Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66020

⸱

27 oktober 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Ex vivo live beeldvorming is een krachtige techniek voor het bestuderen van de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties in levende weefsels. Hier presenteren we een protocol dat twee-fotonmicroscopie implementeert om tandepitheelcellen live te volgen in gekweekte snijtanden van hele volwassen muizen.

Samenvatting

De continu groeiende muizensnijtand is in opkomst als een zeer handelbaar modelsysteem om de regulatie van volwassen epitheliale en mesenchymale stamcellen en tandregeneratie te onderzoeken. Deze voorloperpopulaties delen, verplaatsen en differentiëren actief om de weefselhomeostase te handhaven en verloren cellen op een responsieve manier te regenereren. Traditionele analyses met behulp van vaste weefselsecties konden de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties echter niet vastleggen, waardoor ons vermogen om hun regulatie te bestuderen werd beperkt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het onderhouden van hele muizensnijtanden in een explantatiekweeksysteem en live-track tandepitheelcellen met behulp van multifoton timelapse-microscopie. Deze techniek is een aanvulling op onze bestaande gereedschapskist voor tandheelkundig onderzoek en stelt onderzoekers in staat om spatiotemporele informatie te verkrijgen over celgedrag en organisaties in een levend weefsel. We verwachten dat deze methodologie onderzoekers zal helpen bij het verder onderzoeken van mechanismen die de dynamische cellulaire processen beheersen die plaatsvinden tijdens zowel tandheelkundige vernieuwing als regeneratie.

Inleiding

In de afgelopen twee decennia is de snijtand van muizen naar voren gekomen als een platform van onschatbare waarde voor het onderzoeken van de principes van volwassen stamcelregulatie en tandregeneratie 1,2. De muizensnijtand groeit continu en vernieuwt zichzelf gedurende het hele leven van het dier. Het doet dit door zowel epitheliale als mesenchymale stamcellen in stand te houden, die zichzelf kunnen vernieuwen en differentiëren in verschillende celtypen van de tand 1,2. Terwijl tandepitheliale stamcellen aanleiding geven tot ameloblasten, die de glazuurmatrix afscheiden, geven tandheelkundige mesenchymale stamcellen aanleiding tot odontoblasten, cementoblasten en fibroblasten, die respectievelijk dentine, cement en parodontaal ligament vormen 3,4,5,6. Deze constante toevoer van nieuwe cellen handhaaft de weefselhomeostase en maakt de vervanging mogelijk van oude cellen die verloren zijn gegaan als gevolg van kauwslijtage of verwondingen 7,8. Het ophelderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die het onderhoud en de differentiatie van tandheelkundige stamcellen reguleren, staat daarom centraal in het begrijpen van tandheelkundige regeneratie, een gebied van groeiende belangstelling.

Anatomisch gezien is een groot deel van de snijtand van de volwassen muis ingekapseld in het kaakbot. Terwijl de incisale rand van de tand zichtbaar is, past het apicale uiteinde van de snijtand in een kom en is het stevig bevestigd aan het omringende bot via parodontale ligamenten en bindweefsel (Figuur 1A,B). Het apicale uiteinde van de snijtand is ook het groeigebied van de tand en onderhoudt tandstam- en voorlopercellen in zowel de epitheellaag als de mesenchymale pulpa 9,10,11,12,13. In het bijzonder worden tandepitheelstamcellen gehandhaafd aan het bolvormige uiteinde van het epitheel, bekend als de apicale knop, ook wel de labiale cervicale lus genoemd (Figuur 1C). Net als bij het darmepitheel en de epidermis, wordt de epitheelvernieuwing in de snijtand voornamelijk ondersteund door actief cyclende stamcellen en hun zeer proliferatieve intermediaire afstammelingen, transit-amplificerende cellen 14,15,16,17 genaamd, die zich beide in het binnenste deel van de cervicale lus bevinden. Of het snijtandepitheel tijdens de regeneratie slapende stamcellen bevat en gebruikt, moet echter nog worden bepaald. Daarentegen zijn zowel actieve als slapende dentale mesenchymale stamcellen geïdentificeerd in de apicale pulpa, en de slapende stamcellen functioneren als een reservepopulatie die wordt geactiveerd tijdens het herstel van letsel13,18.

