geen sprake van fysiek contact tussen dier en mens. De laatste stap van het "opfokken" (8.3) en de stappen 9.2-9.4 van het "op schoot springen" vereiste dat de konijnen fysiek contact maakten met de trainer. Bovendien raakte de trainer de schouder, rug, romp, oren of poten van het konijn aan in stap 9.5-9.9 van "op schoot springen", waardoor de mate van fysiek contact tussen dier en trainer toenam. Accepteren dat ze aangeraakt werden was voor sommige konijnen een grotere uitdaging dan voor andere. Zoals hierboven besproken, was het nuttig om de trainingsprotocollen van deze doelgedragingen aan te passen en tussenstappen toe te voegen.

Drie konijnen hadden echter extra trainingssessies nodig om het doelgedrag "springen op schoot" te voltooien (#4, #7, #10). Lichamelijke beperkingen waardoor deze dieren niet op de schoot van de trainer konden springen, konden worden uitgesloten. Bovendien konden de konijnen op hun huizen springen, de hoogtes hiervan waren hoger dan de schoot van de trainer.

Het viel op dat twee van deze drie konijnen (#4 en #10) meer tijd nodig hadden om te wennen aan de trainer en de voedselbeloning in de gewenningssessies en gedeeltelijk meer trainingssessies nodig hadden om de laatste stap van ander doelgedrag te bereiken. Dit gold ook voor konijn #7, dat sinds de vierde gewenningssessie een blessure aan de staart had als gevolg van gevechten binnen de groep. Daarom werd konijn #7 opgepakt, overgebracht naar de onderzoekstafel, behandeld en gedurende 15 dagen dagelijks geïnspecteerd, wat mogelijk heeft geleid tot verhoogde voorzichtigheid ten opzichte van mensen. Aan de ene kant is het cruciaal om op te merken dat de trainingsprestaties kunnen worden beïnvloed door bijvoorbeeld een verminderde gezondheidstoestand, verhoogde stressniveaus of een verstoorde mens-dierrelatie als gevolg van andere ingrepen. Aan de andere kant toonden deze observaties het belang aan van gewenning voor de trainer en de voedselbeloning. Sommige dieren hebben meer tijd nodig om vertrouwd te raken met de aanwezigheid van de trainer en de voedselbeloning van de trainer te accepteren. Als er extra gewenningssessies waren uitgevoerd, hadden konijn #4 en #10 mogelijk beter gepresteerd in de trainingssessies. De relevantie van het wennen van konijnen voor mensen is al gerapporteerd in de literatuur. De commerciële fokker, waarvan de konijnen die in dit onderzoek werden gebruikt, werden gekocht, heeft onlangs regelmatige aaisessies geïntroduceerd, die het stressgerelateerde gedrag verminderden en agressies elimineerden⁵⁸. In een eerdere studie werd aangetoond dat aaien en omgaan met jonge konijnen angstgerelateerd gedrag vermindert, hun gewichtstoename verhoogt en het sterftecijfer^vermindert59.

Toen de konijnen eenmaal de verschillende doelgedragingen hadden aangeleerd, konden ze deze na twee korte (een week) en een lange (ongeveer 7,5-9,5 weken) trainingspauzes nog steeds vertonen, behalve op individuele uitzonderingen. Deze observaties kunnen erop wijzen dat het voldoende is om de konijnen te vragen om eenmaal per week het getrainde doelgedrag uit te voeren wanneer het algemene onderzoek wordt uitgevoerd en de kamer/het hok wordt schoongemaakt.

