Een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de opstelling van een driedimensionaal (3D) ex vivo model van de interactie tussen kankercellen en omtentum. Het model biedt een platform voor het ophelderen van pro-tumormechanismen binnen de vetniche en voor het testen van nieuwe therapieën.

Samenvatting

Eierstokkanker is de dodelijkste gynaecologische maligniteit. Het omentum speelt een sleutelrol bij het bieden van een ondersteunende micro-omgeving voor uitgezaaide eierstokkankercellen, evenals immuunmodulerende signalen die tumortolerantie mogelijk maken. We hebben echter beperkte modellen die de interactie tussen eierstokkankercellen en vetrijke weefsels nauw nabootsen. Om meer inzicht te krijgen in de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee het omentum een pro-tumorale micro-omgeving biedt, hebben we een uniek 3D ex vivo-model ontwikkeld van de interactie tussen kankercellen en omentum. Met behulp van menselijk omentum zijn we in staat om eierstokkankercellen te kweken in deze vetrijke micro-omgeving en de factoren te volgen die verantwoordelijk zijn voor tumorgroei en immuunregulatie. Naast het bieden van een platform voor de studie van deze vetrijke tumormicro-omgeving, biedt het model een uitstekend platform voor de ontwikkeling en evaluatie van nieuwe therapeutische benaderingen om uitgezaaide kankercellen in deze niche aan te pakken. Het voorgestelde model is eenvoudig te genereren, goedkoop en toepasbaar op translationele onderzoeken.

Inleiding

Eierstokkanker is wereldwijd de dodelijkste gynaecologische maligniteit¹. Het levenslange risico om deze kanker te ontwikkelen is ongeveer 1 op 70, met de mediane leeftijd van diagnose op 63-jarige leeftijd². Primaire ovariële maligniteiten worden histologisch geclassificeerd als epitheliaal of niet-epitheel. Epitheliale eierstokkankers (EOC) vertegenwoordigen meer dan 90% van de tumoren en het meest voorkomende subtype is hooggradig sereus carcinoom (HGSC), dat goed is voor ongeveer 70%-80% van de EOC's. Momenteel zijn er geen effectieve screeningsmethoden om ziekten vroegtijdig op te sporen. De meeste patiënten worden dus in een vergevorderd stadium gediagnosticeerd (d.w.z. Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] stadium III of IV) nadat de kanker zich door de peritoneale holte heeft verspreid².

Standaard eerstelijnsbehandeling is cytoreductieve chirurgie om alle zichtbare macroscopische ziekten te verwijderen, gevolgd door adjuvante chemotherapie op basis van platina om eventuele resterende microscopische ziekte te vernietigen. Hoewel er de afgelopen twee decennia veel vooruitgang is geboekt in de behandeling van eierstokkanker, zal ongeveer 70% van de patiënten met een gevorderde ziekte binnen 3 jaar^{na de behandeling} terugvallen. Gezien de over het algemeen slechte prognose van deze patiënten, zijn lopende en toekomstige translationele onderzoeksinspanningen in EOC gericht op het identificeren van biomarkers voor vroege detectie, het voorkomen van metastase, het verbeteren van huidige therapieën om resistentie te omzeilen en het ontwikkelen van nieuwe gepersonaliseerde kankerbehandelingen.