Veel van de ontdekkingen over de biologie van de vernieuwing en regeneratie van de snijtanden van muizen zijn het resultaat van histologisch onderzoek, waarbij monsters op verschillende tijdstippen worden verkregen, gefixeerd, verwerkt en vervolgens in microndunne plakjes langs een bepaald vlak worden verdeeld. Door gedetailleerde analyse van histologische secties van verschillende muismodellen die het traceren van afstammingslijnen of genetische verstoringen mogelijk maken, hebben wetenschappers de cellijnen van verschillende voorloperpopulaties geïdentificeerd, evenals de genetische en signaalroutes die de homeostase van de snijtanden en het herstel van verwondingen regelen 19,20,21 . De statische tweedimensionale (2D) beelden van niet-vitale cellen in secties kunnen echter niet het volledige spectrum van cellulair gedrag en ruimtelijke organisaties in levend weefsel vastleggen, zoals veranderingen in celvorm, bewegingen en cellulaire kinetiek. Het detecteren en meten van deze snelle cellulaire veranderingen, die optreden op een tijdschaal die onoplosbaar is door weefselsectie, vereist een andere strategie. Bovendien is het verkrijgen van dergelijke informatie ook van cruciaal belang om te begrijpen hoe tandcellen met elkaar omgaan, reageren op verschillende signaalstimuli en zichzelf organiseren om weefselstructuren en -functies te behouden.

De komst van vierdimensionale (4D) diepe weefselbeeldvorming met behulp van twee-fotonmicroscopie22, een technologie die drie ruimtelijke dimensies integreert met temporele resolutie, overwint de inherente beperkingen van histologische analyse door spatiotemporeel onderzoek van gekweekte weefselexplantaten, organoïden of zelfs weefsels in situ mogelijk te maken 23,24,25,26 . 4D live beeldvorming van het zich ontwikkelende tandepitheel heeft bijvoorbeeld de spatiotemporele patronen van celdelingen en migraties onthuld die weefselgroei, signaalcentrumvorming en tandepitheliale morfogenese coördineren 27,28,29,30,31,32. In de snijtand van volwassen muizen is onlangs 4D-beeldvorming aangepast om cellulair gedrag te bestuderen tijdens herstel van tandepitheelletsel. Live beeldvorming onthulde dat stratum intermedium cellen in de suprabasale laag direct kunnen worden omgezet in ameloblasten in de basale laag om het beschadigde epitheel te regenereren, waardoor het traditionele paradigma van herstel van epitheelletsel wordt uitgedaagd15.

Hier beschrijven we de dissectie, kweek en beeldvorming van de snijtand van volwassen muizen, met de nadruk op epitheelcellen in de labiale cervicale lus (Figuur 1). Deze techniek behoudt de vitaliteit van de tandcellen gedurende meer dan 12 uur en maakt het mogelijk om fluorescerend gelabelde cellen live te volgen met een resolutie van één cel. Deze benadering maakt het mogelijk om celbeweging en -migratie te onderzoeken, evenals dynamische veranderingen in celvorm en delingsoriëntatie onder normale kweekomstandigheden, of in reacties op genetische, fysische en chemische verstoringen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle muizen werden gehouden in pathogeenvrije dierfaciliteiten aan de Universiteit van Californië Los Angeles (UCLA) of de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem (HUJI). Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens voorschriften en protocollen die zijn goedgekeurd door de respectieve Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) of (MD-23-17184-3; HUJI). Een algemene workflow van de experimentele stappen is weergegeven in figuur 2A. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle instrumenten, reagentia en materialen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Bereiding van oplossingen en gels