Voor de haalbaarheid van het protocol voor het dagelijkse werkleven is het ook cruciaal dat de konijnen het getrainde doelgedrag generaliseren naar andere personen dan de trainer. In geval van vakantie of ziekte moet een andere persoon de training en verzorging van de dieren voortzetten. De meerderheid van de konijnen (twaalf van de dertien) generaliseerde het doelgedrag "wegen", "in de transportbox gaan" en "opvoeden" naar de dierverzorger, hoewel het in sommige gevallen de konijnen meer dan één trainingssessie kostte om het gewenste gedrag te vertonen. "Wegen" leek het beste te generaliseren; Gevolgd door "transportbox invoeren" en "opfokken". "Op schoot springen" bleek echter moeilijker te generaliseren naar een andere persoon. Het duurde langer voordat de dieren het gewenste gedrag vertoonden (9,9.) en twee konijnen, die eerder de laatste stap 9,9 hadden geleerd, slaagden er niet in dit doelgedrag te vertonen, mogelijk vanwege het hogere fysieke contact dat nodig was (zie hierboven). Eén konijn (#4) vertoonde geen stappen van het doelgedrag "wegen", "transportbox binnengaan" en "grootbrengen" en was niet geïnteresseerd in interactie met de dierverzorger. Konijn #4 was een van de dieren die meer tijd nodig had om te wennen aan de trainer en de voedselbeloning in de gewenningssessies. Dit kan erop wijzen dat voor sommige individuen extra sessies waarin de dierverzorgers tijd doorbrengen met de konijnen, hen laten wennen aan het accepteren van de voedselbeloning van hen en een positieve band opbouwen, gunstig zijn²³. Konijnen kunnen mogelijk onderscheid maken tussen verschillende personen, zoals aangetoond bij ratten⁶⁰. Andere factoren die van invloed kunnen zijn op de prestaties van de konijnen tijdens de sessies met de trainer en de dierverzorger, kunnen onbewuste signalen zijn die de trainer de dieren tijdens de trainingssessies heeft gegeven, bijvoorbeeld de positie van de doelstok of beloningsschaal, de lichaamshouding of beweging. Als de trainer niet op de hoogte is van deze signalen, worden ze niet gedocumenteerd en zullen de andere personen deze signalen niet nabootsen.

Bovendien kunnen de trainingsvaardigheden van de personen die met de dieren werken, inclusief de routine van het hanteren van de richtstok en de uitreiking van de beloning, het gedrag van de dieren beïnvloeden. Naast kennis van leerprincipes en diercommunicatie zijn praktijkervaringen nodig om een dier^{succesvol te trainen 61} en een doelgedrag op te halen. Aangezien generalisatiesessies met een geschoolde en een ongeschoolde persoon niet werden vergeleken, kan de relevantie van de factor "trainingsvaardigheden" niet worden bepaald. Voor zover de auteurs weten, is een groot deel van het proefdierpersoneel echter niet getraind in diertraining en dus vormden de omstandigheden waaronder de generalisatiesessies werden uitgevoerd (d.w.z. het betrekken van een dierverzorger met slechts weinig eerdere ervaring in clickertraining) een realistische setting in proefdierfaciliteiten.

De representatieve gegevens van de protocollen geven dierfaciliteiten een idee van de werklast die gepaard gaat met het trainen van de verschillende doelgedragingen. De gegevens kunnen dierenverblijven helpen om hun eigen werkschema's te maken bij de implementatie van (delen van) het protocol. Afhankelijk van het individuele dier en het doelgedrag, moet er wat extra tijd worden gereserveerd voor het generalisatieproces. De tijdsduur kan echter variëren bij het werken met mannelijke konijnen of een ander konijnenras. In de dierenverblijven moet worden besproken of er voldoende tijd is en wat er moet worden veranderd om tijd te geven voor het trainen van dieren.