Gegeneraliseerde metastase in de peritoneale holte en de bijbehorende chemoresistentie zijn twee van de belangrijkste beperkingen voor de verbetering van de behandeling van patiënten met eierstokkanker ^4,5. Het omentum, een vette schortachtige structuur die vanuit de maag over de darmen naar beneden hangt, is een belangrijke plaats van uitzaaiingen van eierstokkanker ^6,7. Naast zijn functie als fysieke barrière, is aangetoond dat het omentum regeneratieve en angiogene capaciteiten heeft en immuunactiviteiten bezit, die samen de vascularisatie bevorderen, wondgenezing versnellen^{en infectie beperken}. Het bevat een hoge concentratie stamcellen die kunnen differentiëren in verschillende celtypen en kunnen helpen bij het herstellen van beschadigde weefsels. Het omentum kan ontstoken raken als reactie op letsel of infectie, wat de migratie van immuuncellen naar de plaats van verwonding activeert⁹. Deze immuuncellen geven groeifactoren en andere moleculen af die helpen om het herstel en de regeneratie van beschadigd weefsel te bevorderen. Immuuncellen, zoals macrofagen, lymfocyten en plasmacellen, gelokaliseerd in het omentum zijn structuren die bekend staan als "melkachtige vlekken", die verantwoordelijk zijn voor het detecteren en aanvallen van ziekteverwekkers en het reguleren van peritoneale immuniteit. Van het omentum is ook aangetoond dat het een rol speelt bij het induceren van immuuntolerantie¹⁰, het vermogen van het immuunsysteem om zelfantigenen te tolereren en gezonde weefsels niet aan te vallen. Dezelfde immuungerelateerde activiteiten zijn echter ook betrokken bij pathologische reacties, zoals de groei van omentale tumoren, metastase en ontsnapping aan immuunsurveillance ^9,11. Eerdere studies van ons laboratorium en anderen hebben een unieke en actieve rol van de vetmicro-omgeving aangetoond bij de remming van antitumorale immuunresponsen en bij het verwerven van chemoresistentie^12,13,14. Helaas hebben we beperkte informatie over de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee het omentum een pro-tumorale micro-omgeving biedt.

Om de interacties tussen kankercellen en het omentum beter te begrijpen, werd een 3D-kweeksysteem ontwikkeld dat bestaat uit menselijke eierstokkankercellen en van patiënten afgeleide omentum-explantaten. Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een nieuw ex vivo model van peritoneale carcinomatose. Dit model bootst de natuurlijke progressie van tumorigenese van eierstokkanker na in dit vetrijke weefsel. Het voorgestelde model is eenvoudig te genereren, goedkoop en mogelijk toepasbaar op translationeel onderzoek in onderzoek naar eierstokkanker.

Protocol

Het volgende onderzoeksprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door de Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Voorafgaand aan de operatie werd van alle patiënten geïnformeerde toestemming verkregen. Figuur 1 illustreert de drie algemene stappen in dit protocol.

1. Bereiding van menselijk omentumweefsel

1. Bereid omentumkweekmedia (DMEM/F12 + 10% foetaal runderserum + 1% penicilline-streptomycine) en bewaar bij 4 °C. Aliquot 30-40 ml van dit medium in een steriele conische buis van 50 ml of een container voor chirurgische monsters.
2. Verkrijg chirurgische monsters van omentale biopsie of omentectomiechirurgie. Dompel het steriele monster onmiddellijk na verwijdering in de operatiekamer onder in omentumkweekmedia. Als de workflow dit niet toelaat, plaats het monster dan zo snel mogelijk in omentum kweekmedia. Breng het monster over door het op ijs te leggen en bewaar het bij 4 °C tot het wordt verwerkt.
   OPMERKING: De grootte van het verwijderde omentummonster bepaalt de hoeveelheid werkbaar weefsel.
3. Verwerk het omentummonster binnen 1-2 uur na afname met behulp van een laminaire stroomkap. Zorg ervoor dat alle materialen en gereedschappen steriel of gesteriliseerd zijn.
4. Haal het omentum uit de opvangbak en doe het in een kweekschaal van 100 mm. Dompel het monster onder in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) en was het monster voorzichtig om eventuele bloedstolsels of vuil te verwijderen.
5. Snijd het weefsel in stukjes (0,5 cm x 0,5 cm of 100-200 mg; Figuur 2A) met behulp van een kleine chirurgische schaar of een scalpel van 10-15 mm. Gebruik een kleine chirurgische pincet om het weefsel te manipuleren en te voorkomen dat het omentum wordt verpletterd. Als een energieapparaat is gebruikt om het omentum-monster operatief te verwijderen, vermijd dan het gebruik van het vervormde weefsel aan de verzegelde rand.
6. Plaats elk stuk gesneden omentum in afzonderlijke putjes van een kweekplaat met 24 putjes en vul de putjes met 500 μL omentum-kweekmedia of tot een volume dat voldoende is om het omentum te bedekken zonder het omentumstuk boven de putbodem te laten zweven (Figuur 2B).
7. Bewaar stukjes omentum in verse kweekmedia bij 4 °C tot ze klaar zijn voor injectie.