  1. Dissectiemedium: Bereid verse DMEM/F12 met 0,5% glucose en houd deze warm bij 37 °C tot het nodig is in stap 2.4.
    OPMERKING: We gebruiken DMEM/F12 zonder fenolrood om autofluorescentie tijdens live beeldvorming te verminderen.
  2. 1x kweekmedium: Bereid vers medium met 50% DMEM/F12, 50% rattenserum, 1x glutaminevervanger, 1x MEM niet-essentiële aminozuren, 1% glucose, 0,1 mg/ml L-ascorbinezuur en 0,5% penicilline-streptomycine. Houd het warm op 37 °C tot het nodig is in stap 5.5. Dit medium wordt gebruikt voor het kweken van explantaten snijtanden tijdens live beeldvorming.
    OPMERKING: Het rattenserum moet van hoge kwaliteit zijn en speciaal zijn bereid voor het kweken van hele weefsels door onderzoekers of van een commerciële bron. In het bijzonder moet het bloed worden gecentrifugeerd (gedurende 5 minuten bij 1.200 × g bij kamertemperatuur) voordat de stolling zich begint te vormen. Na centrifugeren moet het resulterende fibrinestolsel worden uitgeknepen en weggegooid33.
  3. Kweekgel: Het doel van de gel is om monsters te immobiliseren tijdens beeldvorming en wordt vers bereid.
    1. Maak 2% gel in DMEM/F12 door 200 mg agarose met een laag smeltpunt op te lossen in 10 ml DMEM/F12 met behulp van een magnetron. Houd de 2% gel op 37 °C.
    2. Maak 2x kweekmedium (zonder DMEM/F12) door 50% rattenserum, 1x glutaminevervanger, 1x MEM niet-essentiële aminozuren, 1% glucose, 0,1 mg/ml L-ascorbinezuur en 0,5% penicilline-streptomycine te mengen. Verwarm het 2x kweekmedium (zonder DMEM/F12) tot 37 °C.
    3. Maak 1% kweekgel door gelijke volumes van 2% gel en 2x kweekmedium (zonder DMEM/F12) te mengen. Houd de 1% kweekgel op 37 °C tot het nodig is in stap 5.1.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat alle oplossingen warm zijn voordat u ze mengt om geleren te voorkomen. We vonden 1% gel geschikt voor het kweken van de snijtand voor volwassen muizen. Het gelpercentage moet empirisch worden bepaald als andere weefsels moeten worden gekweekt.

2. Extractie van de volwassen muizenkaken

  1. Euthanaseer muizen op de gewenste leeftijd met behulp van standaardprocedures die zijn goedgekeurd door de IACUC.
    OPMERKING: Hier gebruiken we CO2 -verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. De regelgeving voor euthanasie bij dieren kan per regio verschillen. Onderzoekers moeten de nodige institutionele goedkeuring verkrijgen voordat ze experimenten uitvoeren en ervoor zorgen dat ze voldoen aan de lokale regelgeving voor dierenverzorging.
  2. Desinfecteer de muis met 70% ethanol.
  3. Onthoofd de muis en haal de linker- en rechterkaken eruit.
    1. Leg de muis op zijn buik en gebruik vervolgens een #9 industrieel scheermesje met één rand om in de nek te snijden en de muiskop te scheiden van de rest van het lichaam.
      OPMERKING: Als er ook weefsels uit de keelholte of het nekgebied moeten worden verzameld, mag onthoofding niet worden uitgevoerd en kan men direct doorgaan naar stap 2.3.2.
    2. Draai de muis om zodat de buikzijde naar boven wijst en de kaken gemakkelijk toegankelijk zijn.
    3. Zet de kop van het dier vast door deze voorzichtig tussen duim en wijsvinger te houden.
    4. Gebruik het scheermesje om een mid-sagittale incisie te maken die over de huid van de onderkaak snijdt van de onderlip naar de halslijn.
      OPMERKING: Een #15 chirurgisch mes kan ook worden gebruikt om de incisie en daaropvolgende dissecties te maken (stappen 2.3.6-2.3.9).
    5. Terwijl de incisie wordt gemaakt, spreidt u de gesneden huid open met de duim en de wijsvinger om de spieren en het kaakbot eronder bloot te leggen.
    6. Gebruik het scheermesje om de kauwspieren aan de buccale zijde van de onderkaak door te snijden, zodat de buitenkant van de linker- en rechterhersenhelft nu vrij is van spieraanhechtingen.
    7. Snijd de mylohyoid-spieren langs de binnenkant van de onderkaak door om daar spieraanhechtingen te verwijderen.
    8. Maak nog een incisie bij de mandibulaire symfyse die de twee hemimandibles met elkaar verbindt. Eenmaal gesneden, wordt de onderkaak gescheiden in de linker- en rechterhelft.
    9. Klem het scheermesje tussen de mandibulaire condylus en het temporale mandibulaire gewricht en ontleed voorzichtig het hemimandible van de rest van het hoofd.
      OPMERKING: We vonden het handig om tegelijkertijd zachtjes aan de snijtand te trekken tijdens het snijden. Er moet voor worden gezorgd dat de onderkaak niet breekt en de zachte weefsels binnenin worden beschadigd.
  4. Breng de ontlede onderkaken onmiddellijk over in een petrischaal met de voorverwarmde dissectiemedia (stap 1.1) en verwijder de resterende spierweefsels met behulp van een #15 chirurgisch mes.
    OPMERKING: Het bewaren van monsters in koude media vertraagt de celactiviteiten, wat resulteert in vertraagd of zelfs mislukt herstel van bepaalde celactiviteiten, zoals proliferatie of celbeweging, tijdens live beeldvorming.