Naast de tijd die nodig is voor het trainen van de dieren, moet er rekening mee worden gehouden dat voor de opleiding bekwame trainers nodig zijn en dat het ook tijdrovend kan zijn om het personeel te leren hoe dieren te trainen. Als training een verplicht onderdeel zou zijn van de opleiding van het laboratoriumdierpersoneel, d.w.z. dierverzorgers, dierenartsen en onderzoekers, zou de implementatie van diertraining in faciliteiten worden vergemakkelijkt en minder tijd in beslag nemen. Volgens bijlage III van Richtlijn 2010/63/EU "moeten instellingen gewennings- en trainingsprogramma's opzetten die geschikt zijn voor de dieren, de procedures en de duur van het project", d.w.z. dat dierentraining wettelijk verplicht is. In Duitsland moeten dergelijke programma's worden ingediend bij het aanvragen van een vergunning voor dierproeven. Dit vereist dat personen die dierproeven plannen en met proefdieren werken, bekwaam zijn in het trainen van dieren. Echter, in ieder geval in Duitsland, maakt dierentraining geen deel uit van het trainingsschema van dierverzorgers op het gebied van onderzoek en kliniek 62,63,64. Bovendien wordt het niet expliciet genoemd in de EU-aanbevelingen voor onderwijs en opleiding^{kader 65}. Zolang de opleiding niet in deze regelgeving is geïmplementeerd, moet er daarom meer aandacht worden besteed aan voortdurende professionele ontwikkeling die gericht is op training in positieve bekrachtiging. Het personeel van de proefdieren moet de principes van leer- en trainingstechnieken leren, de benodigde criteria, de overdracht van procedures tussen trainers, het bijhouden van gegevens en hoe te reageren op dieren die niet op de gewenste manier deelnemen om consistentie en voorspelbaarheid te garanderen.

Mens-dier-interactie

De intensieve mens-dier-interactie-tijd tijdens de trainingssessies biedt een optimale setting voor het versterken van de relatie tussen de individuele konijnen en de trainer^26,66. Een positieve relatie tussen mens en dier is gunstig voor het welzijn van de dieren, omdat het hun stressniveaus in de veehouderij en experimentele omgevingen kan verminderen⁶⁷. In de huidige trainingsprotocollen houdt de trainer rekening met de keuzevrijheid van de konijnen en kunnen ze op vrijwillige basis beslissen om al dan niet deel te nemen aan de training. Het geven van keuzevrijheid aan de dieren is gunstig voor hun welzijn ¹⁶ en moet daarom worden nagestreefd in experimenten, maar ook in huisvesting en veehouderij. Er zijn verschillende niveaus van gedragsbureaus⁶⁸; deelname aan PRT kan worden toegeschreven aan het niveau van actiegedreven agentschap, d.w.z. "zich actief gedragen om de huidige resultaten te bereiken [bijv. voedsel aanschaffen]"⁶⁸.

Bij het analyseren van de vrijwillige benadering van de konijnen ten opzichte van de trainer en een onbekende persoon, kon een intensieve mens-dier-interactie worden waargenomen. Uit de resultaten bleek dat alle konijnen, behalve één dier in de^1e proef (#12), interactie hadden met zowel de trainer als de onbekende persoon. Ze leken de trainer te herkennen, aangezien ze een duidelijke voorkeur toonden voor interactie met de trainer in de^1e proef en sommigen van hen sprongen met alle vier de poten op de schoot van de trainer; een gedrag dat niet werd vertoond ten opzichte van de onbekende persoon. Hoewel de konijnen in de^1e proef meer tijd besteedden aan interactie met de trainer dan de onbekende persoon, verschilde de interactietijd niet meer in de^2e proef. Een reden voor deze observatie kan zijn dat de konijnen verwachtten dat ze in de^1e proef een voedselbeloning van de trainer zouden krijgen en dat ze, door gebrek aan voedselbeloningen in de vrijwillige benaderingstest, niet meer tijd met de trainer doorbrachten in de^2e proef. Deze gegevens benadrukten echter dat de getrainde konijnen snel gewend waren aan de aanwezigheid van een onbekende persoon en dat geen van hen te verlegen was om te communiceren. Daarentegen waren ze erg verkennend en geïnteresseerd in de onbekende persoon. Omdat een ongetrainde controlegroep echter niet is onderzocht, is het effect van training op het vrijwillige benaderingsgedrag van de konijnen onduidelijk.

Een hypothese die het gedrag van konijn #12 in de 1e^proef verklaart, is dat deze persoon nog moest wennen aan de aanwezigheid van de onbekende persoon in de^1e proef en meer geïnteresseerd was in interactie met zowel de trainer (70 seconden) als de onbekende persoon (9 seconden) in de^2e proef. Konijnen hebben verschillende persoonlijkheidskenmerken die van invloed kunnen zijn op het niveau van comfort in de buurt van onbekende personen en op hun beurt de latentie om te benaderen of de duur van de interactietijd met een persoon^69,70.