2. Bereiding van eierstokkankercellen

1. Kweek menselijke eierstokkankercellen in een kweekkolf van 75^cm2 bij 37 °C en 5% CO₂ tot ten minste 75% confluentie op de dag van de afname van het ummentum.
   OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van mCherry-positieve OCSC1-F2 menselijke eierstokkankercellen die eerder zijn beschreven 15,16,17,18. Het kan worden aangepast aan elke kankercellijn die is gelabeld met een fluorescentiesignaal.
2. Bereid de cellen voor in een laminaire stroomkap onmiddellijk na het verzamelen van het omentummonster. Zorg ervoor dat alle materialen en gereedschappen steriel of gesteriliseerd zijn.
3. Voeg 10 ml steriele 1x PBS toe aan de kweekkolf en was de cellen door de kolf zachtjes te schudden. Verwijder de 1x PBS en voeg vervolgens 3 ml 0,05% trypsine-EDTA toe.
4. Schud de kweekkolf voorzichtig om alle cellen te bedekken en plaats de kolf vervolgens niet langer dan 5 minuten in een incubator (37 °C en 5% CO₂). Tik op de kweekkolf om de cellen volledig los te maken en neutraliseer vervolgens trypsine door 3 ml omentum-kweekmedia toe te voegen.
5. Meng de celsuspensie door te pipetteren en breng de suspensie vervolgens over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 1.200 x g bij 24 °C. Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet in 6 ml verse omentum kweekmedia.
6. Tel de cellen met behulp van een hemacytometer. Verdun de celsuspensie tot ten minste 100.000 cellen per 100-200 μL suspensie. Dit is het volume van de injectie in elk gesneden stuk omentum.
7. Breng een passend aantal cellen over in een nieuwe kweekkolf om de celpassage voort te zetten.

3. Injectie van eierstokkankercellen

1. Gebruik een spuit van 1 ml om de celsuspensie op te zuigen en bevestig vervolgens een naald van 26 G. Trek de celsuspensie niet op met de naald, omdat dit de cellen kan fragmenteren.
2. Gebruik een kleine chirurgische pincet om een stuk gesneden omentum op te pakken. Breng het omentum over in een aparte steriele schaal om de injectie te vergemakkelijken. Prik voorzichtig met de punt van de naald in het omentum en injecteer een klein volume celsuspensie in het weefsel (figuur 2C).
3. Herhaal de injectie over verschillende delen van het omentum tot een totaal volume van ten minste 100 μL of 100.000 cellen. Merk op dat een groot deel van de celsuspensie zich rond het monster lijkt te verzamelen. Als er bezorgdheid bestaat over de kwaliteit van de injectie, herhaal dan de injectie of injecteer een groter volume celsuspensie in het monster.
4. Plaats de geïnjecteerde omentummonsters terug in elk putje van een kweekplaat met 24 putjes. Houd er rekening mee dat het volume van de omentum-kweekmedia op een niveau is dat het omentum bedekt zonder het te laten drijven. Behandel de plaat voorzichtig en plaats deze in een incubator (37 °C en 5% CO₂).
5. OPTIONEEL: Gebruik Matrigel (basaalmembraanmatrix) om ommentumweefsel in een vaste matrix op te schorten om gemakkelijker te kunnen injecteren en meer geconcentreerde celsuspensie af te geven.
   1. Ontdooi de basaalmembraanmatrix bij 4 °C en meng direct voor gebruik in een verhouding van 1:1 met de omentumcultuurmedia. Bewaar het basaalmembraanmatrixmengsel tot injectie op ijs of bij 4 °C. Vul lege putjes met voldoende basaalmembraanmatrixmengsel om een gesneden stuk omentum onder te dompelen.
   2. Plaats de monsters in het basaalmembraanmatrixmengsel en plaats vervolgens de kweekplaat met 24 putjes gedurende 20 minuten in een incubator (37 °C en 5% CO₂). Zodra het mengsel gestold is, gaat u verder met injecteren zoals hierboven beschreven.
6. Bevestig een succesvolle injectie met behulp van fluorescerende beeldvorming. Zorg ervoor dat een streep fluorescerend signaal wordt gevisualiseerd op de injectieplaatsen (Figuur 2D). Merk op dat het werkelijke aantal cellen dat na injectie aan het omentum is gehecht, onvoorspelbaar is.