3. Isolatie van de snijtanden van de hele muis

OPMERKING: Verdere isolatie van de snijtand wordt gedaan onder een heldervelddissectiemicroscoop.

  1. Identificeer visueel het ovale gebied van de onderkaak dat de snijtand bedekt en het apicale deel van de snijtand herbergt.
  2. Plaats de onderkaak zo dat het binnenste (linguale) oppervlak naar boven wijst.
  3. Terwijl u de onderkaak op zijn plaats houdt met een gekartelde pincet, genereert u een venster in het ovale gebied door het bovenliggende membraanbot af te scheren met een #15 chirurgisch mes, in een richting die van de condylus naar de kiezen is. Hierdoor komt het zachte weefsel van de apicale snijtand aan de binnenkant bloot te liggen.
  4. Draai de onderkaak om zodat het buitenste (buccale) oppervlak naar boven wijst.
  5. Genereer een venster in het ovale gebied op de buitenonderkaak zoals beschreven in stap 3.3 en gebruik de punt van de scalpel om eventuele resterende botfragmenten aan de rand weg te halen. Zorg ervoor dat het apicale uiteinde van de tand van beide kanten zichtbaar is.
    NOTITIE: Vermijd overmatige druk tijdens het scheren van de botten om schade aan het onderliggende zachte weefsel te voorkomen.
  6. Snijd systematisch de botten rond de snijtand weg om de hele tand te isoleren.
    1. Maak een zuivere snede in een vlak dat direct grenst aan de apicale snijtand om eerst de processus condylair te verwijderen.
      NOTITIE: Pas op dat u niet in de snijtand snijdt.
    2. Maak een tweede snede net achter de 3e kies, maar dorsaal van de snijtand zonder de tand te beschadigen. Dit verwijdert het bot dat de processus coronoides omvat.
    3. Serieel gesneden vanaf de punt van de processus angularis naar de snijtand om de ventrale onderkaak geleidelijk stapsgewijs te verwijderen.
      OPMERKING: Het tandepitheel en de bijbehorende parodontale weefsels zitten vaak aan het bot vast en worden gemakkelijk afgescheurd als een groot deel van het ventrale bot in één keer wordt doorgesneden. Om het bot van het zachte weefsel van de snijtand te scheiden, kan men de scalpel (of een scherpe niet-gekartelde pincet) tussen de twee weefsels aan het apicale uiteinde van de snijtand steken en het instrument voorzichtig naar voren schuiven.
    4. Snijd het alveolaire bot met kiezen weg en eventuele resterende botten die nog aan de snijtand vastzitten.
    5. De hele snijtand is nu geïsoleerd. Breng de volledig ontlede snijtand over in een schaal met schone, warme snijmedia (stap 1.1).
  7. Herhaal stap 3.2-3.6 om indien nodig extra snijtanden te isoleren.
    OPMERKING: De maxillaire/bovenste snijtanden van de muis behouden ook volwassen stamcellen en kunnen worden gebruikt om tandregeneratie te bestuderen34. Tandheelkundig onderzoekers richten zich meestal op de onderste snijtanden omdat ze toegankelijker zijn en gemakkelijker kunnen worden ontleed dan de bovenste snijtanden. Verschillen tussen voorlopercellen van de onderkaak en de maxillaire snijtanden moeten nog worden bepaald.