Beperkingen

We zijn ons ervan bewust dat alle konijnen in het hok/de kamer, niet alleen degene die deelneemt aan de training, de klik kunnen horen (d.w.z. de geconditioneerde bekrachtiger) tijdens een trainingssessie en het versterkende effect ervan kan worden verzwakt omdat de voedselbeloning (d.w.z. natuurlijke/ongeconditioneerde bekrachtiger) niet wordt gepresenteerd. Als een konijn buiten de trainingsbak getraind gedrag vertoont en de klik hoort, maar er wordt geen voedsel aangeboden (en dit scenario komt meerdere keren voor), kan het getrainde gedrag worden gedoofd. Dit fenomeen wordt extinctie^64,71 genoemd. Aangezien echter al het doelgedrag van de huidige protocollen afhankelijk is van het doel dat door de trainer wordt gepresenteerd, is het onwaarschijnlijk dat uitsterven zal optreden in onze trainingsomgeving.

Omdat de muren van de trainingsbak transparant waren en de trainingsbak zich in het hok bevond, konden de konijnen elkaar tijdens de training zien, horen en ruiken, wat een duidelijk welzijnsvoordeel is. Bovendien kunnen de konijnen hun groepsgenoten tijdens de trainingen hebben geobserveerd en van elkaar hebben geleerd. Bij ratten werd eerder aangetoond dat individuen leerden een doelgedrag uit te voeren door te observeren hoe hun kooigenoot werd getraind door PRT⁴⁵. Dit feit kan zowel als een voordeel als een nadeel worden beschouwd. De leervorderingen van de dieren kunnen sneller gaan als ze elkaar kunnen observeren. De gegevens van de individuele dieren kunnen echter worden beïnvloed door de prestaties van de groepsleden en mogen niet uitsluitend worden toegeschreven aan de training van het individuele dier. Het trainen van dieren zonder enig contact met hun groepsleden of konijnen die alleen gehuisvest zijn, kan dus langer duren.

Gedragsobservaties van de individuen (in de vrijwillige benaderingstest en na toepassing van de verschillende hanteringstechnieken) werden uitgevoerd in hun vertrouwde sociale omgeving en groep om stress en afleiding veroorzaakt door een nieuwe omgeving en scheiding van hun groep te voorkomen, wat op zijn beurt de gedragsobservaties zou hebben beïnvloed. Het nadeel is echter dat de konijnen elkaars gedrag kunnen hebben beïnvloed tijdens de observatiesessies.

De effecten van de hanteringstechnieken zijn alleen onderzocht bij zeven dieren, waarbij de trainer als persoon met de dieren omging. De auteurs plannen een vervolgstudie, inclusief een a priori berekening van de steekproefomvang, om de bevindingen te reproduceren met andere handlers en om de verschillen tussen de handlingtechnieken verder te onderzoeken.

Alle mensen die betrokken waren bij de training, het hanteren en de vrijwillige benaderingstest waren vrouwen. Er werd niet onderzocht of de trainingsprestaties van de konijnen of hun gedrag zouden variëren als er mannelijke personen bij betrokken waren.

De huidige trainingsprotocollen zouden de lezer een idee moeten geven van wat er bij konijnen kan worden getraind, maar omvatten niet alle mogelijke doelgedragingen die nuttig zouden zijn om bij een laboratoriumkonijn te trainen. Het zou bijvoorbeeld ook de moeite waard zijn om een konijn te markeren, zoals voorgesteld in het protocolgedeelte over algemene vereisten, te trainen met behulp van PRT.

Zoals hierboven verder aangegeven, is de keuze van de juiste beloning niet triviaal. Vanwege hygiënebeperkingen is het gebruik van verse kruiden als voedselbeloningen in sommige proefdierfaciliteiten niet toegestaan en daarom moeten minder geschikte voedselbeloningen zoals zonnebloempitten of foerageertraktaties op basis van granen worden gebruikt. Met betrekking tot het besluit over de voedselbeloning zijn sommige regels en voorschriften van de huidige laboratoriumpraktijken schadelijk voor het welzijn van de dieren en de effectieve opleiding en moeten zij daarom mogelijk van geval tot geval worden heroverwogen. Het kan ook mogelijk zijn om alternatieven voor voedselbeloningen te gebruiken, bijvoorbeeld zachte aanrakingen of interacties met de trainer of verrijkingsitems. De trainer moet er echter voor elk individueel dier voor zorgen dat het alternatief is om het dier te belonen, want een beloning is alleen een beloning als het konijn er echt de voorkeur aan geeft. Vooral aanrakingen worden misschien niet door alle konijnen als belonend ontvangen.