4. Co-cultuur van menselijke omentum- en eierstokkankercellen

1. Vervang het medium elke 48-72 uur door 500-2000 μL verse omentum-kweekmedia toe te voegen. Pipetteer geen media rechtstreeks op het omentumweefsel, omdat dit kankercellen kan verdringen. Houd er rekening mee dat als de mediakleur geel wordt, u de media wijzigt.
   OPMERKING: De frequentie van mediawisseling hangt af van het volume van de gebruikte media en het traject van de groei van kankercellen. Zodra de kankercellen het omentum hebben gezaaid, is het niet meer belangrijk of het stuk omentum al dan niet drijft.
2. OPTIONEEL: Als een basaalmembraanmatrix werd gebruikt, zou de matrix doorgaans worden opgelost tegen de tijd van de eerste mediawissel.
3. Bewaak de groei van eierstokkankertumoren met behulp van fluorescerende beeldvorming. De frequentie van beeldvorming is ter beoordeling van de onderzoeker. Anticipeer op tekenen van kleine tumoren met ongeveer 14 dagen (Figuur 3A-C). De resultaten kunnen variëren afhankelijk van de kwaliteit van de injectie.
4. Beëindig het experiment op basis van het eindpunt van het experiment.
   OPMERKING: Tumorgroei en integriteit van omentumweefsel zijn waargenomen in de afgelopen 50 dagen.

Resultaten

Succesvolle vestiging van eierstokkankercellen in omstreeks dag 14 was duidelijk (Figuur 3A-C). Per verzameld monster werden ten minste 24 replicaten geprepareerd en geïnjecteerd om verdere experimenten mogelijk te maken. De tumorgroei werd gevolgd door fluorescerende beelden te maken (Figuur 3D,E). Beelden moesten zorgvuldig worden geïnterpreteerd, aangezien er ook een monolaag kankercellen groeide op de bodem ...

Discussie

Met behulp van dit protocol werd een preklinisch model van peritoneale carcinomatose voor eierstokkanker ontwikkeld met behulp van een combinatie van basale in vitro en ex vivo technieken. Een progressieve tumorgroei werd waargenomen gedurende 50 dagen co-cultuur na het zaaien van omentum-monsters met mCherry+ OCSC1-F2 menselijke eierstokkankercellen. Deze methode is ontwikkeld en geoptimaliseerd in verschillende experimentele onderzoeken met verschillende omentum-monsters. Succesvolle tumorgroei hing a...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe met 26 G afneembare naald	BD	329652
10 mL Serologische pipetten	CELLTREAT	229010B
100 mm weefselkweekschaal	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifugeerbuis	CELLTREAT	229411
24 Welcelkweekplaat	Costar	3524
50 mL Centrifugeerbuis	CELLTREAT	229421
75 cm2 weefselkweekkolf	CELLTREAT	229341
Corning Celteller	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L natriumbicarbonaat	Gibco	11320033
Fetaal bovien serum, gekwalificeerd	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Nr. 10 roestvrijstalen wegwerp scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicilline Streptomycine	Gibco	15140122
Fosfaatgebufferd zout, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscoop	Echo