4. Verwijdering van parodontale weefsels om de cervicale lus van de snijtand bloot te leggen

  1. Met de hele snijtand liggend op de linguale kant en terwijl u de tand op zijn plaats houdt met een gekartelde pincet, gebruikt u een paar #5 fijne pincetten om te beginnen met het instoppen van de parodontale weefsels die de apicale snijtand en het cervicale lusgebied bedekken.
  2. Trek voorzichtig het parodontale weefsel van de apicale knop, zodat de laterale zijde van de cervicale lus (of andere interessegebieden) zichtbaar wordt onder de scoop.
    OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat het tandepitheel niet wordt beschadigd of loskomt van het mesenchym. Als de snijtand fluorescentiesignalen heeft in het interessegebied en er een fluorescerende dissectiemicroscoop beschikbaar is, kunnen fluorescentiesignalen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen weefseltypes en dissecties te ondersteunen. Het is belangrijk om secties 2-4 efficiënt uit te voeren, zodat monsters snel kunnen worden overgebracht naar de kweekmedia en adequaat kunnen worden onderhouden door middel van explantatiekweek (zie hieronder).

5. Weefselinbedding voor explantatiekweek

  1. Voeg 500 μL warme, niet-gestolde kweekgel toe aan een putje in een plaat met 24 putjes en breng de ontlede hele snijtanden snel over naar het putje. Draai de plaat een paar keer rond om de snijtanden te spoelen.
  2. Voeg 400 μL warme, ongestolde kweekgel toe aan een kweekschaal en breng de gespoelde snijtanden over in de schaal.
    NOTITIE: We gebruiken een in de handel verkrijgbare kweekschaal die compatibel is met de perfusie-opstelling. Zie stap 6.4 voor alternatieve opties.
  3. Oriënteer de snijtand om het cervicale lusgebied (of andere interessante gebieden) in het midden van de schaal te plaatsen (Figuur 2A,B) en pas de kanteling van de apicale snijtand aan voor het gewenste beeldvlak.
    OPMERKING: Weefseloriëntatie moet snel worden gedaan voordat de gel volledig is.
  4. Nadat de gel is uitgehard, gebruikt u een fijne pincet om alle gel bovenop het interessegebied te verwijderen, zodat deze niet door de gel wordt bedekt.
  5. Voeg een voldoende hoeveelheid warme kweekmedia toe door deze langzaam tegen de rand van de schaal te pipetteren om het monster net te bedekken (~150 μL).
  6. Verplaats de explantatiecultuur naar een celkweekincubator van 37 °C om gedurende 1 uur weefselbezinking en aanpassing aan de kweektoestand mogelijk te maken.

6. Timelapse-microscopie van snijtandexplantaten

OPMERKING: In dit experiment gebruikten we een rechtopstaande microscoop die was uitgerust met een 25x waterdompelobjectief met een numerieke apertuur van 1. Over het algemeen is een waterdompellens met een hoge numerieke apertuur het meest geschikt voor beeldvorming van diep weefsel.