Conclusies

Samenvattend was de huidige studie een eerste stap om de kennislacune op te vullen over geschikte trainingsprotocollen voor laboratoriumkonijnen. Vrouwelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen kunnen worden getraind voor routinematige houderijprocedures met behulp van PRT en het doelgedrag dat wordt geleerd naar andere personen worden gegeneraliseerd, hoewel er extra tijd moet worden gereserveerd voor het generalisatieproces. Doelgedrag zonder fysiek contact leek gemakkelijker te leren dan gedrag dat fysiek contact met mensen vereiste. Nadat de dieren de training van een doelgedrag met succes hadden afgerond, was het voldoende om ze één keer per week op te halen in het kader van het algemeen onderzoek en het schoonmaken van het hok. Trainingsprotocollen die over het algemeen op alle konijnen worden toegepast, zijn handig, maar de trainer moet zich ervan bewust zijn dat deze in sommige gevallen moet worden aangepast aan de behoeften van het dier. De resultaten op het gebied van hanteringstechnieken suggereerden dat het minder aversief was om de konijnen met de transportbox op te pakken in plaats van ze bij hun nekvel vast te houden en ze op de arm te tillen. Al met al bieden de huidige protocollen haalbare instructies voor het gewennings- en trainingsproces van konijnen en kunnen ze dienen als verfijning in proefdierfaciliteiten.

Dieren mogen niet lijden door het besparen van arbeid, tijd of geld (althans volgens de Duitse dierenwelzijnswet⁷²). Het is belangrijk om alle dieren op de zachtst mogelijke manier te verzorgen en te behandelen. Aangezien ongetrainde dieren in hogere mate last hebben van angst en angst veroorzaakt door experimentele en routinematige houderijprocedures dan hun getrainde tegenhangers¹³, is training een eenvoudige verfijningsmaatregel om effectief te voorkomen dat ze negatieve affectieve toestanden ervaren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bed-r’Nest	The Andersons, Inc., Maumee, USA		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Finger Clicker	ASCO		https://ascoshop.de/products/fingerclicker
G*Power		versie 3.1.9.7
Heu-Proppen	Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Germany		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
IBM Corp. Released 2020. IBM SPSS Statistics for Windows,  Armonk, NY: IBM Corp	IBM Corp	Versie 27.0.	in het manuscript vermeld als "software voor geavanceerde statistische analyse"
Kaninchen Haltung + 25 mg/kg Salinomycin-Natrium-Sondermischung	Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Germany		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Lignocel block	Lignocel J. Rettenmaier &Söhne GmbH + Co KG, Rosenberg, Germany		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Lillebro geschälte Sonnenblumenkerne”, Martina GmbH, München, Germany) and Rainbow Foraging Bits (Bio-Serv, Flemington, USA)	Martina GmbH, München, Germany		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Microsoft Excel for Microsoft 365 MSO	Microsoft Corporation	Versie 2305	in het manuscript vermeld als "spreadsheet"
New Zealand White rabbits	Charles River Laboratories France
Plattformwaage DE 35K5DL	KERN & SOHN GmbH, Balingen-Frommern, Germany		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Premium scientific bedding (fine & flake)	SAFE, Augy, France		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Rainbow Foraging Bits	Bio-Serv, Flemington, USA		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Snackball für Kaninchen – 7 cm	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Germany		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Target stick with integrated clicker	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Germany		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Trixi Transportbox Capri Open Top	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Germany		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.
Weiden-Heuball	JR FARM GmbH, Holzheim-Pessenburgheim, Germany		De succesvolle implementatie van het protocol is niet afhankelijk van dit specifieke product. U kunt vergelijkbare producten van andere bedrijven gebruiken.