  1. Zet de microscoop en de twee-fotonlaser aan.
  2. Bevestig de kweekschaal aan de tafeladapter en monteer de perfusieadapterring erop (Figuur 2C).
  3. Sluit de stage-adapter aan op een temperatuurregelaar die is ingesteld om de cultuur op 37 °C te houden.
  4. Sluit de inlaat en de uitlaat van de adapterring aan op een microperfusiepomp en begin met de perfusie van het kweekmedium, met de perfusiesnelheid ingesteld op 20 op de pomp. Dit genereert een langzame stroom (~5 ml/uur) van het kweekmedium over de bovenkant van de monsters (Figuur 2C).
    OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor details over het systeem om het weefsel in een stabiel gecontroleerde omgeving te houden. Er kunnen ook andere systemen worden gebruikt. Er kan ook een combinatie worden gebruikt van een verwarmingsplaat van 37 °C en een zelfgemaakte perfusiekweekschaal (aanvullende figuur S1) met een inlaat en een uitlaat die is aangesloten op spuitpompen.
  5. Plaats een Atmospheric Control Barrier Ring (ACBR) bovenop de adapterring en laat het objectief door de ACBR zakken om net contact te maken met het kweekmedium (Figuur 2D).
  6. Stem de lasergolflengte af op 920 nm om zowel GFP- als rode fluorescentiesignalen (bijv. tdTomato) te visualiseren.
  7. Lokaliseer monsters via oculairs en vervolgens via de software van de microscoop.
  8. Stel Z-stacks, multi-position imaging en tijdsintervallen in met behulp van de software. Om dit protocol te volgen, gebruikt u een z-stapgrootte van 4 μm en een tijdsinterval van 5 minuten gedurende 14 uur.
    OPMERKING: We ontdekten dat een tijdsinterval van langer dan 5 minuten vaak onvoldoende is om vloeiende celbewegingen en -delingen vast te leggen.
  9. Start de timelapse-beeldvorming.
    NOTITIE: De monsterpositie kan tijdens het eerste uur verschuiven en verdere aanpassingen kunnen nodig zijn.
  10. Sla bestanden op voor downstream gegevensverwerking en analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het apicale gebied van de snijtand van de volwassen muis is ingekapseld in de onderkaak (figuur 1) en is daarom niet direct toegankelijk voor het visualiseren en live volgen van de voorlopercellen die zich in het groeigebied bevinden. Daarom hebben we een methode ontwikkeld om de hele snijtand uit het kaakbot te halen en te bewaren in een explantatiekweeksysteem voor timelapse-microscopie met twee fotonen (Figuur 2). Hier beschrijven we representatieve resultate...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Beeldvorming van levend weefsel is een belangrijke techniek die ons in staat stelt de dynamische processen en gedragingen van cellen te bestuderen wanneer ze in hun niche-omgeving worden gehouden41. Idealiter wordt live beeldvorming in vivo uitgevoerd met een hoge spatiotemporele resolutie. In vivo beeldvorming voor zoogdierorganen kan echter een uitdaging zijn vanwege de ontoegankelijkheid van weefsel, optische ondoorzichtigheid en de moeilijkheid om het dier of het orgaan gedur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

We erkennen het UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory en Leica Microsystems Center of Excellence bij het California NanoSystems Institute (RRID: SCR_022789) voor het leveren van twee-fotonmicroscopie. AS werd ondersteund door ISF 604-21 van de Israel Science Foundation. JH werd ondersteund door R03DE030205 en R01DE030471 van de NIH/NIDCR. AS en JH werden ook ondersteund door subsidie 2021007 van de United States-Israel Binational Science Foundation (BSF).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24 well, flat bottom tissue culture plateOlympus plastics25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objectiveLeica11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)Acros Organics352685000
D-(+)-Glucose bioxtra Sigma AldrichG7528
Delta T system Bioptechs0420-4Met temperatuurregeling, kweekschalen en perfusie-opstelling
Dissection microscope- LEICA S9ELeicaLED300 SLI
DMEM/F12Thermo Scientific11039047Basaal medium zonder fenolrood
Feather chirurgisch mes (#15)Feather72044-15
Fijne pincetF.S.T11252-23
Glutamax Thermo Scientific35050-061Glutamine-vervanger
Leica SP8-DIVE uitgerust met een 25X HC IRAPO motCORR water-dipping objectief Leican/a
Laagsmeltende agaroseNuSieve50080
Niet-essentiële aminozuren (100x)Thermo Scientific11140-050
Penicilline–streptomycineThermo Scientific1514012210.000 U/mL 
PetrischaalGen Clone32-107G90 mm 
RattenserumValley BiomedicalAS3061SCVerwerkt voor live beeldvorming
Veiligheidsmes #9VWR55411-050
ScalpelgreepF.S.T10003-12
SchaarF.S.T37133
Gekartelde pincetF.S.T11000-13
VedermesF.S.T91500-09

Referenties

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494(2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378(2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918(2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818(2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336(2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405(2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685(2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969(2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51(2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816(2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403(2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ex vivo beeldvormingmuisreissnijtandstamcelregulatieexplantaatkweekmultifotonmicroscopietracking van celdelingepitheliale progenitorcellentandregeneratietime-lapsemicroscopie
Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.